用于快速检测苯并(a)芘的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，W及利 用该纳米免疫传感器检测肉制品中的苯并(a)巧的检测方法。
【背景技术】
[0002] 苯并(a)巧是一种由4个苯环构成的多环芳控，常溫下为无色至淡黄色针状晶体， 性质稳定。在煎烤、烧烤、油炸动物性肉制品的过程中，食品会产生苯并(a)巧，人和动物摄 入苯并(a)巧超出限量的肉制品后会导致肿瘤和癌变，对健康造成潜在的威胁。目前，由食 品污染引起的疾病是引起人们广泛关注的食品安全问题之一，许多国家已将苯并(a)巧为 食品有害物质监测的重要内容之一，如德国限定肉制品中苯并(a)巧的残留量为化g/kg，我 国国标限定肉制品中苯并(a)巧的残留量应在化g/kg W下。已报道的苯并(a)巧检测方法有 液相色谱法、气相-质谱联用法、薄层层析法等，但色谱法、层析法等检测方法存在操作繁 琐、耗时长、结果分辨性差等缺点。因此，目前许多工作研究者致力于开发更为快速、准确的 苯并(a)巧检测方法，W提高食品中苯并(a)巧的检测效率，同时要避免出现假阴性或假阳 性的现象。
【发明内容】
[0003] 本发明为解决上述技术的不足，提供一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传 感器的制备方法，还提供一种利用该纳米免疫传感器检测食品中苯并(a)巧的方法，本发明 既具备更加灵敏、快速、易微型化、便于携带和现场检测的优势，同时也具备免疫反应抗原-抗体结合的特异性。
[0004] 为解决W上问题，本发明采用W下技术方案：
[0005] 本发明一种用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是，W 玻碳电极为基础电极，采用聚酷胺-胺树枝状大分子结合聚二締丙基二甲基氯化锭功能化 的石墨締修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，纳米金经静电吸附作用固定于修饰电极上， 再经戊二醒偶联固定多环芳控抗体制备成纳米免疫传感器。
[0006] 所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的制备方法，包括W下步骤：
[0007] a.电极预处理
[0008] 将玻碳电极用粒径为0.05皿的氧化侣抛光粉抛光打磨至电极表面呈镜面，然后用 蒸馈水冲洗干净，再依次置于体积分数为50%的硝酸、丙酬、去离子水中超声清洗2min~ 6min，氮气吹干，备用；
[0009] b.聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物的制备
[0010] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25 % )中，超声处理25min~35min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的 石墨締，取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/ mL，超声处理lOmin~20min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮 液，备用；
[00川准确称取0.02g聚酷胺-胺溶于10m巧醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理15min~ 25min，得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化 石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理30min~40min，制得聚酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物；
[001^ C.纳米金的制备
[0013] 准确量取50mL O.lmg/血的氯金酸溶液置于烧杯中，用玻璃棒揽拌下加热至沸腾， 迅速加入2.5mL质量分数为1 %的巧樣酸钢溶液，持续揽拌至溶液颜色变为酒红色，得到纳 米金溶液；（注：制备纳米金使用的玻璃器皿在使用前需经铭酸洗液浸泡2地，并冲洗，烘干 处理）。
[0014] d.纳米免疫传感器的制备
[0015] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取3~化L步骤b得到 的聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取2~化L 纳米金溶液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂3~化L质量分 数为0.5%的戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化25~35min，然后用pH为 7.4的0.2111〇1/1憐酸盐缓冲液冲洗电极，再滴涂3~化1^多环芳控抗体，并于4°0条件下固定 2h，再滴涂3~扣L质量分数为2 %牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L 憐酸盐缓冲液反复冲洗干净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0016] 优选的，所述步骤b中聚酷胺-胺-PDDA功能化石墨締复合物的制备的具体步骤内 容为：
[0017] 准确称取0.2g石墨締加入到lOmL聚二締丙基二甲基氯化锭水溶液(PDDA，体积分 数为0.25% )中，超声处理30min，水洗Ξ次去除过量的石墨締，制得PDDA功能化的石墨締， 取O.Olg P孤A功能化的石墨締加入到lOmL N，N-二甲基甲酯胺中，使其浓度为Img/mL，超声 处理15min，得到均匀一致的P孤A功能化石墨締的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液，备用；
[0018] 准确称取0.0?聚酷胺-胺溶于lOmL甲醇中，使其浓度为2mg/mL，超声处理20min， 得到均匀透明的聚酷胺-胺的甲醇溶液，然后将聚酷胺-胺的甲醇溶液与PDDA功能化石墨締 的N，N-二甲基甲酯胺悬浮液按1:1混合均匀，超声处理35min，制得聚酷胺-胺-PDDA功能化 石墨締复合物。
[0019] 优选的，所述步骤d中纳米免疫传感器的制备的具体步骤内容为：
[0020] 将步骤a中得到的玻碳电极应用Ξ电极系统，即W玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl 电极为参比电极、销丝电极为辅助电极，在-0.2V~+0.6V的电位区间，采用LK98BII型微机 电化学分析系统W50mV · 的扫描速度在新配制的0.05mol/L硫酸溶液中进行循环伏安扫 描10圈，对玻碳电极表面进行活化处理。冲洗玻碳电极后，用移液枪移取扣L步骤b得到的聚 酷胺-胺-P孤A功能化石墨締复合物滴涂到玻碳电极表面，于室溫惊干，再移取化L纳米金溶 液滴涂到修饰的电极表面，于室溫惊干，然后在修饰电极表面滴涂化L质量分数为0.5 %的 戊二醒溶液活化修饰的电极表面，于4°C条件下活化30min，然后用抑为7.4的ο. 2mol/L憐酸 盐缓冲液冲洗电极，再滴涂化L多环芳控抗体，并于4°C条件下固定化，再滴涂化L质量分数 为2%牛血清白蛋白溶液于4°C下封闭化，用抑为7.4的0.2mol/L憐酸盐缓冲液反复冲洗干 净，得到苯并(a)巧纳米免疫传感器，于4°C条件下保存备用。
[0021] 使用所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，包括W下具 体步骤：
[0022] a.标准曲线
[0023] 取苯并(a)巧标准品加入到lOmL二甲基亚讽中，再用抑为7.4的憐酸盐缓冲溶液稀 释至不同浓度梯度，在苯并(a)巧纳米免疫传感器上涂上各个梯度的上述苯并(a)巧标准品 溶液，室溫下解育15~25min，WAg/AgCl电极为参比电极、销丝(片）电极为辅助电极，苯并 (a)巧纳米免疫传感器为工作电极，组成Ξ电极测试系统，在l.Ommol/L K3[Fe(CN)6] + 0.1mol/L KCl+0.2mol/L憐酸盐缓冲溶液(pH为7.0)进行差分脉冲伏安法的检测（扫描速度 为50mV · ，电压范围为-0.2V~+0.6V); W苯并(a)巧浓度为零时电流值和各浓度梯度的 电流值的差值为纵坐标，苯并(a)巧浓度的对数为横坐标，得到苯并(a)巧的免疫响应电流 差值与其浓度之间的线性曲线，即标准曲线及线性回归方程式，实验在室溫条件下进行。 [0024] b.测定
[0025] 将检测样品（肉制品1、11)分别粉碎，肉制品I和II各取lOg样品，进行W下处理，即 加入50mL环己烧，超声处理lOmin后过滤到浓缩瓶中，在70°C旋蒸至20血，移入分液漏斗，用 50血二甲基亚讽萃取，再用30血环己烧提取，弃去环己烧层，把提取液旋蒸至10血，用5血二 甲基亚讽洗涂浓缩瓶，合并二甲基亚讽，加入15mL水，摇匀后过活化后的Cl姻相萃取小柱抽 干，用30mL正己烧洗脱，收集洗脱液，蒸干后用2mL甲醇定容，经0.45皿滤膜过滤，备用；用 LK98BII型微机电化学分析系统来测定所述的差分脉冲伏安图，分别进行Ξ次测量并记录 差分脉冲伏安图，按线性回归方程式计算其苯并(a)巧的浓度，此过程在室溫条件下下进 行。
[0026] 优选的，所述的用于苯并(a)巧快速检测的纳米免疫传感器的检测方法，所述步骤 a中，在苯并(a)巧纳米免疫传感器上涂上各个梯度的苯并(a)巧标准品溶液后，室溫下解育 时间为20min。
[0027] 本发明与现有技术相比具有W下显著的优点：
[0028] ①本发明的纳米免疫传感器用于检测肉制品中的苯并(a)巧法与国标法相比，缩 短了苯并(a)巧的检验时间，提高了检测效率。
[0029] ②简化了样品前处理步骤，同时不限制样品提取液的颜色。
[0030] ③利用PDDA功能化石墨締与纳米金间正负电荷吸引，提高