一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法
【专利摘要】本文发明了一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，成像免疫传感器用硅烷化的可抛式玻片制得，将不同鸡细胞因子捕获抗体用共价结合的方式包被于相应结合位点，信号分子辣根过氧化物酶与标记抗体共同固定在金纳米粒子上，实现信号放大。基于夹心免疫反应，每一个检测位点捕捉到的HRP会触发化学发光，信号由电荷耦合器CCD收集，用于多种鸡细胞因子的同时检测。这种方法具有高通量、易操作、低成本等优点，可实现对多种鸡细胞因子的同时检测，其稳定性，可重复性及准确性使多种鸡细胞因子的化学发光成像免疫检测技术在禽类疾病检测中显示了很好的应用前景。
【专利说明】
一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及 分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫学领域、化学发光分析和禽类细胞因子检测等领域，具体涉及了 一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法。
【背景技术】
[0002] 自 1997年Halman提出化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay， CLIA)以来，该方法分析速度快、线性范围宽、无散射光干扰、无放射性污染、仪器设备简单、 标记物有效期长、重复性好，因此40年间在临床诊断、生命分析等领域得到了广泛应用。在 实际的应用中，常常需要检测低丰度待测物样品，因此，高灵敏的化学发光免疫分析法，是 近年来化学发光免疫分析方法发展的主要方向。为提高免疫分析的灵敏性，通常借用纳米 材料作为信号放大的载体。
[0003] 细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分 子多肽。分为干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、集落刺激因子、生长因子等。细 胞因子在体内通过自分泌、旁分泌或内分泌等方式发挥作用，具有重叠性、多效性、协同性、 拮抗性等多种生理特性，构成复杂的细胞因子调节网络，参与机体多种重要的生理功能。今 年来化学发光免疫分析成为一种重要的临床检测手段，具有灵敏度高及特异性强等优点， 对鸡细胞因子的体外临床检测具有重要的应用价值。
[0004] 目前多组分免疫分析成像技术在免疫分析领域中引起了人们极大地研究兴趣。即 在单个分析流程中可以同时或近同时实现多种组分的检测，极大简化操作过程，具有分析 通量高、所需时间短、样品消耗少、分析成本低等显著优势。通常多组分免疫检测方法主要 可分为空间分辨和多标记物两种模式。多标记物模式需要同时从不同标记处检测不同信 号，因此会因信号干扰而不能准确定量，而且多标记物很难同时达到最优条件。很多多标记 技术报道克服这一困难，但因受囿于标记物数量，对多种蛋白的检测依然困难。因此一种基 于丝网印刷技术在硅烷化载玻片上印刷了4X12的免疫传感阵列，与金纳米粒子负载HRP标 记抗体信号放大策略结合，利用电感耦合CCD同时检测不同细胞因子的化学发光信号，实现 对多种鸡细胞因子的检测，发展了一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制 备及分析方法
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备 及分析方法，其基本思路是：首先借助丝网印刷技术在硅烷化载玻片上印刷了 4X12的阵 列，然后将不同鸡细胞因子的捕获抗体共价键合免疫阵列的不同行，牛血清蛋白封闭后制 得多种鸡细胞因子同时检测的化学发光传感器，其后在每个微孔中滴入相应的抗原样品， 再滴入酶标记的相应的金纳米粒子信号放大探针，形成捕获抗体-抗原-酶标抗体三层夹心 免疫复合物，最后通入化学发光底物，利用电感耦合CCD同时检测不同鸡细胞因子的化学发 光信号，利用化学发光信号的增强和抗原浓度直接的线性关系，实现对抗原样品的检测。是 一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫分析方法
[0006] 为了达到上述目的，本发明技术方案如下：
[0007] 本发明构建了一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析 方法，其特征在于:在环氧硅烷化的载体片上制备化学发光免疫传感阵列，其中，免疫传感 阵列的制备是基于丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷层的载玻片表面制备反应阵列，所 述多种鸡细胞因子化学发光免疫传感器界面包括带有氨基的不同鸡细胞因子捕获抗体和 壳聚糖包，括以下步骤：
[0008] 利用丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷化的载玻片表面制作反应阵列；
[0009] 取不同的鸡细胞因子捕获抗体分别滴涂在免疫阵列的不同行，室温下反应后，再 放置在4°C下直至晾干，磷酸盐缓冲溶液冲洗;继续滴涂封闭缓冲液在4°C封闭，磷酸盐缓冲 溶液冲洗后即得到该多种鸡细胞因子的免疫传感器；
[0010] 将不同的鸡细胞因子抗原样品滴入相应的免疫传感阵列的微孔中，温育后，再分 别滴入相应的纳米金信号放大探针，夹心免疫反应后，通入发光底物后，利用电感耦合CCD 同时检测不同细胞因子的化学发光信号。
[0011] 该免疫传感阵列能同时检测多种鸡细胞因子，如:鸡白介素2(ChIL-2)、鸡白介素4 (ChIL-4)、鸡γ干扰素(ChIFN-γ )、鸡β干扰(ChIFN-β)等，具有高通量、高灵敏检测多种鸡 细胞因子的能力，可应用于禽类疾病的全面快速诊断。
[0012] 本发明还提供了一种制备检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的方法。 其中，这种免疫传感器通过简单的丝网印刷技术在硅烷化载玻片上制作，可抛式阵列包含 48个检测位点（4排X 12列），该免疫阵列能同时检测多种细胞因子样品，具有高通量、高灵 敏检测多种鸡细胞因子的能力，可应用于禽类疾病的全面快速诊断。其中，所采用的载玻片 为玻璃片。
[0013] 制备一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的方法包括下述步骤：
[0014] (1)载玻片用水虎鱼酸活化，使其表面带有氨基，用水冲洗并用氮气吹干后，用含 1 % GPTMS的甲苯溶液在室温下浸泡过夜，使之硅烷化；
[0015] ⑵制备一层4排X 12列格式48孔的疏水性无光活性膜，形成的孔(活性位点）可以 盛装免疫反应所需的抗体和试剂；
[0016] (3)将不同的鸡细胞因子的捕获抗体均匀滴在四排环氧硅烷化的位点，室温下反 应后，再放置4°C下直至晾干，然后用磷酸缓冲溶液冲洗。
[0017] (4)将作为封闭液的牛血清白蛋白溶液，滴在步骤(3)中得到的载玻片表面，进行 封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，即得免疫传感阵列。
[0018] 其中，步骤（1)中，载玻片用水虎鱼溶液中￥〇4与30%!12〇2的体积比为7 :3，载玻片 用水虎鱼溶液活化12小时;步骤(2)中，所述疏水性无光活性膜借助模板通过丝网印刷技术 印刷在硅烷化处理的载玻片上;所述疏水性无光活性膜内形成的孔直径2mm，边缘间距4mm。 如图1所示，图中载玻片灰色不过为印刷的具有疏水剂作用的绝缘油漆，白色部分为环氧硅 烷化的阵列微孔。
[0019] 其中，步骤(3)中可固定的多种鸡细胞因子捕获抗体，如:鸡白介素2 (ChIL-2)、鸡 白介素4(ChIL-4)、鸡γ干扰素(ChIFN-γ )、鸡β干扰(ChIFN-β)等，具有高通量、高灵敏检测 多种鸡细胞因子的能力，可应用于禽类疾病的全面快速诊断。
[0020] 其中，步骤(3)中，所述两种不同鸡细胞因子的捕获抗体的浓度均是50yg/mL;在4 °C温育过夜。
[0021] 其中，步骤(4)中，所述封闭液为质量分数为1.0-5.0%牛血清蛋白溶液，在4°C下 进行封闭。
[0022] 本发明还提供了一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫分析方法，包括如下 分析步骤：
[0023] (a)将不同的鸡细胞因子抗原标准液分别用pH 7.4的0.01M PBS溶液稀释至不同 浓度，加入到免疫传感阵列的相应排不同的检测位点，在线温育；
[0024] (b)用PBST清洗载玻片并吹干后，加入不同鸡细胞因子的纳米金信号放大探针于 相应位点反应25min，后清洗吹干；
[0025] (c)将化学发光底物混合液加入检测点触发化学发光反应，利用电感耦合CCD同时 检测不同细胞因子的化学发光信号。
[0026]采用下述分析步骤来验证其实际应用价值。
[0027] (d)在通过测定回收率来考察本发明的准确性与实际应用价值。回收率的测定是 通过分别加入0.01、0.02、0.04、0.08、0.1 Ong/mL鸡细胞抗原样品于血清样品中来测定的。 [0028] 可选地，上述步骤(a)(b)(c)(d)中滴入反应位点的体积为5yL。
[0029] 可选地，上述步骤(b)中，纳米金信号放大探针是通过将信号分子辣根过氧化物酶 (HRP)以高摩尔比与分别与不同的鸡细胞因子标记抗体共同固定在金纳米粒子上制备形成 相应的纳米金信号放大探针，以实现信号放大。
[0030] 可选地，上述步骤(b)中酶标记不同细胞因子抗体的浓度均为lOOyg/mL，金纳米粒 子浓度2nM。
[0031] 可选地，上述步骤(c)(d)中所得到的CCD照相机所收集的不同细胞因子的化学发 光信号由分析软件(AlphaView SA)自动识别，直接读出每个光斑的化学发光强度。
[0032]本发明达到了如下有益效果：
[0033] 本发明成功的构建了一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器及分析 方法，该发明首先借助简单的丝网印刷技术在硅烷化载玻片上制作化学发光免疫传感阵 列，通过载玻片上的环氧基和捕获抗体带有的氨基共价结合，将捕获抗体修饰在载玻片上。 构建了一种能同时检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器。当通入抗原和酶标抗体 后，基于夹心免疫反应，每一个检测位点捕捉到的HRP会触发化学发光，利用电感耦合CCD同 时检测不同细胞因子的化学发光信号，用于多种鸡细胞因子的同时检测。
[0034] (1)本发明采用丝网印刷技术在载玻片上制的可抛式化学发光免疫传感器阵列， 修饰抗体后制得多种鸡细胞因子的化学发光成像免疫传感器，相比于平行多次单组分分 析，多组分免疫分析方法可以提高检测通量，缩短检测时间，减少样品消耗和检测成本。 [0035] (2)本发明利用化学发光成像免疫分析技术，借助捕获抗体、抗原和酶标抗体形成 双抗体夹心复合结构，结合电感耦合CCD检测不同细胞因子的化学发光信号，构建了良好的 化学发光成像免疫分析系统，打破了禽类细胞因子传统生物检测法，具有高通量、低成本、 少消耗、易操作且对特定鸡细胞因子的联合检测具有高灵敏性。
【附图说明】
[0036] 图1 一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备和免疫分析示意 图。
[0037] 图2为本发明ChIL-4，ChIFN-y标准样品检测曲线。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明进一步说明 [0039] 实施例1
[0040] -种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，首先采用 丝网印刷技术在硅烷化的载玻片上制作免疫传感阵列，通过载玻片上的环氧基可以将带有 氨基的不同鸡细胞因子的捕获抗体分别固定在不同行。接下来将抗原样品滴入相应微孔 中，温育后分别滴入相应的纳米金信号放大探针，通过抗原抗体特异性识别形成夹心免疫 反应，通入发光底物后，传感器上捕获的大量酶可以催化发光，结合电感耦合CCD检测不同 细胞因子的化学发光信号，利用化学发光信号的增强和抗原浓度直接的线性关系，实现对 抗原样品的检测。
[0041] 丝网印刷属于孔版印刷，其原理是：采用纸膜版或其它版的版基上制作出可通过 油墨的孔眼为模版，在印刷时通过一定的压力使油墨通过孔版的孔眼转移到承印物纸张、 玻璃、陶瓷等上，形成图象或文字，在本领域中，使用者都可以根据使用需求，通过调整模板 中孔眼参数，设计符合要求的模板。
[0042]本发明提供了的方法可用于检测ChIL-4，ChIFN-y，免疫传感阵列包括了4排X12 列格式共计48个检测位点，每个位点直径2111111。〇111^-4,〇11?^丫的捕获抗体分别固定在不 同行。每一列可以用于同时检测单个样品的2种抗原，因此12列可以同时检测12个样品各自 所含有的2种细胞因子，可同时检测24个样品。其特征在于该ChIL-4，ChIFN-y多种鸡细胞 因子化学发光成像免疫分析方法的实施包括以下步骤：
[0043] (1)将载玻片用水虎鱼溶液(H2S〇4/30%H2〇2,7:3体积比）活化12小时使其表面带 有羟基，用水冲洗并用氮气吹干后，用GPTMS/甲苯溶液在室温（25°C)处理过夜，使之硅烷 化。然后依次用甲苯和乙醇冲洗从表面除去物理吸附的硅烷，洗净后氮气吹干。
[0044] (2)-层4排X 12列格式48孔的疏水性无光活性膜(直径2mm，边缘间距4mm)，借助 模板通过丝网印刷技术印刷在处理过的载玻片上，形成的孔可以盛装免疫反应所需的抗体 和其它试剂。
[0045] (3)取50yg/mL ChIL-4，ChIFN-y的捕获抗体分别滴在四排环氧硅烷化的位点，4 °(：温育过夜。玻片以冲洗缓冲液冲洗后，氮气吹干。
[0046] (4)将1.0%牛血清蛋白溶液5yL加至各检测位点反应过夜封闭未反应的环氧基。 最后，免疫传感用冲洗缓冲液清洗，制的该检测多种鸡细胞因子的化学发光免疫传感器。 [0047] 实施例2
[0048]对实施例1中所获得的一种检测多种鸡细胞因子化学发光传感器进行成像免疫分 析方法包括：
[0049] 1.制作线性关系的标准曲线
[0050] (1)将5yL ChIL-4和ChIFN-γ不同浓度的标准样品加入到相应排不同的检测位 点，在线温育20-30min，清洗吹干。
[0051 ] (2) 5yL的酶标记的ChIL-4抗体，酶标记的ChIFN- γ抗体分别加入相应位点反应 20_30min，后清洗吹干·
[0052] (3)5yL化学发光底物混合液加入检测点触发化学发光反应;这些化学发光信号可 以同时被CCD照相机收集，动态积分方式曝光20min，所得到的发光点则由分析软件 (AlphaView SA)自动识别，直接读出每个光斑的化学发光强度。
[0053] 如图2所示，测定不同浓度的Ch IL-4和Ch IFN- γ标准样品，分别制得Ch IL-4和 ChIFN- γ标准样品的线性曲线。
[0054 ] 2.对样品进行测定
[0055] 为考察该方法的准确性与实际应用价值，通过分别加入0.01、0.02、0.04、0.08、 0.10ng/mL ChIL-4于血清样品中来测定其回收率，回收率如表1在96.3%-108%(η = 5)之 间，结果表明该传感器在实际样品检测中具有较好的准确性。
[0056] 表1 ChIL-4蛋白回收率测定
[0057]
[0058]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟 悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实 施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之 内。
【主权项】
1. 一种检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于 以下步骤： (1) 利用丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷化的载玻片表面制作反应阵列； (2) 取不同的鸡细胞因子捕获抗体分别滴涂在免疫阵列的不同行，室温下反应后，再放 置在4°C下直至晾干，磷酸盐缓冲溶液冲洗;继续滴涂封闭缓冲液在4°C封闭，磷酸盐缓冲溶 液冲洗后即得到该多种鸡细胞因子的免疫传感器； (3) 将不同的鸡细胞因子抗原样品滴入相应的免疫传感阵列的微孔中，温育后，再分别 滴入相应的纳米金信号放大探针，夹心免疫反应后，通入发光底物后，利用电感耦合CCD同 时检测不同细胞因子的化学发光信号。2. 如权利要求1所述的能同时检测多种鸡细胞因子高通量阵列传感器的制备和分析方 法，其特征在于，该免疫传感阵列能同时检测多种鸡细胞因子，如:鸡白介素2(ChIL-2)、鸡 白介素4(ChIL-4)、鸡γ干扰素(ChIFN-γ )、鸡β干扰(ChIFN-β)等，具有高通量、高灵敏检测 多种鸡细胞因子的能力，可应用于禽类疾病的全面快速诊断。3. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于所述纳米金信号放大探针是通过将信号分子辣根过氧化物酶(HRP)分别与 不同的鸡细胞因子标记抗体共同固定在金纳米粒子上制备形成相应的纳米金信号放大探 针，以实现信号放大。4. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于，步骤（1)中，环氧硅烷化的载玻片通过以下步骤制备:将载玻片在水虎鱼酸 中浸泡，7义虎鱼酸为H2SO4: Η2〇2 = 7 :3，v/v;再用去离子水充分冲洗后，在氮气气氛中吹干； 再将载玻片置于含1%GPTMS的甲苯溶液中，室温下浸泡，先后用甲苯和无水乙醇冲去物理 吸附的GPTMS并在氮气氛围中吹干。5. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于，步骤(1)中制备的传感阵列拥有为4 X 12阵列微孔，微孔直径为2mm，边缘间 距为4mm 〇6. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于，步骤(2)中，所固定的不同鸡细胞因子的捕获抗体浓度均为50yg/mL。7. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于，步骤(2)中，封闭缓冲液为1%-5%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲溶液。8. 如权利要求3所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于所述纳米金信号放大探针中酶标记不同鸡细胞因子抗体的浓度均为l〇〇yg/ mL，金纳米粒子浓度2nM。9. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析方 法，其特征在于，步骤(3)中，滴入抗原样品后的温育时间为30min，滴入相应的纳米金信号 放大探针后的温育时间为25min。10. 如权利要求1所述的检测多种鸡细胞因子化学发光成像免疫传感器的制备及分析 方法，其特征在于，步骤(3)中所得到的不同鸡细胞因子的化学发光信号由电荷耦合器CCD 收集并通过分析软件AlphaView SA自动识别，直接读出每个光斑的化学发光强度。
【文档编号】G01N33/552GK105866105SQ201610211811
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】杨占军, 卢咪咪, 李娟
【申请人】扬州大学