勾旋涂10 mM醋酸锌的乙醇溶液，最后，放于300°C加热台加热 3 h，产生一层氧化锌种子。第二步，将铺有氧化锌种子的玻璃基底倒置于50 mM硝酸锌和 六亚甲基四胺水溶液，90°C生长3 h，产生氧化锌纳米线基底。
[0015] 2、形成分形结构磷酸锌纳米基底：氧化锌纳米线基底在含10 mM镁离子的生理等 渗磷酸缓冲液中，37°C孵育12~72 h，直到玻璃基底表面铺满分形纳米结构。氧化锌纳米 线基底（a)和分形结构磷酸锌基底（b)的扫描电镜图图1和X射线衍射图谱图2。所需达 到的制备要求：分形结构透光性好（图3)，能够和癌细胞表面纳米结构拓扑作用，有利于癌 细胞黏附。
[0016] 【实施例2】上皮细胞黏附分子抗体（anti-EpCAM)修饰的磷酸锌纳米基底捕获、释 放肿瘤细胞 1、 将磷酸锌基底(面积：1 cm X 2 cm)放入等离子清洗机的腔室内，用等离子体清洗 其表面1-5 min，提高基底表面的润湿性能，增强分子黏附。然后，再将等离子清洗机清洗 后的基底置于含有硅烷三醇丙酸钠（25%的水溶液，40 μ L)的磷酸盐缓冲液（2 mL)中， 然后，羧基修饰的基底置于含25 mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的 10 mM硼酸缓冲液中活化30 min，通过羧基和氨基反应，与400 μ L (100 μ g)链霉亲 和素冰盒上孵育4 h。最后，将链霉亲和素修饰的基底和200 μ L (5 μ g)生物素标记的 anti-EpCAM 孵育 30 min,洗去多余的 anti-EpCAM. 2、 将anti-EpCAM功能化的基底放入四孔腔室载玻片中，加入500 yL (IO4个SYT0013 染色的MCF-7乳腺癌细胞)细胞悬浮液，置于细胞培养箱中孵育45 min，90 rpm摇2 min， 洗去未捕获的细胞，重复两次。MCF-7细胞的捕获结果如图4所示。
[0017] 3、肿瘤细胞释放和再培养 捕获细胞后，将基底置于含1%柠檬酸钠的生理等渗磷酸缓冲液（pH 6.5) 90 rpm摇20 min，除去柠檬酸钠溶液，加入生理等渗的磷酸缓冲液，洗脱捕获的细胞，90 rpm摇2 min,重 复两次，结果见图3。然后将释放的细胞收集，置于培养基中培养48 h，细胞伸展的很好，具 有很高的生物活力性（图5) 4、癌症病人血液中CTC捕获 取ImL癌症病人血液于生物分子anti-EpCAM修饰的磷酸锌基底，60 rpm孵育45 min,轻轻洗去未捕获细胞，重复至少三次，而后依次用4%多聚甲醛固定细胞20 min, 0.1% trionX-100 处理 20 min，5% BSA 和 0.2% Tween-20 孵育 20 min，400 yL 三色染料（40 yL，250 yg/mL DAPI 核染料、10 yL FITC 标记的 anti-cytokeratin 19、80yL PE 标记的 anti-⑶45)孵育30 min。最后，洗去多余染料，置于焚光显微镜下观察、成像、计数。
[0018] 结果显示，我们制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底（HZnPNS)能够从ImL不 同癌症患者全血样品检测0-75个CTC (图6)，且与检测CTC的金标准CellSearch (适用 于7. 5 mL癌症转移患者全血样品）比较，我们的检测方法测出的CTC数目较多、较灵敏，结 果见图7。
【主权项】
1. 一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底，其特征在于，所述磷酸锌纳米基底的 制备依次包括以下步骤： (1) 制备氧化锌纳米线基底； (2) 形成分形结构磷酸锌纳米基底：以生长氧化锌纳米线的基底为起始原料，将其置于 25~37°C的含镁离子的磷酸盐溶液中孵育12~72h即可形成。2. 根据权利要求1所述的磷酸锌纳米基底，其特征在于，步骤（1)所述的基底包括透明 的玻璃、石英或聚二甲基硅氧烷（PDMS)和不透光的硅片。3. 根据权利要求1所述的磷酸锌纳米基底，其特征在于，步骤（2)所述的磷酸盐溶液是 指含磷酸酸根的溶液。4. 一种利用权利要求1所述的磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞的方法，其特 征在于，包括如下步骤： Φ在磷酸锌纳米基底表面修饰羧基：首先，将磷酸锌纳米基底置于等离子清洗机腔室 内，用等离子体清洗其表面，然后，再将等离子体处理过表面的基底和硅烷三醇丙酸钠的 磷酸缓冲液孵育3h，洗去多余的溶剂，即得到表面修饰羧基的磷酸锌基底； ②制备生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底：将羧基化基底置于含1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的10mM硼酸缓冲液中活化30min，通过羧基和氨基反应， 与50~200μg生物分子a在冰盒上孵育4h，可得到生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底， 所述的生物分子a可以为适配体、链霉亲和素、抗体及其他含氨基分子；3·制备能特异性识别靶细胞的磷酸锌纳米基底：生物分子a修饰的基底和1~5μg生物分子c孵育0. 5h，所述生物分子c被特异性结合生物分子a的生物分子b标记，洗去 多余的生物分子c，所述的生物分子c可以为抗体、适配体及其他被生物分子b标记的分子， 且能特异性识别靶细胞； 3：·生物分子功能化修饰的磷酸锌纳米基底和细胞悬浮液或全血孵育〇. 5~1h，洗去 未捕获的细胞，染色，置于荧光显微镜下观察、成像、计数； S将已捕获细胞的基底置于〇. 1~2%柠檬酸钠的磷酸缓冲液中孵育5min~1h，溶 解磷酸锌基底，释放细胞。5. 根据权利要求4所述的磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞的方法，其特征在 于，步骤中的生物分子a为链霉亲和素，生物分子b为生物素。6. 根据权利要求4或5所述的磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞的方法，其特征 在于，步骤議中的生物分子c为上皮细胞黏附分子抗体。
【专利摘要】本发明提供一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底及其制备方法。该磷酸锌纳米基底以生长于透明基底的氧化锌纳米线为起始原料，在磷酸根和镁离子的影响下，采用低温水热的方法制备。本发明还提供一种利用该磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞（CTC）的方法，包括以下步骤：磷酸锌纳米基底表面修饰羧基；活化羧基，修饰特异性识别靶细胞的生物分子；捕获CTC；采用生物相容性好的柠檬酸钠溶解磷酸锌纳米基底，释放肿瘤细胞。本发明制备的基底具有捕获循环肿瘤细胞效率高、灵敏度高、易操作、重现性好等特点。同时，采用柠檬酸钠溶解基底，释放的肿瘤细胞活性高，可进行分子水平分析、耐药性研究，对于肿瘤细胞的后续研究具有潜在意义。
【IPC分类】B82Y40/00, B82Y30/00, G01N33/543, G01N15/14, G01N33/574
【公开号】CN105259096
【申请号】CN201510677697
【发明人】周翔, 黄卫华, 郭珊, 徐加泉, 谢敏, 范利平, 程世博
【申请人】武汉顺可达生物科技有限公司, 武汉大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月19日