用于诊断冠心病的代谢标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，设及疾病诊断标志物，具体设及一组用于诊断冠屯、病 的代谢标志物。
【背景技术】
[0002] 冠屯、病亦称为缺血性屯、脏病，设及供应屯、肌血液的动脉发生粥样硬化，即冠状动 脉粥样硬化病变引起血管腔狭窄或斑块形成甚至破裂、完全堵塞，造成屯、肌缺血、缺氧或坏 死而导致屯、脏缺血性疾病，从而引起临床上屯、绞痛、屯、肌梗死等一系列严重的屯、血管事件。 冠屯、病是人类健康的主要杀手，具发病率高、致残率高、复发率高、病死率高、并发症多等特 点，已经成为威胁我国人民健康的主要疾病。
[0003] 冠状动脉粥样硬化是冠屯、病的主要病因，是冠屯、病的早期病症。动脉粥样硬化是 一种常见的进行性动脉疾病，病变主要累及中等大小的肌层动脉，动脉内膜脂质沉积，平滑 肌细胞增生，形成局限性斑块，可使动脉壁变硬，严重时斑块破裂导致血栓、栓塞、出血，受 累管腔部分或完全闭塞，临床表现为动脉粥样硬化血管并发症的发生，老年患者中最常见 和最严重的血管并发症是冠屯、病(不稳定性屯、绞痛和屯、肌梗塞）。动脉粥样硬化早期病变可 发生在10岁之前，病变引起动脉狭窄需经历20至30年时间，早期无临床症状，不易被发现和 重视，因此对冠状动脉粥样硬化的早期预防和诊断可W有效地防止冠屯、病的发生。
[0004] 冠状动脉造影可W对冠状动脉的狭窄程度作出准确的判断，是诊断冠屯、病的金标 准[冠状动脉造影金标准与临床常规诊断冠屯、病差异性比较研究，舒荣文等，海军医学杂志 2015年04期]。作为冠屯、病诊断的金标准，冠脉造影只能发现血管狭窄程度，而且它还是一 种介入测量手段，需要介入手术，且诊断昂贵。另一方面，医生还需要依据对患者的屯、电图、 屯、动图、平板运动试验、CT等检查结果作出最终诊断，由于医生主观性判断、病人叙述不清 等情况的出现，对冠屯、病的诊断仍存在较大的误诊和漏诊，运对病人的预后影响非常大。为 了改善患者的生活质量，降低患者受到的生命威胁，我们亟需发展一种具有诊断率高、经 济、无侵入性、操作简便等特性的诊断方法。
[0005] 代谢组学是研究生物体内源性代谢物质的整体及其随内因和外因变化的科学，是 系统生物学的一个重要组成部分。它可W对体液如血液和尿液进行快速及无侵入性的分 析，通过代谢谱的差异获得可W指示各种生化反应的代谢标志物。目前常用的分析技术包 括核磁共振(NMR)、质谱化C-MS/GC-MS)等。LC-MS/GC-MS具有对样本制备要求低、灵敏度高、 动态范围宽等特点，可用于检测样本中浓度相差大的代谢物，因而成为代谢组学的研究中 应用越来越多的技术平台。
[0006] 血浆分析是临床上常用的一种疾病诊断方法，因其简便、快速、经济且相对无创的 优点而被广泛采用。目前尚未有人使用血浆代谢物水平对冠屯、病进行诊断。应用血浆代谢 组学寻找代谢标志物W诊断冠屯、病对于临床早期快速确诊冠屯、病具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明第一目的在于提供一组用于诊断冠屯、病的代谢 标志物，该组代谢标志物同时存在于血浆中，可同时分析测定;本发明的第二目的在于提供 一种能够灵敏地分析检测所述代谢标志物的方法;本发明的第Ξ目的在于提供所述代谢标 志物在筛选治疗或缓解冠屯、病的药物中的应用;本发明的第四目的在于提供一种基于所述 代谢标志物的检测试剂盒，用于诊断冠屯、病，提高诊断便利性，促进诊断方法标准化;本发 明的第五目的在于提供所述检测试剂盒在筛选治疗或缓解冠屯、病的药物中的应用。
[0008] 上述目的是通过如下技术方案得W实现的：
[0009] -组用于诊断冠屯、病的代谢标志物，包括一个或多个如下所述的代谢标志物：1-栋桐酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-十八碳四締酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-亚油酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-硬脂酷-sn-甘油-3憐脂酷胆碱、1-亚油酷-2-?基-sn-甘油-3-憐脂 酷乙醇胺、1-亚麻酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-油酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-十六碳締 酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、植物銷氨醇和十六酷胺；
[0010] 所述诊断包括诊断区分冠屯、病患者与健康人，还包括诊断区分冠屯、病患者与冠状 动脉粥样硬化患者。
[0011] 进一步地，包括任意两个所述的代谢标志物。
[0012] 进一步地，包括任意Ξ个所述的代谢标志物。
[0013] 进一步地，包括任意四个所述的代谢标志物。
[0014] 进一步地，所述的代谢标志物来源于血浆。
[0015] -种定性或定量分析所述的代谢标志物的方法，通过液质联用和/或气质联用对 所述的代谢标志物定性或定量。液质和气质检测限低、灵敏度高，能灵敏地分析检测生物样 本中的代谢标志物并对其定量。
[0016] 冠屯、病治疗或缓解后，会在代谢标志物的表达水平上有所体现。因此，所述的代谢 标志物可W用于筛选治疗或缓解冠屯、病的药物。
[0017] -种用于诊断冠屯、病的检测试剂盒，包括所述的代谢标志物的标准品，所述标准 品为各代谢标志物的化学单体或混合物。使用标准品可W对生物样本中的代谢标志物进行 快速准确地定性、定量分析。试剂盒有助于实现检测标准化，提高检测便利性和重现性。
[0018] 进一步地，所述检测试剂盒还包括溶解所述标准品的溶剂和/或提取富集所述代 谢标志物的溶剂。
[0019] 所述的检测试剂盒在筛选治疗或缓解冠屯、病的药物中的应用。
[0020] 本发明的优点：
[0021] (1)本发明提供的代谢标志物能精确诊断冠屯、病，既能诊断区分冠屯、病患者与健 康人，又能诊断区分冠屯、病患者与冠状动脉粥样硬化患者。R0C曲线评价方法中，R0C曲线下 的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5~0.7时有较低 准确性，AUC在0.7~0.9时有一定准确性，AUC在0.9 W上时有较高准确性。经验证，本发明提 供的代谢标志物单个用于诊断区分冠屯、病患者与健康人或诊断区分冠屯、病患者与冠状动 脉粥样硬化患者时，AUC均在0.7W上；多个联合应用时，AUC比单个更接近于1，诊断效果更 好;十个联合应用时，AUC最接近于1，诊断区分效果最好。
[0022] (2)本发明提供的分析检测所述代谢标志物的方法灵敏度高，结果准确可靠。
[0023] (3)本发明提供的代谢标志物可W有效诊断冠屯、病的病情是否得到缓解，可W用 于筛选治疗或缓解冠屯、病的药物。
[0024] (4)本发明提供的试剂盒可W用于诊断冠屯、病，提高诊断便利性，促进诊断方法标 准化。
[0025] (5)本发明提供的基于所述代谢标志物的试剂盒可W有效诊断冠屯、病的病情是否 得到缓解，可W用于筛选治疗或缓解冠屯、病的药物。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例进一步说明本发明实质性内容。使用的仪器或试剂未做详细说明 的均为常规仪器和试剂;未具体描述的试验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规 操作方法。
[0027] 实施例1:冠屯、病患者与非冠屯、病患者(包括健康人和冠状动脉粥样硬化患者）之 间血浆差异性代谢物的筛选表征
[002引一、对象和方法
[0029] 1、标本来源
[0030] 在取得患者同意后，收集江苏省人民医院2010年9月~2015年6月480例冠状动脉 粥样硬化患者、867例冠屯、病患者和350例健康人的外周静脉血血浆，所有患者或健康人均 经冠脉造影证实。健康人的年龄、性别与冠状动脉粥样硬化患者、冠屯、病患者相匹配。所有 冠状动脉粥样硬化患者、冠屯、病患者和健康人均有正常的屯、肺肝肾及造血功能。
[0031]义血时间均为清晨至腹状态。
[0032] 2、主要试剂
[0033] 乙腊及甲酸化化C纯）购于美国ROE公司；色谱级别甲醇和氯仿购于江苏汉邦科技 有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺(含1%Ξ甲基氯硅烷)购于美 国Sigma-Al化ich公司；去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统制 备;标准品包括1-栋桐酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-十八碳四締酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆 碱、1-亚油酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-硬脂酷-sn-甘油-3憐脂酷胆碱、1-亚油酷-2-径 基-sn-甘油-3-憐脂酷乙醇胺、1-亚麻酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、1-油酷-sn-甘油-3-憐脂 酷胆碱、1-十六碳締酷-sn-甘油-3-憐脂酷胆碱、植物銷氨醇和十六酷胺，购于美国Sigma-Aldrich。
[0034] 3、血浆差异性代谢物的表征
[0035] 3.1UPLC-Q/T0F-MS 筛选表征
[0036] 3.1.1样品制备
[0037] 利用响应面法进行提取溶剂优化：W质谱ESI+和ESI-检测模式下的峰个数和总峰 面积为因素考察不同溶剂（乙腊、甲醇、乙醇、氯仿、水)对血浆中代谢物的提取富集效率。将 实验测得数据进行多变量分析，利用化S模型中重要性因子（variable impodance to projection, VIP值)反映变量对模型响应的重要性。乙腊、甲醇、乙醇、氯仿、水的VIP值依次 为1.503，0.802，0.651，0.688和0.987，乙腊的提取效率最高，故选择乙腊作为血浆样本的 提取溶剂。
[003引样品处理：取100化血浆于1.5mL离屯、管中，加入400化乙腊，满旋30秒后混匀， 1300化pmX lOmin离屯、(4°C)，取20化L上清于1.5mL离屯、管中，在室溫下用氮吹仪吹干，所得 残渣用3(Κ)化的20 %乙腊水溶液溶解，即得。
[0039] 3.1.2检测表征
[0040] UPLC-Q/T0F-MS 条件：
[0041 ] 色谱分离采用超高效液相色谱化化C，Agilent 1290，USA)。色谱柱为Waters邸Η C18柱（100mmX 2.1mm，1.7皿），柱溫25°C，进样室溫度为室溫，进样量化L。正、负离子模式流 动相组成均是A为体积浓度0.1 %甲酸水溶液，B为体积浓度0.1 %甲酸乙腊溶液。梯度洗脱 条件:0~Imin为0~30%B相，2min内B相线性增加到60%，3~8min线性变化至90%B相，然 后在8~9min线性增加至100%B相并保持Imin;流速0.3mL/min，柱后流出液不经分流直接 导入质谱系统检测。
[0042] 质谱分析采用四级杆-飞行时间质谱(Agilent 6530Q-T0F/MS，USA)dW电喷雾离 子源化SI)正、负离子模式检测;干燥气流速为化/min，干燥气溫度为300°C，干燥气和锥孔 气均为高纯氮气;离子源溫度l〇〇°C，正离子和负离子模式下毛细管电压均为3000V，碰撞电 压为100V;采用全扫描模式每秒进行Ξ次数据采集，扫描质量范围:m/z 100-1000道尔顿。
[0043] 3.2GC-Q/MS 筛选表征
[0044] 3.2.1样品制备
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