古德帕斯丘抗原结合蛋白检测和抑制以及其在糖尿病中的应用

古德帕斯丘抗原结合蛋白检测和抑制以及其在糖尿病中的应用
【专利说明】古德帕斯丘抗原结合蛋白检测和抑制从及其在糖尿病中的 应用
[0001 ]交叉引用
[0002] 本申请要求2013年9月27日提交的美国临时专利申请序列号61/883792的优先权， 该申请的全部内容通过引用并入本申请中。 技术背景
[0003] 基底膜胶原IV(a3NCl)的a3链的非胶原(NCl)结构域的构象部分取决于憐酸化作 用。古德帕斯丘抗原结合蛋白（Goodpasture Antigen Binding Protein) (GPBP) (WO 00/ 50607;W0 02/061430)是一种新型的非常规蛋白激酶，其能在其超分子组装的过程中催化a 3NC1结构域的构象异构化，导致基底膜中多种a3NCl构象异构体的产生和稳定化。GPBP水平 上升与非耐受化Q3NC1构象异构体(其导致了自身免疫反应介导古德帕斯丘(GP)病）的产生 有关。在GP患者中，抗a3NCl(也称为GP抗原）的自身抗体引起迅速发展的肾小球性肾炎并常 常引起肺出血，运两者是GP病的主要临床表现。
[0004] C0L4A3BP是用于调节细胞内部(如肌球蛋白）和外部(如胶原IV)的结构蛋白超分 子组织的基因。主要的基因产物GPBP(也称为GPBP-I或77kD GPBP)主要存在于细胞外区室 中，在细胞外区室中能够看到GPBP绕胶原IV循环或结合到胶原IV上。有趣的是，该基因也表 达可替换的异构体，其主要存在于细胞内并且溶于胞质溶胶（即，GPBP-2也称为GPBP A 26或 CERT)或者不可溶但与细胞膜和细胞器结合（即，GPBP-3也称为91kD GPBPKWO 00/50607; WO 2010/009856;Reved-Ros等人，2011，J Biol.Chem 286,35030-35043)。

【发明内容】

[0005] 在一方面，本发明提供用于治疗2型糖尿病(T2D)或限制T2D发生的方法，包括给有 需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于治疗T2D或限制T2D的发生。
[0006] 在另一方面，本发明提供用于治疗前驱糖尿病状态的方法，包括给有需要的受试 者施用有效量的GPBP抑制剂，包括但不限于抗GPBP抗体，用于治疗前驱糖尿病状态。
[0007] 在进一步的方面，本发明提供用于诊断前驱糖尿病状态的方法，包括：
[000引（a)确定来自有患上前驱糖尿病状态风险的受试者的样本的GPBP用量;和
[0009] (b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
[0010] 其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者存在前驱糖尿病状态。
[0011] 在另一方面，本发明提供用于诊断发生T2D的倾向的方法，包括：
[0012] (a)确定来自有患上前驱糖尿病状态风险的受试者的样本的GPBP用量;和
[0013] (b)将样本的GPBP用量与对照样本的GPBP用量相比；
[0014] 其中与对照样本相比，样本的GPBP用量增加表示受试者有发生T2D的倾向性。
【附图说明】
[001引图1.升高的细胞外葡萄糖水平诱导了GPBP表达。C2C12细胞在补充有2%马血清和 抗菌素的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium))中分化5天。培养物用PBS(憐酸盐缓冲盐水側洗并在含有指定浓度的葡萄糖的补 充有2%马血清的DMEM中另外解育24小时。细胞用PBS冲洗并在50mM Tris-HCl pH 7.0、 150mM化Cl、l%lYiton X-100、lmM PMSF(苯甲基横酷氣）、10mg/血亮肤酶素中在4°C裂解 30min。如其他地方所述的，通过离屯、（16000X g，5min，4°C)澄清裂解物，确定上清液的总蛋 白浓度(Bio-Rad)，并且近似量（5化g)的每种提取物利用抗-GPBP单克隆抗体(mAb)N27和 抗-微管蛋白（Sigma)进行蛋白质印迹分析。
[0016]图2.在增加的细胞外葡萄糖浓度下，GPBP激酶抑制增强葡萄糖消耗。A，将A549细 胞在含有指定浓度的葡萄糖W及10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养2地。然后将 细胞在25mM his-肥 1 pH 7.5、150mM 船(：1、1%化^〇11 X-100、0.1%SDS、lmM PMSF、10yg/ mL亮肤酶素、20mM化F在4°C裂解30min。通过在16,000xg离屯、5min(4°C)澄清裂解物并确 定上清液的总蛋白浓度(Bio-Rad)。近似量(5化g)的每种裂解物采用蛋白质印迹分析，使用 分别购自Cell Signaling TechnologyJibrostatin化和Sigma的初次抗体W及购自 Promega的HRP偶联的抗兔IgG和抗鼠 IgG第二抗体，W检测在Ser 318(P Ser 318AS160)、 GPBP和微管蛋白处憐酸化的AS160蛋白。采用Amersham E化Prime Western Blotting检测 试剂（Amersham E化 Prime Western Blotting Detection Reagent)(GE医疗生命科学（GE Healthcare Lifesciences)进行显影，并采用ImageQuant LAS4000Mini装置(GE医疗生命 科学)进行图像采集。B，将A549细胞在DMEM中培养1地，该DMEM是含有指定浓度的T12并补充 了 10%胎牛血清和青霉素/链霉素的F-12(315mg葡萄糖/化）。解育后，如同A中对细胞进行 裂解，并且同样地对上清液中的蛋白质浓度进行测定。利用Glucocard G+计（Arkray FactoryJnc.)在解育期的开始和结束时确定基质中的葡萄糖浓度，并利用相应裂解物的 蛋白质浓度计算细胞的葡萄糖摄取，用于归一化目的。利用阿霉素(〇.5山〇(数据未示出）能 得到类似结果，阿霉素是一种不同的GPBP激酶抑制剂(￥0/2014/006020)。(：，将4549细胞在 DMEM中解育20h，该DMEM是不含(对照)或含有T12(50iiM)并添加了 10%胎牛血清和青霉素/ 链霉素的F-12(315mg葡萄糖/化），并如同A中对细胞进行裂解。如同A中的，近似量(50蛇)的 每种裂解物采用蛋白质印迹分析，W检测在Ser 318(P Ser 318AS160)或微管蛋白处憐酸 化的AS160蛋白。
[0017]图3.在生理学细胞外葡萄糖浓度下，GPBP激酶抑制同样增强了葡萄糖消耗。C2C12 小鼠成肌细胞在补充有2%马血清和青霉素/链霉素的DMEM中10天分化成肌管，然后在添加 了 0.25%马血清、初始葡萄糖浓度115mgAlL、不含或含有T12(50iiM))的DMEM中在指示的时 间内进行解育。利用Glucocard G+计(Arkray Facto巧，Inc.)确定基质中的葡萄糖浓度。示 出的是平均值±SEM(n = 2)。根据t-学生试验分析（t-Student test analysis)，所示各组 之间的差异是统计学上显著的。冲= 0.0152;**冲= 0.0005。
[001引图4. Irs2-/-小鼠显示出增加的胶原IV表达。收集8-12周大的雄性的野生型(WT，n =9)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n = 9)小鼠 W及糖尿病Irs2-/-(n = 9)小鼠的肾脏， 包埋在石蜡中，利用来自EMD Millipore的抗-IV型胶原抗体进行切片的免疫组织化学分 析。当空腹血清葡萄糖水平大于120mgAlL时，认为小鼠患有糖尿病。在所示合成照片中，胶 原IV表达水平用黑色范围（未表达)和白色范围（表达)表示。示出的是代表图像。初始放大： x4000
[0019]图5.1rs2-/-小鼠显示出增加的C0L4A3BP表达.收集8-12周大的雄性的野生型(WT， n = 9)小鼠、血糖量正常的Irs2-/-(Irs2-/-，n = 9)小鼠 W及糖尿病Irs2-/-(n = 9)小鼠的肾 脏，包埋在石蜡中，利用来自Fibrostatin化的抗-GPBP HiAb N26进行切片的免疫组织化学 分析。当空腹血清葡萄糖水平大于120mgAlL时，认为小鼠患有糖尿病。在所示合成照片中， GPBP表达水平用黑色范围（未表达)和白色范围（表达)表示。示出的是代表图像。初始放大： x400〇
[0020] 图6.血糖量正常的Irs2-缺陷小鼠的循环GPBP水平得到提高。收集野生型(WT，n = 12)小鼠、血糖量正常的^32-/-(^32-/-，〇 = 12)小鼠^及糖尿病^32-/-(11=19)小鼠（8-12 周大)在被杀死时的血样，并使用基本上如在WO 2010/009856中描述的WmAb N26作为捕获 抗体、WmAb N27作为检测抗体的原型夹屯屯LISA测量循环GPBP水平。当空腹血清葡萄糖水 平大于120mg/化时，认为小鼠患有糖尿病。冲<0.05，林冲<0.0 Ol。
[0021] 图7.对10周大小鼠的血糖的抗GPBP治疗的效果。不同组的小鼠一周一次接受腹膜 内注射的化g/g体重的抗-GPBP mAb N26或小鼠 IgG(Sigma)，并利用血糖测试仪每周监测空 腹血糖(尾静脉）。雄性经治疗的野生型(WT+mAb N26，n = 2)，野生型对照(WT+Cont IgG，n = 2)，经理的Irs2-/-化0+mAb 26，n = 2)，Irs2-/-对照化0+Cont IgG，n = 2)。雌性经治疗的野生 型(n = 2)，野生型对照(n = 2)，经治疗的Irs2-/-(n = 3)，Irs2-/-对照(n = 2)。
【具体实施方式】
[0022] 所有引用的参考文献的全部内容通过引用并入本申请中。在本申请中，除非另有 说明，采用的技术能够在任意公知的参考文献中找到，比如：MoIecular Cloning = A Laboratory M曰nu曰1(S曰mbrook,et 曰11989,Cold Spring Harbor Laboratory Press) (分子克隆：实验室手册（Sambrook等人，1989，冷泉港实验室出版社））、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press，San Diego,CAK基因表达技术(酶学方法，第185卷，D.Goeddel编辑，1991，学术出版 社，圣地亚哥，加利福尼亚州））、"Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology(M.P.Deutshce;r,ed. , (1990)Academic Press,Inc.)(《酶学方法》中的《蛋白质 纯化指南》，（M.P.Deutshcer编辑，（1990)学术出版社公司））、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA)(PCR实 验指南：方法和应用指导（Innis等人，1990,学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州））、 Culture of Animal Ce I Is:A Manual of Basic Technique , 2nd Ed. (R. I. Freshney . 1987丄iss，Inc . New York，NY)(动物细胞培养：基本技术指南，第二版 (R.I.Freshney, 1987，Liss公司，纽约市，纽约州））、Gene Transfer and Expression Protocols ,PP.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)(Gene Transfer and Expression Protocols，109-128页，E.J.Murray编车茸，The Humana Press Inc,克利夫顿，新泽西州）和the Ambion l998&1:alog(Ambion,Austin,TX)。
[0023] 除非本申请另有明确地说明，本申请中使用的单数形式的"一 (a)"、" 一个(an)"和 "所述(the)"包括复数指代。本申请中使用的"和"能够与"或"互换使用，除非另有明确地说 明。
[0024] 除非上下文中另外明确指出，所公开的用于本发明的一个方面的实施例也能够在 本发明的其他方面中使用，并且能够与在本发明其他方面中公开的实施例组合使用。
[0025] 在一方面，本发明提供用于治疗T2D的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的 GPBP抑制剂，用于治疗T2D。在该方面中，所述受试者是已经被确诊患有T2D。在另一方面，本 发明提供用于限制T2D发生的方法，包括给有需要的受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于 限制T2D的发生。在该方面中，所述受试者可W是任何有发生T2D风险的受试者，包括但不限 于那些带有一种或多种危险因素的受试者，所述危险因素选自，包括但不限于，肥胖、久坐 不动的生活方式、较差的饮食习惯(例如:脂肪过多、纤维素不足、太多简单碳水化合物等）、 前驱糖尿病状态和/或T2D家族史、年龄50或更大、高血压、高胆固醇W及妊娠期糖尿病史。
[0026] 在进一步的方面，本发明提供用于治疗前驱糖尿病状态的方法，包括给有需要的 受试者施用有效量的GPBP抑制剂，用于治疗前驱糖尿病状态。在该方面中，所述受试者是患 有前驱糖尿病状态的。如在本发明中使用的，"前驱糖尿病状态(pre-diabetic state)"是 满足了糖尿病诊断标准中的一些而不是全部诊断标准的状态。因此，前驱糖尿病状态可W 包括：1)具有空腹葡萄糖耐量受损，其是一种0-细胞对口服葡萄糖负荷（oralglucose challenge) (OGT)的响应是有缺陷的病症，或者2)具有一直升高的空腹葡萄糖（IFG)，其是 一种空腹血糖高于被认为是正常的水平但并未高到足W被分类为糖尿病的病症。前驱糖尿 病状态与膜岛素抵抗和增加的屯、血管病变风险有关。具有前驱糖尿病状态的个体其有相对 较大的发生T2D的风险。
[0027] 如在本发明中使用的/'GPBP"是指任何GPBP同种型（isoform)，即：GPBP-USEQ ID 側：10)、6?8?-2(569 10側：11)和6?8?-3(569 10側：12)。6?8?-1(也称为771^)0?8?)主要 在细胞外区室中存在，在细胞外区室中能够看到其绕胶原IV循环或结合到胶原IV上。GPBP-2(也称为GPBP A 26或CERT)是通过mRNA可变外显子剪接产生的598残基长度的GPBP-I变体， 主要在细胞内和细胞质中存在。GPBP-3(也称为91kD GPBP)是707个残基长度的GPBP-I变 体，其来自另一非典型的mRNA翻译起始，其仍然主要在细胞内且与细胞膜有关(包括质膜和 细胞器的外层）。
[002引如本发明中使用的，"GPBP抑制剂"指能降低所有或个别GPBP同种型的活性或表达 的任意化合物或分子。
[0029] 如本发明人在下述实例中证明的，GPBP-I介导(mediate) 了动物模型的T2D发病机 理并且GPBP-I活性的抑制延迟或预防了高血糖症。因此，GPBP-I表达或活性抑制剂能用于 治疗或限制T2D的发生，或者用于治疗那些患有糖尿病或前驱糖尿病状态的患者。本发明人 近期发现(数据未示出)GPBP-1参与了通过一循环相关的至少3个关键活性点：蛋白激酶(细 胞质，最终细胞核和内质网）、陪伴分子（内质网）和炎症"细胞因子"（细胞外分室）。朝向细 胞外部的循环进程部分通过GPBP-3表达的调节(W02010/009856)并且由于细胞外GPBP-I再 次被捕获且返回到细胞质而完成。证据还表明GPBP-2表达能弥补体内GPBP-I缺陷(Revert-Ros等人，2011，J Biol.Chem 286,35030-35043)支持了GPBP-2表达在某种程度上有助于 GPBP循环的正常进程。GPBP循环在细胞内阶段和细胞外阶段的存在表明由细胞质中的超常 活性引起的病症会直接受到抑制剂化合物的干扰，但也会间接地或者受到ER中活性的抑制 剂的干扰或者受到阻碍细胞外活性的抗体的干扰;反之，由细胞外超常活性引起的病症会 直接受到阻断抗体的影响并且会间接受到细胞内活性的抑制剂的干扰。因此，根据GPBP循 环，可W使用GPBP任意同种型的抑制剂(GPBP-UGPBP-2和/或GPBP-3)来治疗或限制T2D的 发生，或者治疗那些患有糖尿病或前驱糖尿病状态的患者。
[0030] 在所有方面和实施例中，受试者可W是任何哺乳动物，包括但不限于人、狗、猫、马 或家畜（牛、羊等）。在最优选的实施例中，所述受试者是人类受试者。
[0031] 如本发明中使用的，"治疗（treat)"或"治疗（treating)"是指实现下述中的一个 或多个：（a)减轻病症的严重程度；（b)限制或预防具有待治疗病症特征的症状或并发症的 发生；（C)抑制具有待治疗病症特征的症状或并发症的恶化；（d)限制或预防先前出现病症 症状的患者的症状或并发症的复发。
[0032] 可W采用本发明的方法限制T2D的症状和并发症，包括但不限于高血糖症、膜岛素 抵抗、糖尿病性肾病变、糖尿病神经病变、糖尿病性视网膜病、蛋白尿、肾小球清除率受损 (impaired glomerular clearance )、糖尿病循环障石寻（diabetic circulatory disorders) W及肾衰竭。运些症状/并发症中的任意数量得到限制对于患有T2D的受试者都 有非常大的益处。
[0033] 本发明的方法能够用于治疗患有前驱糖尿病的受试者，例如通过限制/减缓受试 者高血糖症、膜岛素抵抗和/或屯、血管病变的发展，和/或通过限制/减缓受试者向T2D的发 展。
[0034] 在一个实施例中，受试者与对照相比具有增加的循环GPBP。该实施例可W帮助识 别从该治疗中获益最多的受试者。该"增加"是与对照（比如来自正常受试者的对照样本，或 在对照群中先前确定为"正常"水平GPBP的对照样本)相比任意量的GPBP增加，例如，5 %、 10%、15%、20%、25%、50%、75%、100%或更大。在一个实施例中，作为标准曲线参考的 GPBP正常值是在血浆中小于lOng/ml。在不同的实施例中，正常GPBP范围是在血浆中为~ Ing/ml至lOng/ml之间。因此，在一个实施例中，受试者经鉴定其血浆中含有超过lOng/ml的 GPBP时采用根据本发明的方法治疗。确定循环GPBP量的方法是已知的（参见WO 2010/ 009856和US 7935492)。
[0035] 任何合适的GPBP抑制剂可W用于本发明的方法中。在一个实施例中，GPBP抑制剂 包括抗-GPBP抗体，比如单克隆抗体或多克隆抗体。如在本发明中使用的，"抗-GPBP抗体"表 示结合至所有或单独的GPBP同种型的抗体。在能与任意其他实施例组合的优选实施例中， 该抗体是单克隆抗体，比如人源化单克隆抗体。本发明中使用的术语"抗体"旨在包括选择 性与本发明的多肤或其片段反应的抗体片段。使用常规技术或使用重组DNA通过基因工程 合成可W使抗体片段化，并且用与上述用于完整抗体同样的方法对片段进行用途筛选。例 如，F(ab'）2片段通过用胃蛋白酶处理抗体产生。得到的F(ab'）2片段能用木瓜蛋白酶处理 W生成化b片段。单克隆抗体片段的实例包括（i)Fab片段，基本由化、VH、CL和CHl结构域组 成的单价片段；（ii)F(ab)2和F(ab'）2片段，包含两个由较链区的二硫桥连接的Fab片段的 二价片段；（iii)Fd片段，基本由VH和CHl结构域组成；（iv)Fv片段，基本由单臂抗体（比如 scFV、串联二-scFV、二抗体、S抗体等）的化和VH结构域组成；（v)dAb片段，（Ward等人， (1989)