水解酶法测定不对称二甲基精氨酸及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物酶法测定不对称二甲基精氨酸（NG，NGdimethyl-L-arginine， asymmetricdimethylarginine，ADMA)及试剂盒开发。特别地，本发明涉及利用二甲基精氨 酸二甲氨基水解酶、鸟氨酸甲氨酰转移酶、氨甲酰激酶将ADMA转化为等物质量的氨，进而 通过二乙酰一肟-氨基硫脲比色法或谷氨酸脱氢酶速率法测定氨的含量，推知血清中ADMA 的浓度的方法和试剂盒。该发明为简便，准确，灵敏监测不对称二甲基精氨酸提供了重要依 据。
【背景技术】
[0002] 不对称二甲基精氨酸（aNG，NGdimethyl-L-arginine，asymmetric dimethylarginine，，ADMA)，也叫非对称二甲基精氨酸，分子式见图1，由 Vallance(VallanceP，LeoneA，CalverA，CollierJ，MoncadaS.Lancet339,572-575, 1992) 1992年首次在血浆和尿液中检测出ADMA。ADMA由含有精氨酸残基的蛋白质在蛋白 质精氨酸甲基转移酶（proteinargininemethyltransferases，PRMT)的作用下甲基化，甲 基化的蛋白水解后即可释放出ADMA。ADMA能竞争性抑制一氧化氮合酶（N0S)使一氧化氮 (N0)生成减少，在体内起内源性N0合成抑制剂的作用。一氧化氮（N0)是血管衍生中的活 性物质，具有舒张血管，维持血管张力恒定和调节血压的作用。体内多种因素可引起ADMA 水平升高，ADMA的蓄积，导致血管内皮功能障碍。已有研究表明，血浆ADMA水平在心血管 疾病出现临床表现之前就已经开始升高。因此，ADMA作为一种前瞻性，独立的心血管病诊 断指标具有重大意义。ADMA水平的升高不仅能作为心血管疾病的先兆，还能作为动脉粥样 硬化，心衰，高血压，糖尿病，肾衰肝脏衰竭，勃起功能障碍等疾病的一个重要危险因子。
[0003] 目前，ADMA作为一种新型的内皮功能不全和心血管疾病标志物，引起了国际和国 内的广泛重视。
[0004] 体内90 %ADMA的通过二甲基精酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)的分解，分解的产物为胍氨酸和二甲胺或单甲胺（Ogawa， T,andKimoto,M.andSasaoka,K.J. ,BiolChem264 :10205-9,1989 ；MacAllister, R.J.andParry,H.andKimoto,M.andOgawa，T.，etal.BrJPharmacol119 :1533-40， 1996)〇
[0005] DDAH是一种存在于细胞质的胞内酶。本发明的生物酶法也借鉴了体内ADMA的清 除模式，即ADMA在DDAH的水解下，分解为瓜氨酸和二甲胺，作为本试剂盒的第一步反应。
[0006]ADMA作为如此重要的一个心血管疾病的指示因子，尽快开发出关于ADMA的诊断 试剂应用于临床，将造福整个社会。测定生物样品中ADMA浓度的方法，主要有以下几种， 高效液相色谱法，液质联用法，酶联免疫法、化学发光法、胶乳增强法以及酶法。
[0007] 相对来说，高效液相色谱法，液质联用法由于其操作复杂，仪器要求高，耗资耗时 耗力不适合临床诊断使用。
[0008]德国DLDDiagnostikaGmbH公司（DLDDiagnostikaGmbH，Germany)米用竞争 的酶联免疫法测定生物样品中的ADMA，已经将该试剂盒应用到临床。但是，该方法主要的 技术瓶颈在于ADMA是一个单个氨基酸，目标分子量太小，不能构成一个抗原表位，也决定 了通过常规的抗原抗体反应不能将其检测出来，必须对样品进行预处理，即乙酰化的前处 理才能通过酶联免疫法检测出来，操作步骤复杂，不利于仪器自动化和标准化。另有专利 US20090053741A和CN1656123A(W02003102031-A)并非利用常规免疫结合反应，而是利用 一氧化氮合酶法的多肽片段和突变的DDAH酶达到特异性结合的目的，以上均是基于抗原 和抗体的免疫学反应而建立的检测方法，目前为止并未有相应的产品问世。
[0009] 化学发光和胶乳增强法依据的基本原理与酶联免疫法相同，也存在同样的技术瓶 颈。最近，CN102328868A公布了一种胶乳增强免疫比浊法检测不对称二甲基精氨酸含量试 剂盒。该方法通过将抗人ADMA单克隆抗体与交联有ADMA-人血清白蛋白复合体的胶乳颗粒 悬浮液，和样品中的待检ADMA竞争结合，通过浊度的下降程度来检测样品中ADMA的含量。 [0010] 酶法是针对底物的高效、特异、专一的反应，重复性好，敏感，易于实现自动化 检测。已有的ADMA酶法（专利W0200046395A、W02006030620A1 (JP2006081481A)和CN102154444A)均采用了DDAH将ADMA分解为L-瓜氨酸和二甲胺。产物瓜氨酸和ATP、天 冬氨酸在精氨酸琥珀酸合成酶作用下，生产AMP，AMP在AMP脱氨酶作用下生产頂P和氨， 产物氨在脱氨基辅酶再通过辅酶合成酶的作用生产氧化型辅酶，通过检测辅酶浓度从而得 出ADMA的浓度。以上方法均是基于精氨酸琥珀酸合成酶催化瓜氨酸生成AMP或者二甲胺 在二甲胺单加氧酶作用下的辅酶法测定。后续反应都在3步或以上，所需酶的种类也在3 种以上，如此多的反应过程增加了不确定性和，不容易实现仪器的自动化和标准化。国内专 利CN102243227A采用DDAH将ADMA分解为L-瓜氨酸和二甲胺。产物瓜氨酸在瓜氨酸水解 酶的作用下再进一步分解来测定，关键的是瓜氨酸水解酶来源途径不明，并不容易获得。所 以，目前仍然没有关于ADMA酶法检测的成熟试剂盒问世。因此开发一种简便、快速、灵敏的 酶法诊断试剂盒势在必行。
[0011] 本发明采用的酶法特异性强，灵敏度高，重复性好。采用三步酶法反应，简便，易实 现仪器自动化。经过实践证明，本发明中涉及的方法及试剂盒具有很好的研究价值和临床 应用价值。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种简便、准确的酶法测定ADMA的方法。通过三个反应过 程得出ADMA的浓度。
[0013] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中样品经过三步反应，三种反应分别 为：反应体系一为二甲基精氨酸二甲氨基水解酶最适反应体系，作用于ADMA生成二甲胺 和L-瓜氨酸。反应体系二为包含鸟氨酸甲氨酰转移酶（ornithinetranscarbamoylase， EC2. 1. 3. 3)和氨甲酰激酶（carbamatekinase，EC2. 7. 2. 2)的最适反应体系，作用于瓜氨酸 生成L-鸟氨酸、氨和二氧化碳。反应体系三为包含水杨酸、亚硝基铁氰化钠和次氯酸钠的 最适反应体系，作用于氨生成蓝绿色的靛酚蓝，通过着色深浅，比色定量氨。可选的，反应体 系三也可为包含底物γ-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸脱氢酶的最适反应体系。通过自动分 析仪监测NADPH的下降速率，从而确定氨氨含量。
[0014] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鸟 氨酸甲氨酰转移酶和氨甲酰激酶用量优选0.I_500ku/L;水杨酸溶液浓度优选0. 2-5% ;亚 硝基铁氰化钠溶液浓度优选〇. 1-10%;次氯酸钠溶液浓度优选〇. 01-lmol/L;γ-酮戊二酸 优选 0. 01-200mM;NADPH优选 0. 01-200mM;谷氨酸脱氢酶优选 0. 01-500mM.。
[0015] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中测定氨浓度时采用二乙酰一肟-氨 基硫脲比色法或谷氨酸脱氢酶速率法测定氨的含量。优选地，实验室研究选用二乙酰一 肟-氨基硫脲比色法测定氨的含量，该方法稳定，对试验设备要求不高。最终测定是通过波 长为697. 5nm的光吸收值根据已经做好的标准曲线确定样品读数中的氨含量值。优选地， 临床应用选用谷氨酸脱氢酶速率法测定氨的含量，该方法便于自动化，需要专门的生化分 析仪配合。三种生化反应氨与ADMA都是等物质量的关系，氨含量即为ADMA含量，无须经过 复杂换算，可以直接读出ADMA含量。
[0016] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中样品来源于任何包含水的液态物 质，优选地，样品为尿液或血液。
[0017] 本发明的另一个目的在于提供一个检测ADMA的酶法诊断试剂盒。该试剂盒简便、 灵敏度高、重复性好、具有很好的临床应用前景。
[0018] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂盒包含包含试剂R1，试剂R2， 试剂R3,缓冲液，稳定剂，ADMA标准品的液体试剂盒或包含试剂R1，试剂R2,试剂R3,ADMA 标准品的干粉试剂盒。
[0019] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂Rl，R2,R3缓冲液是 0. 02-0. 05MTRIS缓冲液、0. 02-0. 05M甘氨酸缓冲液或0. 02-0. 05M磷酸缓冲液，缓冲液的 PH值为 6. 5-8. 5。
[0020] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中试剂R1为包含二甲基精氨酸二 甲氨基水解酶最适反应体系的混合物；试剂R2为包含鸟氨酸甲氨酰转移酶（ornithine transcarbamoylase，EC2. 1. 3. 3)和氨甲酰激酶（carbamatekinase，EC2. 7. 2. 2)的最适反 应体系的混合物；试剂R3为包含水杨酸、亚硝基铁氰化钠和次氯酸钠的最适反应体系或底 物γ-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸脱氢酶的最适反应体系的混合物。
[0021] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鸟 氨酸甲氨酰转移酶和氨甲酰激酶用量优选2-20kU/L;水杨酸溶液浓度优选2-5% ;亚硝基 铁氰化钠溶液浓度优选〇. 2-1 %;次氯酸钠溶液浓度优选0. 04-0. 10mol/L;γ-酮戊二酸优 选 0.l-20mM;NADPH优选 0.l-20mM;谷氨酸脱氢酶优选 0.l-200mM.。
[0022] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中稳定剂是0. 1-0. 5%牛血清白蛋白， 10-15%甘油，甘露醇，0·001-0·01%叠氮钠，0·5-2mMEDTA。
[0023] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中所述的ADMA标准品为添加了ADMA 纯品或NH4+纯品的人血清或其它类似血清基质的液体。优选地，选择添加了ADMA纯品的人 血清或其它类似血清基质的液体。
[0024] 根据这一发明目的的一个优选实施方案，其中本试剂盒一方面能用于ADMA的检 测，另一方面还能用于L-瓜氨酸的检测，还能用于氨的检测。
【附图说明】
[0025] 图 1 :NG，NG'dimethyl-L-arginine，a