利用高效液相色谱同时检测畜禽粪便中多种抗生素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗生素检测方法，具体为利用高效液相色谱同时检测畜禽粪便中 多种抗生素的方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素是指由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而获得的或是用化学合成法合 成的结构相同或类似的具有杀灭或抑制病原微生物的物质。近年来大量的抗生素作为兽药 和饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业中，在动物疾病防治、提高饲料转化效率、促进动物生 长发育方面发挥着重要作用。但是，通过口服或肌肉注射进入动物体内的抗生素并不能被 完全吸收利用，以原形或初级代谢产物的形式随尿或粪便排出体外的量约占用药量的 40% - 90%。因此，兽用抗生素极易随着粪尿等进入农田土壤等环境中，造成环境抗生素残 留以及耐药细菌的传播扩散，严重影响整个农业生态系统的安全，最终危及人类健康。建立 同时检测环境介质中多种抗生素的分析方法是研究其环境行为和生态环境风险的基础。
[0003] 环境残留的抗生素属于痕量物质，现有方法多采用高效液相色谱仪一质谱联用技 术进行研究，但该技术成本相对较高，目前对兽用抗生素残留量的检测研究多集中在动物 性食品领域，且检测的抗生素种类单一，清楚进入农田环境的畜禽粪便中多种抗生素残留 量，对确保生态环境安全具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术的抗生素检测方法成本高、检测抗生素种类少且停留在动 物性食品检测领域的缺点与不足，本发明提供一种利用高效液相色谱快速检测多种兽用抗 生素的方法。
[0005] 本发明以高效液相色谱仪为平台，建立了畜禽粪便中多种抗生素残留的检测方 法，同时检测多种兽用抗生素的方法在检测生态环境残留抗生素中的应用。特别是应用于 检测畜禽粪便中残留的11种抗生素。
[0006] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0007] 利用高效液相色谱同时检测畜禽粪便中多种抗生素的方法，包含以下步骤：
[0008] (1)对畜禽粪便样品进行预处理，得到待测液；
[0009] 将采集回的畜禽粪便样品冷冻干燥后，用EDTA-Mcllvaine缓冲液和有机混合提取 剂提取，提取液先用正己烷去脂，然后过活化后的HLB小柱进行富集：用25%甲醇溶液淋洗 HLB小柱去除部分杂质，并抽干5min，再用65%甲醇溶液洗脱富集的HLB小柱，洗脱液旋蒸吹 干，用初始流动相定容至lmL，过0.22μπι膜，得到待测液；
[0010] 所用EDTA-Mcllvaine缓冲液配制方法为：和Na2HP〇4分别配制成0 · lmol/L柠檬酸溶 液和0.2mol/L的溶液按照体积比8: 5混合，配制成Mcl lvaine溶液;取37.2g的Na2-EDTA与 Mcllvaine溶液中，配得0· lmol/L EDTA-Mcllvaine提取液，以HC1 或NaOH调至ρΗ=4·0;
[0011] 所用的有机混合提取剂为甲醇：乙腈:丙酮按照体积比2: 2:1混合，用Η3Ρ〇4调节pH 为4〇
[0012] (2)将待测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离；
[0013] 将待测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，测定的色谱条件为：
[0014] 米用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱：150mmX4.6mm，3.5ym，Agilent公司；二 元梯度栗;可变波长扫描紫外检测器;流动相A为0.1 %甲酸溶液，流动相B为甲醇与乙腈按 照体积比1:1;流速为0.6mL/min;进样体积20yL;柱温35°C;检测波长为274nm;梯度洗脱顺 序：0~18min，80%A ;18~20min，80%~40%A;20~30min，40%A;30~32min，40%~80% A;32 ~35min，80%A。
[0015] (3)计算分离出的残留抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残 留的含量；
[0016] 所述标准曲线依照步骤（1)、步骤(2)，采用相同的试剂以及参数，在相同实验条件 下得出。
[0017] 该方法用于同时检测11种抗生素，包括土霉素(0TC)、金霉素(CTC)、磺胺二甲嘧啶 (SDMe)、磺胺甲恶唑（SMZ)、磺胺噻唑（ST)、磺胺间甲氧嘧啶（SMN)、环丙沙星(CIP)、诺氟沙 星(N0R)、恩诺沙星(ENR)、泰乐菌素(TYL)、氯霉素(CAP)。
[0018] 本发明提供的利用高效液相色谱同时检测多种抗生素的方法，应用于畜禽粪便中 11种残留抗生素的检测，11种目标抗生素在高效液相色谱仪紫外检测器274nm波长下均具 有良好吸收，检测效果最佳，通过对流动相及各组分配比、流速、温度等条件的优化组合，确 定11种目标抗生素同时检测的最佳条件。与高效液相色谱仪一质谱联用技术相比，检测成 本较低;检测效率高，可以同时分离11种抗生素;分析物无主要干扰物干扰，基本不影响分 析物定性和定量。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0020] 利用高效液相色谱同时检测畜禽粪便中多种抗生素的方法的仪器条件如下：
[0021] 检测器为可变波长扫描紫外检测器即VWD，检测波长为274nm，柱温35°C，流速为 0.6mL/min，进样体积20yL，流动相A为0.1 %甲酸溶液，流动相B为甲醇/乙腈按照v/v为1:1 混合，梯度洗脱顺序：〇~18min，80%A;18~20min，80% ~40%A;20 ~30min，40%A;30~ 32min，40% ~80%A;32 ~35min，80%A。
[0022] 猪粪中11种抗生素残留的分离监测：
[0023] (1)所用仪器为美国安捷伦1200高效液相色谱仪，色谱柱规格为Agilent Eclipse Plus C18( 150mm X 4 · 6mm，3 · 5μπι)，可变波长扫描紫外检测器(VWD)，检测波长274nm，柱温35 °C，流速为0.6mL/min，进样体积20yL，流动相A为0.1 %甲酸溶液，流动相B为甲醇/乙腈按照 v/v为 1:1混合，梯度洗脱顺序：0~18min，80%A; 18 ~20min，80% ~40%A; 20 ~30min，40% 八；30~3211^11，40%~80%厶；32~3511^11，80%厶<^81161^ 12001^：工作站〇
[0024] (2)标准曲线的测定:准确称取11种目标抗生素标准品各1 Omg于1 OmL棕色容量瓶 中，诺氟沙星用0.03mol/L NaOH溶解并定容至10mL，其余10种抗生素目标物用甲醇溶解并 定容，配制成lmg/mL单标储备液，于4°C避光保存。准确移取各种单标储备液，用棕色容量瓶 配制11种抗生素浓度均为〇 .05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100mg/L的混合标准溶液，采 用步骤（1)的条件进行测试，得到工作曲线。11种抗生素的线性关系、相关系数及检出限见 表1。
[0025] (3) HLB小柱的活化:HLB小柱在使用前，先后用5mL甲醇、1 OmL纯水进行活化。
[0026] (4)畜禽粪便样品的预处理及测试:将采集回的猪粪样品，试验样品选用山西省寿 阳县一生态农场，在养殖过程中未使用抗生素，经检测不含抗生素目标物，冷冻干燥，研磨 过2mm筛，准确称取l.Og研磨样品，将11种抗生素混合于猪粪中得到混合猪粪样品，首先加 入10mLEDTA-Mcllvaine缓冲液祸旋混勾30s，常温超声15min，在4°C下8000r/min离心 15min，上清液转移至另外棕色容器中，重复提取一次，再用5mL有机混合提取液重复提取两 次，步骤同上。
[0027]合并提取液，加入10mL正己烷去脂后，过0.45μπι滤膜，将过膜后提取液使用旋转蒸 发仪浓缩至3-5mL，浓缩后的提取液以lmL/min流速过活化后的HLB柱，用5mL的甲醇和水v/v 为25: 75混合液淋洗HLB小柱，并抽干5min，用10mL的甲醇和水v/v为65: 35混合液洗脱目标 抗生素，收集洗脱液，于旋转蒸发仪上浓缩至干，用初始流动相定容至lmL，过0.22μπι膜，上 机待测，按照步骤(1)的条件进行高效液相色谱分离测试。
[0028] (5)对上述测试得到的曲线分析，对分离出的残留目标抗生素面积进行积分，依据 标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出残留的含量，计算回收率，添加回收率见表2。
[0029] 表1紫外检测器下11种抗生素线性关系、相关系数及检出限
[0030]
[0031] 表211种目标抗生素的回收率、标准偏差、检出限及定量限
[0032]
[0<
[0034] 注：ST-磺胺噻唑；CIP-环丙沙星；0TC-土霉素；NOR-诺氟沙星；SDMe-磺胺二甲嘧 啶;ENR-恩诺沙星；SMN-磺胺间甲氧嘧啶；SMZ-磺胺甲恶唑;CTC-金霉素;CAP-氯霉素;TYL-泰乐菌素。
【主权项】
1. 利用高效液相色谱同时检测畜禽粪便中多种抗生素的方法，其特征在于，包含以下 步骤： (1) 对畜禽粪便样品进行预处理，得到待测液； 将采集回的畜禽粪便样品冷冻干燥后，用EDTA-Mcllvaine缓冲液和有机混合提取剂提 取，提取液先用正己烷去脂，然后过活化后的HLB小柱进行富集：用25%甲醇溶液淋洗HLB小 柱去除部分杂质，并抽干5min，再用65 %甲醇溶液洗脱富集的HLB小柱，洗脱液旋蒸吹干，用 初始流动相定容至lmL，过0.22μπι膜，得到待测液； (2) 将待测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离； 将待测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，测定的色谱条件为： 米用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱：150mmX4.6mm，3.5ym，Agilent公司；二元梯 度栗;可变波长扫描紫外检测器;流动相A为0.1 %甲酸溶液，流动相B为甲醇与乙腈按照体 积比1:1;流速为0.6mL/min;进样体积20yL;柱温35°C;检测波长为274nm;梯度洗脱顺序:0 ~18min，80%A;18~20min，80%~40%A;20~30min，40%A;30~32min，40%~80%A;32 ~35min，80%A; (3) 计算分离出的残留抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的 含量； 所述标准曲线依照步骤（1)、步骤(2)，采用相同的试剂以及参数，在相同实验条件下得 出。2. 根据权利要求1所述的利用高效液相色谱同时检测多种抗生素的方法，其特征在于， 步骤（1)所述的EDTA-Mcllvaine缓冲液配制方法为:和Na 2HP〇4分别配制成0 · lmol/L柠檬酸 溶液和0.2mol/L的溶液按照体积比8: 5混合，配制成Mcllvaine溶液;取37.2g的Na2-EDTA与 Mcllvaine溶液中，配得0· lmol/L EDTA-Mcllvaine提取液，以HC1 或NaOH调至ρΗ=4·0; 所述的有机混合提取剂为甲醇：乙腈:丙酮按照体积比2:2:1混合，用Η3Ρ〇4调节pH为4。3. 根据权利要求1或2所述的利用高效液相色谱同时检测多种抗生素的方法，其特征在 于，该方法用于同时检测11种抗生素，包括土霉素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺 胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、泰乐菌素、氯霉素。
【专利摘要】本发明涉及一种抗生素检测方法，具体为利用高效液相色谱同时检测畜禽粪便中多种抗生素的方法，对畜禽粪便样品进行预处理，得到待测液，将待测液通过高效液相色谱仪进行分析物的分离，计算分离出的残留抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。该方法应用于畜禽粪便中11种残留抗生素的检测，与高效液相色谱仪—质谱联用技术相比，检测成本较低；检测效率高，可以同时分离11种抗生素；分析物无主要干扰物干扰，基本不影响分析物定性和定量。
【IPC分类】G01N30/34, G01N30/02
【公开号】CN105548392
【申请号】CN201510921060
【发明人】李兆君, 冯瑶, 张文娟
【申请人】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月11日