肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、以及分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用蛋白酶位置选择性地切断抗体等蛋白质从而制备肽片段的方法、 及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒。进而，本发明涉及对利用该方法制备的肽片段利 用质谱法等进行分析从而进行蛋白质的检测、定量的分析方法。
【背景技术】
[0002] 抗体药物的需求正迅速扩大，在临床现场，对血液中的抗体浓度进行简便地定量 的重要性在提高。一直以来，虽然并未重视正确测定给与抗体药物后的血药浓度，但伴随曲 妥珠单抗(商品名:Herceptin)在胃癌应用扩大的临床试验中，发现其血药浓度与生存期之 间存在显著性差异之后，在抗体药物的临床试验等中，测定抗体的血药浓度也正成为必须 的。例如，在确认药代动力学等质量管理、确认仿制药在临床试验等中与原药的等效性等方 面也要求进行抗体药物的鉴定、其血药浓度的定量。
[0003] 使用了抗原抗体反应的E L I S A (酶联免疫吸附试验（e n z y m e - 1 i n k e d immunosorbent assay))法的特异性和定量性优异，所以在临床试验等中广泛用于血液中 的抗原、抗体的检测/定量等。然而，ELISA法是以单一的蛋白质(抗原或抗体)的检测为目的 的方法，不能同时检测多种不同的蛋白质。为了利用ELISA法检测多种蛋白质，需要针对每 一个检测对象制作特异性抗体并设定浓度测定条件，需要巨大的精力和费用。另外，由于 ELISA法利用抗原抗体反应，所以已知下述问题:联合用药、与代谢物的交叉反应可能影响 测定结果，一部分的抗体药物难以用于保存被检体等。
[0004] 因此，期待开发出能够普遍适用于各种抗体的分析方法。伴随蛋白质组学的发展， 开发了利用质谱法可对蛋白质网罗性地检测/定量的技术，近年来，也可进行抗体等巨大生 物体分子的解析。对于质谱，需要对测定对象分子进行离子化，通常难以直接用质谱对抗体 等巨大生物体分子进行分析。因此，采用了如下方法:利用蛋白酶消化来切断蛋白质（片段 化），从经片段化的肽中选择针对分析对象的蛋白质具有特异性的氨基酸序列的肽片段，利 用质谱装置进行检测/定量的方法。通常，为了提高利用蛋白酶的消化效率，在使基质蛋白 在高浓度的尿素、胍溶液中变性之后，进行蛋白酶消化。
[0005]在利用蛋白酶消化对抗体等蛋白质进行片段化并进行质量分析时，选择性地检测 出作为检测对象的肽片段是很重要的。然而，有时会难以从含有多种多样的夹杂物的生物 体试样中检测出源自分析对象的蛋白质的特定肽片段。即，由于血液等生物体试样含有多 种多样的夹杂物，所以在生物体试样中添加蛋白酶时，源自夹杂物的蛋白质也会被蛋白酶 消化，从而生成数量庞大的肽片段。为了从中选择性地检测/定量源自检测对象(例如特定 的抗体)的目标肽片段，在供于质谱之前，需要对肽片段进行分离、浓缩等操作。另外，如果 由检测对象之外的蛋白质产生具有与检测对象的蛋白质的肽片段相同的氨基酸序列的肽 片段，则会成为误检、定量性降低的原因。因此，存在伴随由生物体试样产生的肽片段数的 增加而作为检测对象的肽片段的选择变得更加困难的倾向。
[0006] 鉴于这样的生物体试样的复杂性，开发出了如下的方法:在利用液相色谱(LC)纯 化试样之后，供于质谱装置的方法;通过利用碰撞诱导解离(CID)等产生离子断裂的多级的 质谱、或它们的组合(多反应监测，MRM)，从而对生物体试样等复杂试样中的特定的蛋白质 进行定量的方法。然而，存在如下问题:试样变得越复杂，越需要组合各种各样的分离模式、 越需要高精度的实验装置，或分析条件的设定越需要花费大量的时间。
[0007] 另外，即使在使用了纯化后的试样的情况下，抗体等大蛋白也因蛋白酶消化而产 生多种肽片段，因此，存在从中选择性地检测/定量针对检测对象具有特有的氨基酸序列的 肽片段变得困难的倾向。鉴于这样的问题，开发出了：针对分析对象的蛋白质进行位置选择 性地蛋白酶消化，使试样中的肽片段的数量(种类)减少，提高分析精度且简化分析的方法。 例如，专利文献1中提出了如下方法:在利用抗体的胃蛋白酶消化产生F(ab'） 2片段之后，进 而用胰蛋白酶等蛋白酶消化F(ab'）2片段，产生含有抗体的互补性决定区（CDR)的肽片段， 利用质谱对含有CDR的肽片段进行检测/定量。
[0008]在此对抗体的结构进行说明。所有的抗体具有2条重链(H链)和2条轻链(L链）。1条 轻链和1条重链通过二硫键连接而形成异二聚体，进而2个异二聚体通过2个二硫(S-S)键连 接而形成"Y"字型的异四聚体（参照图2)。抗体具有由重链形成的1个FdFragment， cry stall izable)结构域和由重链和轻链形成的2个Fab (Fragment，antigen binding)结构 域，Fc结构域和Fab结构域借助铰链部连接。
[0009] 抗体的Fc结构域主要承担引起抗体与抗原结合之后的反应的功能(效应子功能）， 对于源自相同种类的抗体的大部分，Fc结构域的氨基酸序列是相同的。另一方面，Fab结构 域的前端部分(N末端)具有与抗原结合的功能。Fab结构域之中，为了使N末端的部分能够结 合于多种抗原，在氨基酸序列上可见各种变化。该区域称为可变区（V区），轻链的可变区称 为VL区，重链的可变区称为VH区。V区之外的Fab结构域和Fc结构域是氨基酸序列变化少的 区域，称为恒定区(C区）。轻链的恒定区称为CL区，重链的恒定区称为CH区。CH区进一步分为 CH1区、CH2区和CH3区这3个区。重链的Fab结构域包含VH区和CH1区，重链的Fc结构域包含 CH2和CH3。铰链部位于CH1和CH2之间。
[0010] 抗体的特异性（即与抗原的特异性结合性）是由V区的氨基酸序列的组合所决定 的。轻链和重链分别在Fab结构域的V区内具有3个互补性决定区（CDR) XDR也称为高变区， 根据抗体种类不同则氨基酸序列不同。由于抗体在轻链和重链上分别具有3个CDR(总计6种 CDR)，因而产生能够与各种各样的抗原结合的多样性。换言之，CDR是表征抗体的区域，通过 特定抗体的CDR的氨基酸序列能够对抗体进行鉴定。
[0011] 如上所述，抗体的Fab结构域和Fc结构域借助铰链部连接。由于作为蛋白酶之一的 木瓜蛋白酶切断该铰链部，所以通过抗体的木瓜蛋白酶消化而产生2个Fab结构域和1个Fc 结构域。另外，作为蛋白酶之一的胃蛋白酶切断铰链部的2根二硫键的Fc结构域侧（C末端 侧），所以通过胃蛋白酶消化产生2个Fab结构域键合的F(ab'） 2结构域和多个Fc结构域片 段。
[0012] 上述专利文献1的方法中利用胃蛋白酶消化或木瓜蛋白酶消化产生Fab结构域或F (ab'）2结构域，对Fab结构域或F(ab'）2结构域位置选择性地进行蛋白酶消化。利用该方法能 降低利用蛋白酶消化而产生的肽的数量，能有效地产生含有CDR的肽，因此通过质谱法进行 抗体的检测/定量得以简化。另外，专利文献2中报道了通过组合使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 和特定的离子，从而基于这些蛋白酶的消化效率提高。
[0013] 以抗体的Fab结构域的纯化为目的，也市售有对蛋白酶进行最优化后的纯化用试 剂盒等。然而，由于上述专利文献1的方法需要在对Fab结构域或F(ab'）2结构域进行纯化之 后进而进行蛋白酶处理，所以制备用于质谱的试样需要大量的时间和成本，难以称之为简 便的方法。另外，根据作为消化对象的基质蛋白的种类的不同，蛋白酶消化(片段化)的消化 效率不同，因此为了使制备用于质谱的肽片段试样简化，提高消化效率就变得至关重要。
[0014] 近年来，作为蛋白酶消化的高效率化方法，在纳米颗粒等微小环境(微型反应器） 内进行蛋白酶消化的方法受到关注。例如，在非专利文献1中报告了如下例子:通过在尼龙 的多孔膜的细孔内固定化胰蛋白酶，使白蛋白溶液在该多孔膜内通过，从而使白蛋白的胰 蛋白酶消化高效率化。在非专利文献2中报道了通过使用在细孔内固定了胰蛋白酶的中多 孔二氧化硅，从而能够选择性地胰蛋白酶消化分子量小的蛋白质。这些方法均是在多孔体 的细孔内固定化蛋白酶，使固相表面的蛋白酶与液相内的基质蛋白反应的方法。如此，通过 在微小环境中将蛋白酶固定在固相来提高消化效率的方法认为由以下原因所引起:在固相 与液相的界面这样的局部的/微小的环境中蛋白质易发生变性，或溶解度、三维结构的波动 幅度等受到扰动，由此基质蛋白与蛋白酶的接触机会增大，反应概率提高。
[0015] 现有技术文献
[0016] 专利文献
[0017] 专利文献1 :W02008/079914号国际公开小册子 [0018] 专利文献2:日本特开2011-130749号公报 [0019]非专利文献
[0020] 非专利文献l:Fei Xu et.al.，Anal.Chem. ,2010,82,10045-10051.
[0021] 非专利文献2:Qianhao Min et.al ·，Chem.Commun. ,2010,46(33) ,6144-6146·
【发明内容】
[0022] 发明要解决的问题
[0023] 虽然上述非专利文献2的方法能够对分子量小的蛋白质进行选择性地蛋白酶消 化，但却不适用于抗体这种大蛋白的选择性消化。另外，还未开发出利用如非专利文献1和 非专利文献2所公开那样的微型反应器位置选择性地进行蛋白酶消化的方法。
[0024] 如上所述，为了利用质谱法对蛋白质简便地进行检测/定量，需要对分析对象的蛋 白质进行位置选择性地切断，使检测对象的蛋白质有效地产生特异性的肽片段，使除此之 外的肽片段的产生量减少。例如，为了对抗体进行检测或定量分析，需要对Fab结构域、特别 是Fab结构域的V区进行位置选择性地蛋白酶消化，抑制Fc结构域的蛋白酶消化。
[0025] 用于解决问题的方案
[0026] 本发明人等进行了深入研究，结果发现通过在固相固定抗体等基质蛋白与蛋白酶 这两者，能够实现基质蛋白的位置选择性的蛋白酶消化，从而完成了本发明。
[0027] 本发明涉及一种利用蛋白酶消化蛋白质的肽片段的制备方法。本发明的方法具有 使在细孔内固定化有切断对象的基质蛋白的多孔体与在表面固定化有蛋白酶的微粒在液 体中接触的步骤(消化步骤）。在细孔内固定化有基质蛋白的多孔体通过在多孔体的细孔内 固定化切断对象的基质蛋白的步骤(基质固定步骤)而得到。本发明中，微粒的粒径优选大 于多孔体的平均孔径。
[0028] 当微粒的粒径大于多孔体的平均孔径时，固定化在微粒表面的蛋白酶能够接近多 孔体的细孔的表层附近(多孔体与液相的界面附近），但不能接近细孔深处的位置。如此，由 于蛋白酶的可接近区域不受物理的（空间的）限制，所以蛋白酶对固定化在多孔体的细孔内 的基质蛋白的特定位点选择性地接近。因此，可对基质蛋白进行位置选择性的蛋白酶消化 (片段化）。
[0029] 本发明中，优选基质蛋白的规定区域被固定化于多孔体上。在该方案中，固定化在 多孔体上的区域位于细孔的深处，与被固定化的区域不同的区域位于细孔的表层附近。如 果与基质蛋白的选择性切断位点不同的区域即优选不被蛋白酶消化的区域被固定化于多 孔体上，则固定化在微粒表面的蛋白酶接近位于细孔的表层附近的基质蛋白的选择性切断 位点，进行蛋白酶消化。因此，能够对基质蛋白所期望的位点进行位置选择性地蛋白酶消 化。
[0030]优选在多孔体的细孔内固定化有与基质蛋白进行位点特异性地相互作用的接头 分子。另外，基质蛋白优选借助接头分子固定化在多孔体的细孔内。作为基质蛋白为抗体时 的接头分子，例如可举出蛋白G、蛋白A等。由于这些接头分子与抗体的Fc结构域进行位点特 异性结合，所以抗体的Fc结构域被固定化在多孔体内，Fab结构域位于细孔的表层附近。根 据该方案，能够对抗体的Fab结构域进行选择性地蛋白酶消化。
[0031] 当在多孔体的细孔内固定化有接头分子时，接头分子与基质蛋白结合后的状态的 分子大小优选为多孔体的平均孔径的0.5倍~1.5倍左右。通过如此调整分子大小，从而能 够提尚固定化在微粒表面的蛋白酶与基质蛋白的选择性切断位点的接近概率，并提尚蛋白 酶消化的位置选择性。
[0032] 另外，优选用能够与蛋白酶结合的间隔分子修饰微粒的表面，并且蛋白酶借助该 间隔分子固定化在微粒的表面。通过借助间隔分子对蛋白酶进行固定化，从而抑制蛋白酶 从微粒表面脱离，提高了蛋白酶消化的位置选择性。另外，通过调整间隔物的分子大小，也 可使蛋白酶选择性地接近基质蛋白的所期望的位置，而提高位置选择性。
[0033] 本发明中，作为固定化在微粒表面的蛋白酶，优选为胰蛋白酶或胰蛋白酶与其它 蛋白酶的并用体系。基质蛋白为抗体的情况下，优选为单独使用胰蛋白酶、或在并用