)，混勾，插入冰中，避光染色 Ιδη?η ;
[0055] (9)混匀后，准备上机检测。
[0056] 3、流式细胞仪分析
[0057] 经DAPI染色的样品通过流式细胞仪，用355nm激光激发，由FL6通道检测出荧光 强度。使用随机软件Summit 5. 2获取数据，每个样品测定大于10000个细胞核（颗粒）。 绘制显示直方图（其横坐标为DNA相对含量，反映荧光曲线的面积，纵坐标为细胞核出现频 率，即相对细胞核数），并计算变异系数CV。
[0058] 4、结果
[0059] (1)以美国蔓越桔新鲜嫩叶作为实验材料，比较不同的细胞核分离缓冲液的效果， 结果如图1和图2所示。图1为对照组细胞核分离缓冲液制备的样品获得的FCM荧光直方 图，图2为上述1号、2号和3号细胞核分离缓冲液制备的样品经FCM获得的直方图。
[0060] 从图1可见，使用对照组细胞核分离缓冲液制备的样品在直方图中产生了微小的 的二倍体"峰"，但在峰的左侧出现了大量背景碎片，推测这可能是机械破碎叶片时对细胞 损伤太大，且蓝莓革质化比较严重，又含有大量的多酚类物质，这会使样品中含有较多的细 胞碎片，且易使细胞黏连，致使峰变矮小、变宽。通常认为CV值小于8%才是可信的结果，而 现在使用对照组方法获得的CV值已达14. 62%，远不能满足要求。
[0061] 从图2可见，使用本发明1号、2号和3号细胞核分离缓冲液制备的细胞核悬液，在 直方图中可产生明显的二倍体状态和四倍体状态的"峰"，峰宽变窄，主峰变高。虽然主峰左 侧仍然存在较多的背景碎片，但是相对于对照组的直方图（图1)来说，干扰峰带已明显减 少，CV值也得到了一定程度的改善，基本满足需求。其中使用1号细胞核分离缓冲液制备 的样品获得的CV值较小，且碎片干扰也最小，细胞悬液浓度高，分析效果最好。实验结果说 明多种类的多酚抑制剂及高浓度的PVP能够有效的减少细胞粘连，减少机械破碎时造成的 细胞损伤，能够更好的分离细胞核。同时，检测结果表明，使用FCM测定蓝莓倍性时DAPI可 以取代PI用来染色。通常DAPI染色5-15min就可以染色完全，且不需要再使用酶去除RNA 干扰，这极大的简化了 FCM测定流程。另外，本发明比较了离心对细胞核提取的影响，发现 5000rpm的离心不会导致细胞破裂，有利于降低碎片杂峰强度。值得注意的是，实验中发现 染色后材料在4°C冰箱放置一晚后，再次上机检测，检测结果显示虽然其碎片峰稍增，但主 峰依然明显。这表明上述提取缓冲液及DAPI染色法具有较好的稳定性，使得大批量、长时 间跨度测定样本成为可能。
[0062] 4号、5号、6号和7号细胞核分离缓冲液制备的样品检测结果与1号、2号和3号 无显著差异。
[0063] (2)使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液，以表1中所示的各蓝莓品种叶片作 为实验材料，测定多种蓝莓材料的倍性，结果如图3-图11所示。
[0064] 图3中A为对照兔眼蓝莓'灿烂'的荧光峰图，图3中a为其log转换后的荧光峰 图。作为对照材料的兔眼蓝莓'灿烂'，采自温室'灿烂'新生嫩叶，该品种是确定的6倍体， 可用做对照。兔眼蓝莓'灿烂'经FCM测定的荧光强度均值为728. 63, CV值为3. 88%。蓝 莓是进化相对保守的物种，其基因组大小随染色体的增加而增加，因此可以认为倍性相同 的蓝莓品种，其基因组大小相近。故可以以'灿烂'为对照，通过FCM推测其它蓝莓品种的 倍性。
[0065] 图4中为实验材料'蓝丰'（北高丛蓝莓）的荧光峰图。'蓝丰'叶片大小中等，无 明显革质化。由于'蓝丰'经FCM测定的荧光强度均值为420. 58, CV值为6. 17% (CV小于 8%)，故推测'蓝丰'是4倍体，这与文献中通过核型分析得到的结果一致。且在育种中北 高丛蓝莓是异源四倍体杂种，这也从一定程度上支持了本研究结果。
[0066] 图5中C为实验材料'斯巴露'（南高丛蓝莓）的荧光峰图，图5中c为其log转 换后的荧光峰图。'斯巴露'叶片大小中等，革质化较弱。'斯巴露'经FCM测定的荧光强度 均值为418. 84,CV值为6. 97%，推测为四倍体。分析依据同上。在育种中南高丛蓝莓是由 新泽西高丛蓝莓产生的同源四倍体，这也从一定程度上支持了本研究结果。
[0067] 图6中D为实验材料'黑珍珠'（半高丛蓝莓）的荧光峰图，图6中d为其log转 换后的荧光峰图。'黑珍珠'叶片革质化严重，相对老化比较严重。'黑珍珠'经FCM测定的 荧光强度均值为438. 33, CV值为7. 73%，推测为四倍体。分析依据同上。据文献报道，最 初培育半高丛蓝莓时选用的亲本为4倍体，这也从一定程度上支持了本研究结果。
[0068] 图7中E为实验材料美国蔓越桔的荧光峰图，图7中e为其log转换后的荧光峰 图。美国蔓越桔叶片较小，革质化较轻。美国蔓越桔经FCM测定的荧光强度均值为308. 56， CV值为6.08%，推测为二倍体。分析依据同上。文献中美国蔓越桔也称大果蔓越桔，据记 载为2倍体，这也从一定程度上支持了本研究结果。
[0069] 图8中F为实验材料野生蔓越桔（采自长白山）的荧光峰图，图8中f为其log转 换后的荧光峰图。野生蔓越桔（采自长白山）叶片较小，革质化较弱。野生蔓越桔（采自 长白山）经FCM测定的荧光强度均值为656. 17, CV值为4. 03%，推测为六倍体。分析依据 同上。野生蔓越桔有2、4、6倍体的天然分布，学者在丹麦、芬兰都发现了 6倍体蔓越桔，郝 瑞等在我国长白山也发现了 6倍体蔓越桔的分布，这也从一定程度上支持了本研究结果。
[0070] 图9中G为实验材料野生笃斯越桔（采自长白山）的荧光峰图，图9中g为其log 转换后的荧光峰图。野生笃斯越桔（采自长白山）的叶片较大，较为老化，已呈革质化。笃 斯越桔（采自长白山）经FCM测定的荧光强度均值为513. 89,CV值为5. 13%，推测为四倍 体。分析依据同上。文献记载长白山有笃斯越桔2、4倍体的天然分布区，但通常长白山区 海拔小于1700m处分布的笃斯越桔都是4倍体种，高海拔区多是2倍体种。本实验材料采 自低海拔区的漫江，所以应为4倍体。
[0071] 图10中H为实验材料野生笃斯越桔（采自大兴安岭）的荧光峰图，图10中h为 其log转换后的荧光峰图。该野生笃斯越桔（采自大兴安岭）叶片材料来源于已老化的 试管苗。野生笃斯越桔（采自大兴安岭）经FCM测定的荧光强度均值为537. 06, CV值为 6. 19%，推测为四倍体。分析依据同上。大兴安岭有2、4、6倍体笃斯越桔的天然分布，研究 认为4倍体笃斯越桔为原种，其它两类为变种。本研究材料FCM测定的荧光均值与长白山 区4倍体笃斯越桔相近，故推测也是4倍体。
[0072] 图11中I为实验材料野生红豆越桔（采自大兴安岭）的荧光峰图，图11中i为 其log转换后的荧光峰图。该野生红豆越桔（采自大兴安岭）叶片材料来源于温室新生嫩 叶，稍革质。野生红豆越桔（采自大兴安岭）经FCM测定的荧光强度均值为417. 76, CV值 为7. 35%，推测为四倍体。分析依据同上。红豆越桔也有2、4倍体的天然分布，其中4倍体 种为原种，2倍体种为变种；且2倍体种为小果越桔，其植株矮小（2-10cm)，小叶；本次研究 使用的红豆越桔材料从形态学上也更符合4倍体原种的特征。
[0073] 结果表明基于本发明方法测定的蓝莓倍性与其它研究手段获得的结果一致，具有 极高的可靠性。同时，由于本发明方法是基于流式细胞仪的测定方法，所以具有高效性，可 快速的进行大批量的验证工作。且本方法以DAPI替代PI作为染色剂，所以该方法无需进 行RNA酶处理，大大简化了实验流程，也减少了实验操作对细胞的破坏，使得实验结果中碎 片减少，可获得较低的CV值。此外，DAPI比PI的稳定性更好，染色后的样品在低温过夜后 再次检测，依然可以获得较好的结果，这也使得批量测定成为可能。值得注意的是，本研究 使用的材料都是相对比较老化、革质化严重、多酚类物质含量较高的叶片材料，常规细胞学 方法基本无法用于此类材料的倍性分析，所以，本方法的建立对于此类棘手材料的倍性分 析具有重要意义。
【主权项】
1. 一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法，包括如下步骤： (1) 配制包含如下组分的细胞核分离缓冲液：200mMTris、4mMMgCl2 · 6H20、体积百分 比为 0· 5% -2%的TritonΧ-100 ;50πιΜβ-巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM 二硫苏糖醇； (2) 向每克蓝莓叶片样品中加入4-10ml所述步骤（1)配制的细胞核分离缓冲液； (3) 将所述步骤（2)中的蓝莓叶片切碎后，过滤，收集滤液； (4) 将所述步骤（3)的滤液离心，弃上清，加入所述步骤（1)配制的细胞核分离缓冲液 重悬沉淀物； (5) 加入4, 6-联脒-2-苯基吲哚，染色； (6) 用流式细胞仪进行检测。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中所述细胞核分离缓 冲液包含如下组分：200mMTris、4mMMgCl2 · 6H20、体积百分比为2%的TritonX-100 ; 50mMf3-巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中所述细胞核分离缓 冲液包含如下组分：200mMTris、4mMMgCl2 · 6H20、体积百分比为2%的TritonX-100 ; 50mMf3-巯基乙醇；5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中所述细胞核分 离缓冲液的pH值为7. 5。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述步骤（4)重悬沉 淀物之后进行静置裂解的步骤。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中所述加入细胞核分离缓 冲液为冰浴的细胞核分离缓冲液。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中所述切碎是在冰上进行； 所述过滤是用300目尼龙膜过滤。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4)中所述离心是用5000rpm转 速于4°C离心l-5min。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5)中所述4, 6-联脒-2-苯基 吲哚的浓度为lmg/ml，加入量为5μ1 ;所述染色为冰上避光染色15min。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述流式细胞仪需具备 355nm激发波长。
【专利摘要】本发明公开了一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法。本发明所提供的用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法，用改良MgCl2·Tris细胞核分离缓冲液获得细胞悬液，用DAPI染料快速染色，并通过流式细胞仪的弧光灯激发DAPI，检测不同蓝莓样品的荧光累积情况，并与同类型已知倍性的蓝莓品种的荧光峰值进行比较，可简便、快速、批量鉴定蓝莓倍性。
【IPC分类】G01N15/14
【公开号】CN105259097
【申请号】CN201510712049
【发明人】苏上, 赵丽娜, 王亮生, 王贺新, 徐国辉
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月28日