基于zeb-1和zeb-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于ZEB?1和ZEB?2作为标记物预警乳腺癌转移的方法,首先提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本，对石蜡标本进行切片和HE染色，然后分别采用免疫组织化学法和分子杂交技术检测肿瘤组织中ZEB?1、ZEB?2的蛋白表达和mRNA表达，若患者肿瘤组织中ZEB?1、ZEB?2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。本发明通过将ZEB?1和ZEB?2作为标记物，对患者乳腺癌转移和复发进行预警，为乳腺癌的合理治疗提供新依据，从而可以对乳腺癌患者进行针对性治疗，大大提高了治疗效果，改善了患者的预后，进而提高了患者的生活质量。
【专利说明】
基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法
技术领域
[0001] 本发明属于医学病理学技术领域，涉及一种预警乳腺癌肿瘤转移和复发的标记 物，具体是一种基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质之间的一系列复杂、多步 骤相互作用的结果，是一个多阶梯瀑布进程。其中，尤以病灶局部基底膜完整性的破坏、细 胞外基质降解和肿瘤细胞上皮 -间质转化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)两 个方面是肿瘤发生侵袭转移的重要条件。EMT在肿瘤演进过程中发挥了重要作用，它是指上 皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞分化的现象，研究发现晶状体上皮细胞在 胶原凝胶中可形成伪足，转变为间质细胞样形态，获得移行能力。EMT的核心就是E-钙粘蛋 白（E-cadherin)的缺失，导致上皮细胞失去极性和细胞与细胞间的粘附作用不稳定，以及 细胞骨架、细胞角蛋白（cytokeratin)、波形蛋白（Vimentin)的改变，并使环连蛋白从复 合体上解离，从而实现肿瘤细胞从原发灶中的分离。通过对胚胎发育的研究证实，EMT是一 个可逆的过程，当脱落肿瘤细胞到达异位器官后会再分化，发生间质-上皮转化 (Mesenchymal-epithelial transitions，MET)，以长期存活并形成为转移灶。ZEB-1 (zinc-finger E-box-binding homeobox-1)和ZEB_2(zinc-finger E-box-binding homeobox-2) 都是锌指结构蛋白，广泛的存在于各种生物体内，是一类核转录因子，能够调控下游靶基因 的转录，ZEB-1和ZEB-2均可通过与E-钙粘蛋白上保守的E2-boxes结合使其转录下调，从而 导致HMT。
[0003] 目前，对于乳腺癌手术后患者进行治疗(放疗或药物治疗）的原则主要根据手术切 除肿瘤组织的病理学检查（如淋巴结转移状况、雌孕激素表达状况、临床分期等)和患者自 身身体状况等做出。在术后治疗过程中，由于缺乏预测、预警和早期发现体内转移和复发灶 的生物学标志物，丧失了针对性治疗的最佳良机。一旦等到临床上发现转移灶或复发灶(如 乳腺癌骨转移、脑转移等），患者已经达到癌症晚期，治疗效果和机体耐受治疗的能力已经 大打折扣，同时也大大增加了患者的痛苦和经济负担。
[0004] 现有的标记物如CA15.3，CA27.29和CEA等由于敏感性和特异性不高，尚未在临床 诊疗中应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方 法，为提示乳腺癌转移和复发提供生物学标记物，从而为乳腺癌的合理治疗提供新依据。
[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007] 基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，该方法将ZEB-1和ZEB-2作 为标记物，对乳腺癌转移进行监测和预警；
[0008]该方法包括如下步骤：
[0009] A.提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本；
[0010] B.对石蜡标本进行4WI1厚连续切片，对切片采用HE染色；
[0011 ] C.采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达；
[0012] D ?采用原位分子杂交技术检测肿瘤组织中ZEB-1和ZEB-2的mRNA表达；
[0013] E.分别观察经过免疫组织化学法检测和原位分子杂交技术检测的患者肿瘤组织 切片，两种方法检测的ZEB-UZEB-2指标均以肿瘤组织细胞核和/或细胞浆呈黄色或棕黄色 记为阳性表达，若患者肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示 患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。
[0014]进一步地，所述的免疫组织化学法包括以下步骤：
[0015] a.将石蜡切片放入60 °C恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上；
[0016] b.将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟;置于无水乙醇中浸泡5分钟;置入95 %乙醇中浸泡5分钟;置入70 %乙醇中浸泡5分钟； 置入蒸馏水中浸泡5分钟；
[0017] c.采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复:将脱蜡水化的组织切片置 于耐高温切片架上，同时将PH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅中加热至沸腾，再将切片架 放入已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入 凉水中冷却直至室温，将切片取出；
[0018] d.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；
[0019] e.切片分别滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗试剂，置于4°C环境下过夜；
[0020] f.次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去roS缓冲 液；
[0021] g.滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗和鼠IgG聚合物，在37°C环境下孵 育20分钟；
[0022] h.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；
[0023] i.每张切片滴加50ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色；
[0024] j .置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝；
[0025] k.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
[0026] 进一步地，所述的原位分子杂交技术包括以下步骤：
[0027] a.将石蜡切片放入60 °C恒温烤箱过夜；
[0028] b.将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟;置于无水乙醇中浸泡5分钟;置入95 %乙醇中浸泡5分钟;置入70 %乙醇中浸泡5分钟； 置入DEPC水中浸泡5分钟；
[0029] c.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；
[0030] d.用3%双氧水室温作用10分钟，用DEPC水冲洗3次，每次冲洗5分钟；
[0031] e.用3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶在37°C环境下消化20分钟；
[0032] f.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，用DEPC水冲洗1次；
[0033] g.滴加预杂交液50ul/片，置入40°C_42°C恒温箱4小时，然后甩去多余液体；
[0034] h.再次滴加杂交液50ul/片，置入40°C-42°C恒温箱16-20小时；
[0035] i .用37°C预温的2 X SSC缓冲液冲洗2次，每次冲洗5分钟，再用37°C预温的0.5 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，再用37 °C预温的0.2 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5 分钟；
[0036] j .滴加封闭液，在37 °C环境下放置30分钟，然后甩去多余液体；
[0037] k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37°C环境下放置60分钟，然后用0.5M PBS缓冲液 冲洗3次，每次冲洗5分钟；
[0038] 1.滴加SABC，在37 °C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲 洗5分钟；
[0039] m.滴加生物素化过氧化物酶，在37°C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液 冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；
[0040] n.每张切片滴加100ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色；
[0041 ] 〇.置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝；
[0042] p.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
[0043]本发明的有益效果:本发明通过将ZEB-1和ZEB-2作为标记物，对乳腺癌是否转移 进行监测和预警，通过采用免疫组织化学法和原位分子杂交技术检测ZEB-1和ZEB-2在肿瘤 组织中的表达，监测和预警乳腺癌是否转移和复发，为乳腺癌的合理治疗提供新依据，从而 可以对乳腺癌患者进行针对性治疗，大大提高了治疗效果，改善了患者的预后，进而提高了 患者的生活质量。
【附图说明】
[0044]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
[0045]图1是本发明实施方法流程简图。
【具体实施方式】
[0046]本发明提供了一种基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，本方法 将ZEB-1和ZEB-2作为标记物，对乳腺癌是否转移和复发进行监测和预警。对此，做了如下的 研究和实验：
[0047] 1、首先收集某医院病理科近年来临床与病理资料齐全的女性乳腺癌石蜡标本228 例，乳腺良性病变标本80例；分析整理出乳腺癌患者的中位年龄，并按WHO (2012年）乳腺肿 瘤中的标准对乳腺癌进行分级、分期;并对所有乳腺癌患者进行术后随访，整理出复发、存 活与死亡人数。
[0048] 2、对所有石蜡标本进行4mi厚连续切片，对切片采用HE染色。
[0049] 3、采用免疫组织化学法检测乳腺癌及乳腺良性病变组织中ZEB-1和ZEB-2的蛋白 表达，其具体步骤如下：
[0050] a.将石蜡切片放入60 °C恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上。
[0051] b.将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟;置于无水乙醇中浸泡5分钟;置入95 %乙醇中浸泡5分钟;置入70 %乙醇中浸泡5分钟； 置入蒸馏水中浸泡5分钟。
[0052] c.采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复:将脱蜡水化的组织切片置 于耐高温切片架上，同时将PH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅中加热至沸腾，再将切片架 放入已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入 凉水中冷却直至室温，将切片取出。
[0053] d.用PBS缓冲液(PH 7.2-7.4)冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0054] e.切片分别滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗试剂，置于4°C环境下过夜。
[0055] f.次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去roS缓冲 液。
[0056] g.滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗和鼠IgG聚合物，在37 °C环境下孵 育20分钟。
[0057] h.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液。
[0058] i.每张切片滴加50ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色。
[0059] j .置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝。
[0060] k.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
[0061 ] 4、采用分子原位杂交技术检测乳腺癌及乳腺良性病变组织中ZEB-1和ZEB-2的 mRNA表达，其具体步骤如下：
[0062] a ?将石蜡切片放入60 °C恒温烤箱过夜。
[0063] b.将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟;置于无水乙醇中浸泡5分钟;置入95 %乙醇中浸泡5分钟;置入70 %乙醇中浸泡5分钟； 置入DEPC水中浸泡5分钟。
[0064] c.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0065] d.用3%双氧水室温作用10分钟，用DEPC水冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0066] e.用3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶(lml 3%柠檬酸滴加2滴浓缩型胃蛋白酶)在37°C 环境下消化20分钟。
[0067] f.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，用DEPC水冲洗1次。
[0068] g.滴加预杂交液50ul/片，置入40 °C-42 °C恒温箱4小时，然后甩去多余液体。
[0069] h.再次滴加杂交液50ul/片，置入40°C-42°C恒温箱16-20小时。
[0070] i .用37°C预温的2 X SSC缓冲液冲洗2次，每次冲洗5分钟，再用37°C预温的0.5 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，再用37 °C预温的0.2 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5 分钟。
[0071 ] j .滴加封闭液，在37 °C环境下放置30分钟，然后甩去多余液体。
[0072] k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37°C环境下放置60分钟，然后用0.5M PBS缓冲液 冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0073] 1.滴加SABC，在37 °C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲 洗5分钟。
[0074] m.滴加生物素化过氧化物酶，在37 °C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液 冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液。
[0075] n.每张切片滴加100ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色。
[0076] 〇.置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝。
[0077] p.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
[0078] 5、观察实验结果，用spssl3.0统计实验数据。
[0079] 具体实验数据如下：
[0080] 表1 :ZEB-l、ZEB-2在乳腺癌组织和良性病变组织中的蛋白表达及差异
[0082] 表2:ZEB-l、ZEB-2在乳腺癌组织和良性病变组织中的mRNA表达及差异
[0084]表3:ZEB-l、ZEB-2的蛋白表达与乳腺癌患者临床病理各种参数之间的关系
[0087] 表4:ZEB-1、ZEB-2的mRNA表达与乳腺癌患者临床病理各种参数之间的关系
[0090] 上述统计数据表中采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。
[0091] 6、检测ZEB-l、ZEB-2的蛋白表达和mRNA表达在乳腺良性病变与乳腺癌中存在的差 异，分析两个指标与乳腺癌分期、预后的关系。
[0092]通过对乳腺癌和乳腺良性病变临床样本进行检测，结果表明乳腺癌组ZEB-1和 ZEB-2的蛋白表达率和mRNA表达率均显著高于乳腺良性病变组，通过分析实验数据，可以看 出ZEB-1和ZEB-2在乳腺癌组织中的表达与乳腺癌患者淋巴结转移率及TM1分期呈正相关， 因此ZEB-1和ZEB-2可成为有效的肿瘤标志物，提示乳腺癌的侵袭和转移。
[0093]根据上述研究和实验结果，如图1所示，本发明提供了一种基于ZEB-1和ZEB-2作为 标记物预警乳腺癌转移的方法，为提示乳腺癌肿瘤的转移和复发提供生物学标记物，从而 为乳腺癌的合理治疗提供新依据，可以对乳腺癌患者进行针对性治疗，提高了治疗效果，改 善了患者的预后，进而提高了患者的生活质量。
[0094]本发明具体方法如下：
[0095] A.提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本。
[0096] B.对石蜡标本进行4mi厚连续切片，对切片采用HE染色，便于全面观察其组织构 造。
[0097] C.采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中ZEB-1和ZEB-2的蛋白表达，具体步骤如 下：
[0098] a.将石蜡切片放入60 °C恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上。
[0099] b.将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟;置于无水乙醇中浸泡5分钟;置入95 %乙醇中浸泡5分钟;置入70 %乙醇中浸泡5分钟； 置入蒸馏水中浸泡5分钟。
[0100] C.采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复:将脱蜡水化的组织切片置 于耐高温切片架上，同时将PH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅中加热至沸腾，再将切片架 放入已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入 凉水中冷却直至室温，将切片取出。
[0101] d.用PBS缓冲液(PH 7.2-7.4)冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0102] e.切片分别滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗试剂，置于4°C环境下过夜。
[0103] f.次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去roS缓冲 液。
[0104] g.滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗和鼠IgG聚合物，在37°C环境下孵 育20分钟。
[0105] h.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液。
[0106] i.每张切片滴加50ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色。
[0107] j .置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝。
[0108] k.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
[0109] D.采用分子原位杂交技术检测肿瘤组织中ZEB-1和ZEB-2的mRNA表达，具体步骤如 下：
[0110] a.将石蜡切片放入60°C恒温烤箱过夜。
[0111] b.将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟;置于无水乙醇中浸泡5分钟;置入95 %乙醇中浸泡5分钟;置入70 %乙醇中浸泡5分钟； 置入DEPC水中浸泡5分钟。
[0112] c.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0113] d.用3%双氧水室温作用10分钟，用DEPC水冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0114] e.用3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶(lml 3%柠檬酸滴加2滴浓缩型胃蛋白酶)在37°C 环境下消化20分钟。
[0115] f.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，用DEPC水冲洗1次。
[0116] g.滴加预杂交液50ul/片，置入40°C_42°C恒温箱4小时，然后甩去多余液体。
[0117] h.再次滴加杂交液50ul/片，置入40°C_42°C恒温箱16-20小时。
[0118] i .用37°C预温的2 X SSC缓冲液冲洗2次，每次冲洗5分钟，再用37°C预温的0.5 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，再用37 °C预温的0.2 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5 分钟。
[0119] j .滴加封闭液，在37°C环境下放置30分钟，然后甩去多余液体。
[0120] k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37°C环境下放置60分钟，然后用0.5M PBS缓冲液 冲洗3次，每次冲洗5分钟。
[0121] 1.滴加SABC，在37 °C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲 洗5分钟。
[0122] m.滴加生物素化过氧化物酶，在37°C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液 冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液。
[0123] n.每张切片滴加100ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色。
[0124] 〇.置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝。
[0125] p.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
[0126] E.分别观察经过免疫组织化学法检测和原位分子杂交技术检测的患者肿瘤组织 切片，两种方法检测的ZEB-UZEB-2指标均以肿瘤组织细胞核和/或细胞浆呈黄色或棕黄色 记为阳性表达，若患者肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示 患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。
[0127] 以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对 所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的 结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 基于ZEB-I和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，其特征在于:该方法将ZEB-I 和ZEB-2作为标记物，对患者乳腺癌转移和复发进行预警； 该方法包括如下步骤： A. 提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本； B. 对石蜡标本进行4μπι厚连续切片，对切片采用HE染色； C. 采用免疫组织化学法检测患者肿瘤组织中ZEB-I、ZEB-2的蛋白表达； D. 采用原位分子杂交技术检测患者肿瘤组织中ZEB-I和ZEB-2的mRNA表达； E. 分别观察经过免疫组织化学法检测和原位分子杂交技术检测的患者肿瘤组织切片， 两种方法检测的ZEB-UZEB-2指标均以肿瘤组织细胞核和/或细胞浆呈黄色或棕黄色记为 阳性表达，若患者肿瘤组织中ZEB-I、ZEB-2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示患者 的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。2. 根据权利要求1所述的基于ZEB-I和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，其特 征在于:所述的免疫组织化学法包括以下步骤： a. 将石蜡切片放入60 °C恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上； b. 将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 置于无水乙醇中浸泡5分钟；置入95%乙醇中浸泡5分钟；置入70%乙醇中浸泡5分钟；置入 蒸馏水中浸泡5分钟； c. 采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复:将脱蜡水化的组织切片置于耐 高温切片架上，同时将PH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅中加热至沸腾，再将切片架放入 已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入凉水 中冷却直至室温，将切片取出； d. 用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟； e. 切片分别滴加50ul ZEB-I和ZEB-2的一抗试剂，置于4°C环境下过夜； f. 次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液； g. 滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗和鼠 IgG聚合物，在37°C环境下孵育20 分钟； h. 用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液； i .每张切片滴加50ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色； j .置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝； k.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。3. 根据权利要求1所述的基于ZEB-I和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，其特 征在于:所述的原位分子杂交技术包括以下步骤： a. 将石蜡切片放入60°C恒温烤箱过夜； b. 将切片脱蜡与水化:将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 置于无水乙醇中浸泡5分钟；置入95%乙醇中浸泡5分钟；置入70%乙醇中浸泡5分钟；置入 DEPC水中浸泡5分钟； c. 用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟； d. 用3 %双氧水室温作用10分钟，用DEPC水冲洗3次，每次冲洗5分钟； e. 用3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶在37°C环境下消化20分钟； f. 用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，用DEPC水冲洗1次； g. 滴加预杂交液50ul/片，置入40 °C_42 °C恒温箱4小时，然后甩去多余液体； h. 再次滴加杂交液50ul/片，置入40 °C-42 °C恒温箱16-20小时； i .用37°C预温的2 X SSC缓冲液冲洗2次，每次冲洗5分钟，再用37°C预温的0.5 X SSC缓 冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，再用37°C预温的0.2 X SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟； j. 滴加封闭液，在37°C环境下放置30分钟，然后甩去多余液体； k. 滴加生物素化鼠抗地高辛，在37 °C环境下放置60分钟，然后用0.5MPBS缓冲液冲洗3 次，每次冲洗5分钟； l. 滴加 SABC，在37°C环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分 钟； m. 滴加生物素化过氧化物酶，在37 °C环境下放置20分钟，然后用0.5MPBS缓冲液冲洗3 次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液； η.每张切片滴加 IOOul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色； 〇.置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝； P.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
【文档编号】G01N33/574GK105911281SQ201610256334
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】赵敏, 王瑾, 黄金, 邹强, 昂琳, 郑丽, 赵洋, 胡红光, 刘明强, 卫宏权, 苏明琴
【申请人】合肥市第二人民医院