一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法
【专利摘要】本发明公开了一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，包括以下步骤：A、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行1,5?二磷酸核酮糖羧化酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定；B、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行稳定碳同位素测定；C、对四翅滨藜和宁夏枸杞叶片进行解剖结构比较，本发明操作简单，通过叶片的解剖结构、碳同化羧化酶活性以及碳同位素分辨率的变化等方面确定宁夏枸杞的碳同化类型，为宁夏枸杞今后的研究提供理论基础。
【专利说明】
一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法
技术领域
[0001]本发明涉及碳同化类型测定技术领域，具体为一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法。
【背景技术】
[0002]迄今为止，尽管枸杞属野生遍布全世界，但作为一种经济植物资源进行野生驯化，大规模栽培和综合开发利用则中国独有，且历史悠久。在人类漫长的发展进化及需求过程中，枸杞作为“药食两用”经济作物的作用与地位也随着人类对其认识的加深而得到不断提升，先后经历了野生利用人工驯化，适地栽培的发展过程。宁夏枸杞果实富含多种营养成分和微量元素，有很高的营养价值和药用保健功效，由于枸杞耐干旱，可生长在沙地，因此可作为水土保持的灌木，而且由于其耐盐碱，成为盐碱地开树先锋；因枸杞生态适应性强、经济价值高，生态、经济、社会效益显著。随着现代科学技术的发展和人类生活质量的提高，以及“回归自然”的世界潮流，现代人的保健观念已由防病治病转向强身健体，促使枸杞这一具有滋肝补肾，润肺，益精明目，提高人体免疫功能的特色医疗保健品的出口量和内需量都有很大的增长，年总需求量达数万吨，市场需求空间逐年扩大。
[0003]目前，人们对宁夏枸杞栽培、育种、化学成分分析、药理学研究等方面做了大量的研究。但迄今为止，没有确定宁夏枸杞的碳同化类型，不能确定宁夏枸杞是C3植物还是C4植物。C3植物也叫三碳植物。光合作用中同化二氧化碳的最初产物是三碳化合物3—磷酸甘油酸的植物。三碳植物的光呼吸高，二氧化碳补偿点高，而光合效率低。如小麦、水稻大豆、棉花等大多数作物;C4植物，C02同化的最初产物不是光合碳循环中的三碳化合物3-磷酸甘油酸，而是四碳化合物苹果酸或天门冬氨酸的植物。如玉米、甘蔗、高粱、苋菜等。
[0004]光合作用是一切作物生长发育的基础，是作物碳积累和生物量积累的重要源头，光合作用效率的高低也直接决定作物的产量和品质。在这两种碳同化途径中，以C4途径光合效率最高。与C3植物相比，C4作物具有由其独特的光合机制所决定的高光合效率、低C02补偿点和几乎没有光呼吸等优点以及具有较强的抗逆性。C3作物对太阳能的利用率仅为C4作物的50%左右。然而目前大多数作物系C3途径，光合效率较低，因此确定宁夏枸杞的碳同化类型为后续研究具有重大意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，包括以下步骤:
[0007]A、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行1,5-二磷酸核酮糖羧化酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定；
[0008]B、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行稳定碳同位素测定；
[0009]C、对四翅滨藜和宁夏枸杞叶片进行解剖结构比较。
[0010]优选的，步骤A中I，5_二磷酸核酮糖羧化酶活性测定方法包括以下步骤:
[0011]A、取剪碎的待测叶片0.5g置于预冷的研钵中，加入3ml预冷的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液内含5%甘油、I %聚乙烯吡咯烷酮、lmmol/L EDTA、1mmoI/L的巯基乙醇，其pH为8.2;
[0012]B、冰浴研磨，匀浆液于4°C下以15000g离心20min，取上清液待测；
[0013]C、待测液反应总体积为3ml，内含50mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液、20mmol/LMgCl2、30mmol/LATP、5mmol/L DTT、2mmol/L NADH、lmmol/L EDTA各0.3ml，I.0ml水，1mmoI/LNaHCO3溶液0.1ml，3-磷酸甘油酸激酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶0.1ml ；
[0014]D、将混合液于3O °C恒温水浴1分钟，加入9mmo I /L的I，5-二磷酸核酮糖溶液0.1ml，最后加入I，5_二磷酸核酮糖羧化酶提取液0.1ml启动反应，迅速测定反应混合液在340nm下OD值的变化，每隔30秒记录一次数据，3min测定6组数据，测得的酶活性=(Δ OD XV)/(2d X ζ X Δ t X酶的总量)，其中Λ OD为吸光值的变化，V为反应体积，d为比色杯光程，ζSlymol NADH在340nm的消光系数，At为反应时间。
[0015]优选的，步骤A中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定方法包括以下步骤:
[0016]A、取0.5g植物叶片放入预冷的研钵中，加入3ml预冷的100mmol/L Tris-HCl缓冲液，Tri s-HCl缓冲液内含7mmoI/L巯基乙醇、ImmoI/LEDTA、5 %甘油和I %聚乙烯吡咯烷酮，其pH为8.2;
[0017]B、迅速研磨，匀浆液于4°C下以15000g离心20min，取上清液待测；
[0018]C、待测液内含 Iml 10011111101/1的1^8-!1(:1缓冲液，其?!1为9.0;11111缓冲液;0.1111110mmol/LMgCl2；0.1ml 10mmol/LNaHC03;0.2ml 40mmoI/LPVP；0.3mI lmg/mLNADH;0.3ml苹果酸脱氢酶；
[0019]D、混和液于28°C恒温水浴10分钟，用200μ1磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液启动反应，迅速在340nm测定OD值变化，每隔30秒记录一次数据，3min测定6组数据，测得的酶活性=(A0DXV)/(2dXGX AtX酶的总量)，其中AOD为吸光值的变化，V为反应体积，d为比色杯光程，ζ为lM1l NADH在340nm的消光系数，At为反应时间。
[0020]优选的，步骤B中稳定碳同位素测定方法包括以下步骤:
[0021]A、分别取宁夏枸杞与四翅滨藜的中部叶片，烘干，磨细过100目筛；
[0022]B、在过量O2中完全燃烧并收集CO2,用MAT-xp同位素质谱仪测定样品的碳同位素组成S13C值；
[0023]C、碳同位素值用国际TOB标准的千分比表示，公式是:
[0024]S13C=(Rm/RpDB一O 父1000%。，其中1?是13(:/12(:比率。
[0025]优选的，步骤C中解剖方法包括以下步骤:
[0026]A、取材和固定:选取老嫩适中的宁夏枸杞和四翅滨藜叶，使用单面刀片垂直茎轴切取3 — 6mm长的莖段，叶片垂直主脉切成约4_ X 5mm大小的小块，放入FAA中固定，固定时间在 48h-50h;
[0027]B、脱水:采用乙醇作为脱水剂，先放入65%乙醇Ih，之后放入75%乙醇Ih，之后放入85%乙醇lh，之后放入95%乙醇lh，之后放入100%乙醇40min，之后放入100%乙醇30min逐级脱水；
[0028]C、透明:采用二甲苯作为透明剂，依次经2/3无水乙醇和1/3 二甲苯混合物、1/2无水乙醇和1/2 二甲苯混合物、1/3无水乙醇和2/3 二甲苯混合物、纯二甲苯，不断增加二甲苯的比例，逐级透明，且每级透明时间为I小时；
[0029]D、浸蜡:先用低熔点的切片石蜡在35°C下浸蜡12小时，然后用由熔点为58°C_60°C蜂蜡和低熔点切片石蜡按1:9的质量比融合在一起的混合石蜡在温箱中60°C保温、浸蜡，每2h换一次混合石蜡，重复进行两次，共4h;
[0030]E、包埋:步骤D中材料浸蜡结束后立即用镊子转移到装有液态步骤D中混合石蜡的小纸盒中，并迅速冷却;使材料的长轴垂直于纸盒的底部，做材料横切观察其横截面结构；
[0031]F、切片:根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，切片厚度8-15μπι;
[0032]G、展片及粘片:在洁净的载玻片上均匀涂上少许蛋白甘油，蛋白甘油用鸡蛋清和甘油按1:1的体积比充分搅拌混匀制成，将蜡带小心地放在50°C的水面上，待蜡带展平后，用涂有蛋白甘油的载玻片将它捞起，使蜡带光面紧贴载玻片，然后在35°C温箱中烘干，使蜡带充分粘附在载玻片上；
[0033]H、脱蜡和染色:二甲苯脱蜡后采用番红亮绿复染法染色，具体步骤如下:在35°C纯二甲苯中放置2_3h;之后放入纯二甲苯中l-2min，之后放入1/2 二甲苯和1/2无水乙醇混合物中l-2min;之后放入无水乙醇l-2min;再次放入无水乙醇l-2min，之后放入95%乙醇1-2min，之后放入85%乙醇l-2min，之后放入75%乙醇l-2min，之后放入65%乙醇l-2min，之后放入番红染液24h，之后放入65%乙醇l-2min，之后放入75%乙醇l_2min，之后放入85%乙醇l-2min，之后放入亮绿染液l-3s，之后放入95%乙醇l-2min，之后放入无水乙醇1-2min，之后再次放入无水乙醇l-2min，之后放入1/2 二甲苯和1/2无水乙醇混合物中l-2min，之后放入纯二甲苯l_2min，之后再次放入纯二甲苯l_2min ；
[0034]1、封片及观察:用中性树胶封片后，将切片放入35°C温箱中烘干，数3-5天干燥后进行观察和光学显微摄影。
[0035]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明操作简单，以C4植物四翅滨藜作参照，通过叶片的解剖结构、碳同化羧化酶活性以及碳同位素分辨率的变化等方面确定宁夏枸杞的碳同化类型为C3植物，为宁夏枸杞今后的研究提供理论基础。
【具体实施方式】
[0036]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]本发明提供一种技术方案:一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，包括以下步骤:
[0038]A、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行I，5_二磷酸核酮糖羧化酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定；
[0039]B、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行稳定碳同位素测定；
[0040]C、对四翅滨藜和宁夏枸杞叶片进行解剖结构比较。
[0041]本实施中，步骤A中I，5_二磷酸核酮糖羧化酶活性测定方法包括以下步骤:
[0042]A、取剪碎的待测叶片0.5g置于预冷的研钵中，加入3ml预冷的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液内含5%甘油、I %聚乙烯吡咯烷酮、lmmol/L EDTA、1mmoI/L的巯基乙醇，其pH为8.2;
[0043]B、冰浴研磨，匀浆液于4°C下以15000g离心20min，取上清液待测；
[0044]C、待测液反应总体积为3ml，内含50mmol/L，pH为8.0的1^8-!1(:1缓冲液、2011111101/LMgCl2、30mm。I/LATP、5mm。I/LDTT、2mm。I/LNADH、lmmol/L EDTA各0.3mI，1.0ml水，10mmol/LNaHCO3溶液0.1ml，3-磷酸甘油酸激酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶0.1ml ；
[0045]D、将混合液于3(TC恒温水浴1分钟，加入9mmo I /L的I，5-二磷酸核酮糖溶液
0.1ml，最后加入I，5_二磷酸核酮糖羧化酶提取液0.1ml启动反应，迅速测定反应混合液在340nm下OD值的变化，每隔30秒记录一次数据，3min测定6组数据，测得的酶活性=(Δ OD XV)/(2d X ζ X Δ t X酶的总量)，其中Λ OD为吸光值的变化，V为反应体积，d为比色杯光程，ζSlymol NADH在340nm的消光系数，At为反应时间。
[0046]本实施例中，步骤A中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定方法包括以下步骤:
[0047]A、取0.5g植物叶片放入预冷的研钵中，加入3ml预冷的lOOmmol/L Tris-HCl缓冲液，Tri s-HCl缓冲液内含7mmoI/L巯基乙醇、ImmoI/LEDTA、5 %甘油和I %聚乙烯吡咯烷酮，其pH为8.2;
[0048]B、迅速研磨，匀浆液于4°C下以15000g离心20min，取上清液待测；
[0049]C、待测液内含Iml 100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH为9.0 ; Iml缓冲液;0.1ml10mmol/LMgCl2；0.1ml 10mmol/LNaHC03;0.2ml 40mmoI/LPVP；0.3mI lmg/mLNADH;0.3ml苹果酸脱氢酶；
[0050]D、混和液于28°C恒温水浴10分钟，用200μ1磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液启动反应，迅速在340nm测定OD值变化，每隔30秒记录一次数据，3min测定6组数据，测得的酶活性=(A0DXV)/(2dXGX AtX酶的总量)，其中AOD为吸光值的变化，V为反应体积，d为比色杯光程，ζ为lM1l NADH在340nm的消光系数，At为反应时间。
[0051 ]本实施例中，步骤B中稳定碳同位素测定方法包括以下步骤:
[0052]A、分别取宁夏枸杞与四翅滨藜的中部叶片，烘干，磨细过100目筛；
[0053]B、在过量O2中完全燃烧并收集CO2,用MAT-xp同位素质谱仪测定样品的碳同位素组成S13C值；
[0054]C、碳同位素值用国际PDB标准的千分比表示，公式是:S13C= (R#nDn/RpDB-1) X1000%。，其中 R 是13C/12C 比率。
[0055]本实施例中，步骤C中解剖方法包括以下步骤:
[0056]A、取材和固定:选取老嫩适中的宁夏枸杞和四翅滨藜叶，使用单面刀片垂直茎轴切取3 — 6mm长的莖段，叶片垂直主脉切成约4_ X 5mm大小的小块，放入FAA中固定，固定时间在 48h-50h;
[0057]B、脱水:采用乙醇作为脱水剂，先放入65%乙醇Ih，之后放入75%乙醇Ih，之后放入85%乙醇lh，之后放入95%乙醇lh，之后放入100%乙醇40min，之后放入100%乙醇30min逐级脱水；
[0058]C、透明:采用二甲苯作为透明剂，依次经2/3无水乙醇和1/3 二甲苯混合物、1/2无水乙醇和1/2 二甲苯混合物、1/3无水乙醇和2/3 二甲苯混合物、纯二甲苯，不断增加二甲苯的比例，逐级透明，且每级透明时间为I小时；
[0059]D、浸蜡:先用低熔点的切片石蜡在35°C下浸蜡12小时，然后用由熔点为58°C_60°C蜂蜡和低熔点切片石蜡按1:9的质量比融合在一起的混合石蜡在温箱中60°C保温、浸蜡，每2h换一次混合石蜡，重复进行两次，共4h;
[0060]E、包埋:步骤D中材料浸蜡结束后立即用镊子转移到装有液态步骤D中混合石蜡的小纸盒中，并迅速冷却;使材料的长轴垂直于纸盒的底部，做材料横切观察其横截面结构；
[0061]F、切片:根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，切片厚度8-15μπι;
[0062]G、展片及粘片:在洁净的载玻片上均匀涂上少许蛋白甘油，蛋白甘油用鸡蛋清和甘油按1:1的体积比充分搅拌混匀制成，将蜡带小心地放在50°C的水面上，待蜡带展平后，用涂有蛋白甘油的载玻片将它捞起，使蜡带光面紧贴载玻片，然后在35°C温箱中烘干，使蜡带充分粘附在载玻片上；
[0063]H、脱蜡和染色:二甲苯脱蜡后采用番红亮绿复染法染色，具体步骤如下:在35°C纯二甲苯中放置2_3h;之后放入纯二甲苯中l-2min，之后放入1/2 二甲苯和1/2无水乙醇混合物中l-2min;之后放入无水乙醇l-2min;再次放入无水乙醇l-2min，之后放入95%乙醇1-2min，之后放入85%乙醇l-2min，之后放入75%乙醇l-2min，之后放入65%乙醇l-2min，之后放入番红染液24h，之后放入65%乙醇l-2min，之后放入75%乙醇l_2min，之后放入85%乙醇l-2min，之后放入亮绿染液l-3s，之后放入95%乙醇l-2min，之后放入无水乙醇1-2min，之后再次放入无水乙醇l-2min，之后放入1/2 二甲苯和1/2无水乙醇混合物中l-2min，之后放入纯二甲苯l_2min，之后再次放入纯二甲苯l_2min ；
[0064]1、封片及观察:用中性树胶封片后，将切片放入35°C温箱中烘干，数3-5天干燥后进行观察和光学显微摄影。
[0065]本发明操作简单，以C4植物四翅滨藜作参照，通过叶片的解剖结构、碳同化羧化酶活性以及碳同位素分辨率的变化等方面确定宁夏枸杞的碳同化类型为C3植物，为宁夏枸杞今后的研究提供理论基础。
[0066]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1.一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，其特征在于:包括以下步骤: A、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行I，5-二磷酸核酮糖羧化酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定； B、将四翅滨藜和宁夏枸杞进行稳定碳同位素测定； C、对四翅滨藜和宁夏枸杞叶片进行解剖结构比较。2.根据权利要求1所述的一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，其特征在于:步骤A中I，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性测定方法包括以下步骤: A、取剪碎的待测叶片0.5g置于预冷的研钵中，加入3ml预冷的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，Tr i s-HCl缓冲液内含5%甘油、1%聚乙烯吡咯烷酮、Immo I/LEDTA、I Ommo I /L的巯基乙醇，其PH为8.2; B、冰浴研磨，勾楽液于4°C下以15000g离心20min，取上清液待测； C、待测液反应总体积为3mI，内含5OmmoI /L，pH为8.0的Tr i s-HCI缓冲液、2Ommo I /LMgCl2、30mmol/L ATP、5mmol/L DTT、2mmol/L NADH、lmmol/L EDTA各0.3ml，I.0ml水，1mmoI/LNaHCO3溶液0.1ml，3-磷酸甘油酸激酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶0.1ml ； D、将混合液于30°C恒温水浴10分钟，加入9mmoI/L的1,5-二磷酸核酮糖溶液0.1ml，最后加入I，5_二磷酸核酮糖羧化酶提取液0.1ml启动反应，迅速测定反应混合液在340nm下OD值的变化，每隔30秒记录一次数据，3min测定6组数据，测得的酶活性=(Δ0?Χν)/(2(!ΧζX Δ tX酶的总量)，其中Δ OD为吸光值的变化，V为反应体积，d为比色杯光程，ζ为IymolNADH在340nm的消光系数，Δ t为反应时间。3.根据权利要求1所述的一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，其特征在于:步骤A中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定方法包括以下步骤: A、取0.5g植物叶片放入预冷的研钵中，加入3ml预冷的lOOmmol/LTris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液内含7mmoI/L巯基乙醇、Immo 1/LEDTA、5 %甘油和I %聚乙烯吡咯烷酮，其pH为 8.2; B、迅速研磨，勾楽液于4°C下以15000g离心20min，取上清液待测； C、待测液内含Iml100mmol/L的Tri s-HCl缓冲液，其pH为9.0; Iml缓冲液；0.1ml.10mmol/LMgCl2；0.1ml 10mmol/LNaHC03;0.2ml 40mmoI/LPVP；0.3mI lmg/mLNADH;0.3ml苹果酸脱氢酶； D、混和液于28°C恒温水浴10分钟，用200μ1磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液启动反应，迅速在340nm测定OD值变化，每隔30秒记录一次数据，3min测定6组数据，测得的酶活性=(A0DXV)/(2dXGX AtX酶的总量)，其中AOD为吸光值的变化，V为反应体积，d为比色杯光程，ζ为Ιμπιο? NADH在340nm的消光系数，At为反应时间。4.根据权利要求1所述的一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，其特征在于:步骤B中稳定碳同位素测定方法包括以下步骤: A、分别取宁夏枸杞与四翅滨藜的中部叶片，烘干，磨细过100目筛； B、在过量O2中完全燃烧并收集⑶2，用MAT-xp同位素质谱仪测定样品的碳同位素组成δ.13C 值； C、碳同位素值用国际PDB标准的千分比表示，公式是:δ13C = (Rffia/RpDB-1) X 1000%。，其中R是13C/12C比率。5.根据权利要求1所述的一种宁夏枸杞碳同化类型的确定方法，其特征在于:步骤C中解剖方法包括以下步骤: A、取材和固定:选取老嫩适中的宁夏枸杞和四翅滨藜叶，使用单面刀片垂直茎轴切取.3 — 6mm长的莖段，叶片垂直主脉切成约4mm X 5mm大小的小块，放入FAA中固定，固定时间在.48h-50h； B、脱水:采用乙醇作为脱水剂，先放入65%乙醇Ih，之后放入75 %乙醇Ih，之后放入.85%乙醇lh，之后放入95%乙醇lh，之后放入100%乙醇40min，之后放入100%乙醇30min逐级脱水； C、透明:采用二甲苯作为透明剂，依次经2/3无水乙醇和1/3二甲苯混合物、1/2无水乙醇和1/2 二甲苯混合物、1/3无水乙醇和2/3 二甲苯混合物、纯二甲苯，不断增加二甲苯的比例，逐级透明，且每级透明时间为I小时； D、浸蜡:先用低熔点的切片石蜡在35°C下浸蜡12小时，然后用由熔点为58°C-60°C蜂蜡和低熔点切片石蜡按1:9的质量比融合在一起的混合石蜡在温箱中60°C保温、浸蜡，每2h换一次混合石蜡，重复进行两次，共4h; E、包埋:步骤D中材料浸蜡结束后立即用镊子转移到装有液态步骤D中混合石蜡的小纸盒中，并迅速冷却;使材料的长轴垂直于纸盒的底部，做材料横切观察其横截面结构； F、切片:根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，切片厚度8-15μπι; G、展片及粘片:在洁净的载玻片上均匀涂上少许蛋白甘油，蛋白甘油用鸡蛋清和甘油按1:1的体积比充分搅拌混匀制成，将蜡带小心地放在50°C的水面上，待蜡带展平后，用涂有蛋白甘油的载玻片将它捞起，使蜡带光面紧贴载玻片，然后在35 °C温箱中烘干，使蜡带充分粘附在载玻片上； H、脱蜡和染色:二甲苯脱蜡后采用番红亮绿复染法染色，具体步骤如下:在35°C纯二甲苯中放置2_3h;之后放入纯二甲苯中l-2min，之后放入1/2 二甲苯和1/2无水乙醇混合物中l-2min ；之后放入无水乙醇l_2min ；再次放入无水乙醇l_2min，之后放入95 %乙醇l_2min，之后放入85%乙醇l-2min，之后放入75%乙醇l-2min，之后放入65%乙醇l-2min，之后放入番红染液24h，之后放入65 %乙醇l-2min，之后放入75%乙醇l_2min，之后放入85%乙醇1-2min，之后放入亮绿染液l-3s，之后放入95%乙醇l-2min，之后放入无水乙醇l-2min，之后再次放入无水乙醇l-2min，之后放入1/2 二甲苯和1/2无水乙醇混合物中l-2min，之后放入纯二甲苯l_2min，之后再次放入纯二甲苯l_2min ； I、封片及观察:用中性树胶封片后，将切片放入35°C温箱中烘干，数3-5天干燥后进行观察和光学显微摄影。
【文档编号】G01N33/00GK105954477SQ201610583979
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】毛桂莲, 张晶, 张学萍, 马乐, 许兴, 王开元, 王盛
【申请人】宁夏大学