磷酸锌纳米基底及其制备方法和在循环肿瘤细胞捕获与释放中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学材料、纳米材料技术领域，具体涉及一种透明、可牺牲、分形 结构磷酸锌纳米基底及其应用。
【背景技术】
[0002] 循环肿瘤细胞，简称CTCs。是指从原发性肿瘤或者转移部位脱落、侵袭并进入血液 循环系统的癌细胞。研究发现血液中CTC数目多少与癌症患者病情发展息息相关，所以监 测血液中CTC数目变化对于评估癌症转移和疗效十分重要。另外，CTC分子水平分析可以 提供许多临床相关的重要信息，有效指导临床治疗，为实现个体化治疗奠定坚实基础。
[0003] 近年来不同形状结构的纳米材料，诸如纳米颗粒、纳米阵列等无机纳米材料以 其独特的结构效应被应用于细胞行为及其界面设计等研究中。2012年，Zhang等利用二 氧化钛纳米纤维经过功能化处理后做为基底，实现了循环肿瘤细胞的富集和检测（Adv. Mater.，2012, 24, 2756-2760)。2013年，Park等利用热化学气相沉积生长法制备出表面被 金纳米簇均勾包覆的无机娃纳米线阵列基底。该基底经过表面抗体修饰后对祀向肿瘤细胞 有高的捕获效率（Nano Lett.，2012, 12, 1638-1642)。然而，制备这些纳米结构往往需要昂 贵的仪器设备、复杂的技术和娴熟而又精湛的操作；而且制备的纳米结构基底透光性较差， 不利于观察、成像和操作。另外，从纳米结构基底上温和地释放肿瘤细胞，利于CTC的再培 养、分子水平分析、耐药性研究等，仍然亟需解决。因此发展易制备、透明纳米结构基底高效 捕获、温和释放肿瘤细胞十分必要且重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于提供一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底，其特征 在于，所述磷酸锌纳米基底的制备依次包括以下步骤： (1) 制备氧化锌纳米线基底； (2) 形成分形结构磷酸锌纳米基底：以生长氧化锌纳米线的基底为起始原料，将其置于 25~37°C的含镁离子的磷酸盐溶液中孵育12~72 h即可形成； 优选的步骤（1)所述的基底包括透明的玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷（PDMS)和不透光 的硅片； 优选的步骤（2)所述的磷酸盐溶液是指含磷酸酸根的溶液； 本发明的另一目的在于提供一种利用磷酸锌纳米基底高效捕获、温和释放循环肿瘤细 胞的方法，其特征在于，包括如下步骤： (Il在磷酸锌纳米基底表面修饰羧基：将磷酸锌纳米基底置于等离子清洗机腔室，用等 离子体清洗其表面，提高基底表面的润湿性能，增强分子黏附，然后，再将等离子体处理过 表面的基底和硅烷三醇丙酸钠的磷酸缓冲液孵育3 h，洗去多余的溶剂，即得到表面修饰羧 基的磷酸锌基底； 戀制备生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底：将羧基化基底置于含1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的10 mM硼酸缓冲液中活化30 min，通过羧基和氨基反应， 与50~200 μ g生物分子a在冰盒上孵育4 h，可得到生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底， 所述的生物分子a可以为适配体、链霉亲和素、抗体及其他含氨基分子； (??制备能特异性识别祀细胞的磷酸锌纳米基底：生物分子a修饰的基底和1~5 μ g 生物分子c孵育0. 5 h，所述生物分子c被特异性结合生物分子a的生物分子b标记，洗去 多余的生物分子c，所述的生物分子c可以为抗体、适配体及其他被生物分子b标记的分子， 且能特异性识别靶细胞； 生物分子功能化修饰的基底和细胞悬浮液或全血孵育〇. 5~I h，洗去未捕获的细 胞，染色，置于荧光显微镜下观察、成像、计数； 議将已捕获细胞的基底置于0.1~2%柠檬酸钠的磷酸缓冲液中孵育5 min~I h，溶 解磷酸锌基底，释放细胞。
[0005] 优选的步骤中的生物分子a为链霉亲和素，生物分子b为生物素。
[0006] 优选的步骤中的生物分子c为上皮细胞黏附分子抗体（anti-EpCAM)。
[0007] 本发明的原理：氧化锌纳米线作为一种半导体纳米材料，易于制备，且可以掺杂二 价金属元素如镁，引起结构发生变化。另外，氧化锌对磷酸根十分敏感，生理条件下即可与 磷酸根反应生成磷酸锌。同时，锌离子络合剂如柠檬酸钠、草酸、乙二胺四乙酸等能够在室 温下有效络合锌离子，快速溶解纳米结构基底。而且，将氧化锌纳米线生长于透明的基底如 玻璃、聚二甲基硅氧烷（PDMS)等，该基底具有良好的透光性。
[0008] 本发明的优点和有益效果在于： 1.本发明提供的透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底，制备方法简单、条件温和、廉 价、结构重现性好。
[0009] 2.本发明提供的透明磷酸锌纳米基底有利于观察、成像和操作。
[0010] 3.本发明提供的分形结构磷酸锌纳米基底模仿癌细胞表面基质较正常细胞明显 的分形行为，利于癌细胞黏附、捕获，而且协同特异性识别靶细胞的生物分子能够有效提高 肿瘤细胞的捕获效率。
[0011] 4.本发明提供的可牺牲磷酸锌纳米基底，可采用生物相容性好的锌离子络合剂如 柠檬酸钠(血液抗凝剂)，溶解磷酸锌基底，温和释放肿瘤细胞，便于CTC再培养、分子水平分 析和耐药性研究。
【附图说明】
[0012] 图1是实施例1制备的氧化锌纳米线基底（a)和分形结构磷酸锌纳米基底（b)的 扫描电镜图 图（a)中的插图是制备的氧化锌纳米线高度的扫描电镜图，图（b)中的插图为虚线框 处分形结构的放大图； 图2是实施例1制备的氧化锌纳米线和分形结构磷酸锌纳米基底的X射线衍射图谱 (a)和（b); 图3是实施例1制备的分形结构磷酸锌纳米基底的透光性表征图 将该基底置于选定图片(武汉大学校徽）上面的照片； 图4是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底捕获和释放MCF-7细胞的 明场荧光显微镜照片； 图5是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底用柠檬酸钠处理后，释放的 MCF-7细胞活性结果图； 图（a)是释放下来细胞的明场显微镜照片，图（b)是将释放下来的细胞培养48 h后的 明场荧光显微镜照片； 图6是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底从I mL癌症病人全血中检 测出的CTC个数； 图7是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底（HZnPNS)与CellSearch 从不同的癌症转移患者全血中检测出的CTC个数 两种方法平行实施，CellSearch局限于检测7. 5mL乳腺癌、结肠癌和前列腺癌转移患 者的血液样品，而制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底检测的血液量为lmL。
【具体实施方式】
[0013] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0014] 【实施例1】制备透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底 1、制备氧化锌纳米线基底：首先，干净的玻璃基底表面用等离子体处理1~3 min,而 后置于勾胶机，2500 rpm均