标记糖链样品的调制方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种调制经过标记的糖链样品的方法，特别是涉及一种高效地调制经 过标记的〇型糖链样品的方法。
【背景技术】
[0002] 糖链是葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、海藻糖(Fuc)、木糖(Xyl)、N-乙 酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、唾液酸等的单糖和这些的衍生物以链 状连接而成的分子的总称。
[0003] 糖链非常富有多样性，是参与生物所具有的各种功能的物质。糖链在生物体内多 作为结合于蛋白质或脂质等而成的复合糖质而存在，日渐明确生物体内的糖类与细胞间信 号传递、蛋白质的功能和相互作用的调节等息息相关。
[0004] 作为具有糖链的生物大分子，可以列举有助于细胞的稳定化的植物细胞的细胞壁 的蛋白多糖、影响细胞的分化、增殖、粘着、移动等的糖脂质、以及参与细胞间相互作用或细 胞识别的糖蛋白等，逐渐明确了这些大分子的糖链相互代行、辅助、扩增、调节或者阻碍功 能并且是高度精密地控制生物反应的机构。进一步，只要明确了这样的糖链与细胞的分化 增殖、细胞粘着、免疫以及细胞的癌化的关系，就可以使糖链工程学与医学、细胞工程学或 者脏器工程学密切关联，从而可以期待谋求新的发展。
[0005] 为了早期发现疾病确保高的生活质量(Q0L)，需要能够预防疾病的发病或诊断其 发展的生物标记物。根据糖链生物合成中所涉及的糖基转移酶的基因阻断小鼠的分析，可 知在各种组织?器官的功能维持中糖链是必须的（非专利文献1、2)。另外，还已知如果糖基 化中发现有异常则会引起各种疾病(非专利文献3)。因为糖链的结构根据细胞的癌化或各 种疾病而显著地变化，因此，期待其在作为用于调查疾病的发展的生物标记物上的利用。
[0006] 糖链还可以列举作为对于生物医药品的了解重要的品质特性之一，对于生物医药 品的等效性的担保也可以说有益。因此，也有作为生物医药品的制造过程的设计或工序内 管理寻求导入糖链分析法的想法。
[0007] 由于糖链自身不具有荧光性、紫外线吸收性，因此，在对糖链进行分析时多预先施 加标记。在利用HPLC或HPLC-MS对糖链进行分析的情况下，通常实施2-氨基苯甲酰胺衍生化 (2AB化）、2_氨基吡啶衍生化(PA化)等的荧光标记(非专利文献4)。另外，在利用MALDI-T0F MS对糖链进行分析的情况下，也通过施以标记来谋求测定灵敏度的提高(非专利文献5、6)。
[0008] 在对糖链施以标记(标记化)时，为了提高标记效率而使过量的标记试剂对糖链作 用的情况较多。如果在样品溶液中存在过量的标记试剂，则由于对HPLC测定或质谱带来障 碍，因此，必须预先将其除去。作为试剂的除去方法，使用整体式硅胶的方法作为有用的方 法被经常使用。作为现有方法所使用的方法将糖链中被称为N型糖链(天冬酰胺结合型糖 链)的糖链群作为对象进行了研究，对于N型糖链的捕捉回收很充分，但对于比N型糖链分子 量小的被称为〇型糖链(丝氨酸?苏氨酸结合型糖链)的分子，捕捉回收的回收率低，特别难 以进行0型糖链的定量分析，从而寻求能够以高的回收率回收0型糖链的方法(非专利文献7 ~9) 〇
[0009] 现有技术文献
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献l:I〇ffe Ε.，Stanley Ρ.，Proc.Natl.Acad.Sci.，91，ρρ·728-732 (1994)
[0012] 非专利文献2:Metzler Μ·，Gertz A.，Sarker Μ·，Schachter Η·，Schrader J.W.， Marth J.D.,ΕΜΒΟ J.,13,pp.2056-2065(1994)
[0013] 非专利文献3:Powell L.D. ,Paneerselvam K. ,Vij R. ,Diaz S. ,Manzi A. ,Buist N.,Freeze H.,Varki A.,J.Clin.Invest.,94,pp.1901-1909(1994)
[0014] 非专利文献4: Shilova N.V. ,Bovin N.V. ,Russian Journal of Bioorganic Chemistry,29,pp.309-324(2003)
[0015] 非专利文南犬5:Shinohara Y. ,Furukawa J._i · ,Niikura K. ,Miura Y. ,Nishimura S.-I.,Anal.Chem.,76,pp.6989-6997(2004)
[0016] 非专利文南犬6:Furukawa J._i · ,Shinohara Y. ,Kuramoto H. ,Miura Y. ,Shimaoka H.,Kurogochi M.,Nakano M.,Nishimura S.-I.,Anal.Chem.,80,pp.1094-1101(2008)
[0017] 非专利文献 7 : K1 e in A，Lebreton A，Lemo ine J，Per ini JM，Rousse 1 P， Michalski JC.,Clin.Chem.,44,pp.2422-2428(1998)
[0018] 非专利文献8:Anumula KR. ,Anal .Biochem. ,373,pp. 104-111(2008)
[0019] 非专利文献9 : Prater BD ,Anumula KR, Hutchins JT · , Anal · Biochem · , 369 , pp.202-209(2007)
【发明内容】
[0020] 发明所要解决的技术问题
[0021] 本发明的目的在于提供一种能够在以0型糖链为代表的分子量小的糖链群进行标 记反应之后，将其有效地精制、回收的标记糖链样品的调制方法。
[0022] 解决技术问题的手段
[0023] 本发明者们为了达成上述目的重复进行专门研究，其结果发现:通过用高浓度的 有机溶剂稀释标记糖链并担载于二氧化硅类载体上，用高浓度的有机溶剂清洗该载体，用 含有水的溶液洗脱吸附于该载体上的标记糖链，由此能够显著地降低标记糖链(特别是经 过标记的〇型糖链)的损失，并且能够高效地除去标记糖链以外的物质(试剂、盐类、添加剂、 未标记物等），至此完成本发明。
[0024] 更详细地说，本发明提供以下发明。
[0025] [1] -种方法，其中，所述方法为调制标记糖链样品的方法，
[0026] 包括：
[0027] (工序1)通过使含有标记糖链的样品溶液接触二氧化硅类载体，从而使糖链成分 吸附于二氧化硅类载体上的工序；
[0028](工序2)用清洗液清洗二氧化硅类载体的工序；
[0029] (工序3)使洗脱液接触二氧化硅类载体，使吸附的糖链成分洗脱的工序，
[0030] 其中，工序1中的样品溶液为含有超过95体积％的有机溶剂的溶液。
[0031] [2]如[1]所述的方法，其中，所述工序1的样品溶液中所含的有机溶剂为乙腈。
[0032] [3]如[1]或[2]所述的方法，其中，工序2的清洗液为含有超过95体积％的有机溶 剂和小于5体积％的水的溶液。
[0033] [4]如[3]所述的方法，其中，所述工序2的清洗液中所含的有机溶剂为乙腈。
[0034] [ 5 ]如[1 ]~[4]中任一项所述的方法，其中，工序3的洗