用于检测靶标分析物的检测单元和方法

用于检测靶标分析物的检测单元和方法
【专利摘要】本申请涉及使用由靶标以及第一探针和第二探针形成的复合体检测样品中的一种或多种靶标分析物的检测单元和方法，其中所述复合体包含伸长区域、与第一探针偶联的颗粒、与第二探针偶联的固体支持物。通过测量颗粒的位移能够将靶标分析物的特异性结合与颗粒的非特异性结合区分开。
【专利说明】用于检测靶标分析物的检测单元和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2014年2月6日递交的美国临时申请N0.61 /936，863的权益，该临时申请的内容通过引用整体并入本文。发明领域
[0003]本发明基本涉及用于检测样品中的靶标分析物(例如，天然的、合成的、经修饰的或未经修饰的核酸或者蛋白质)的检测单元和方法。
[0004]发明背景
[0005]已知许多用于测定样品中是否存在特定靶标分析物的检测系统。用于检测分析物的检测系统的实例包括免疫分析，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，其被用于许多诊断、研究和筛选应用中。一般而言，这些检测系统在与特异性结合剂或者探针结合时产生可测量的信号从而检测靶标分析物。
[0006]当使用已知检测系统(例如，免疫分析)时，检测靶标分析物的能力往往受到样品中低浓度的靶标分析物和非特异性相互作用(例如，信号产生分子的非特异性结合和样品分子的非特异性结合)的限制。检测生物样品中靶标分析物的能力往往受到这两种因素的限制。
[0007]由检测系统产生的信号通常与结合特异性结合探针的靶标分析物的数目成比例。 因此，靶标浓度低时信号弱。总信号可通过增强与每种结合靶标分析物相关的信号来增强。 通常，检测系统使用固体支持物和报告标记物(例如，荧光分子)来产生信号。已设计了一些使用报告标记物的策略来增强与每种结合靶标相关的信号，例如在分支DNA(HendriCkS等人，Am J Clin Pathol.1995,104(5):537)和杂合体捕获(WO 2003078966A2)中。虽然这些策略能够增强总信号，但它们往往也增强背景噪音，所述背景噪音是由报告标记物和固体支持物之间的非特异性相互作用产生的。这些策略不能提供辨别非特异性结合于固体支持物的报告标记物的有效方法。
[0008]如PCT/GB2010/001913中所述，使用微米尺度颗粒作为报告标记物提供了移除非特异性结合于固体支持物的颗粒的方法，这是通过在颗粒上施加受控的流体拖拽力来实现的。然而，拖拽力显著减弱了信号和背景噪音，因为含系链(tether)的靶标所经受的破坏力与非特异性系链所经受的力一样大。
[0009]PCT/GB2010/001913(W0 2011/045570A2)中公开的另一种策略使用通过伸长分子与固体支持物相连的磁性珠粒作为感知设备来检测，例如来自ELISA试验的信号。根据此公开内容，无论靶标分子是否存在，珠粒均与固体支持物相连，且信号通过释放作用于伸长分子的操纵剂而被放大。该策略没有提供辨别非特异性相互作用的简单方法。[〇〇1〇]因此，需要能够检测样品中低浓度的靶标分析物同时将非特异性结合与特异性结合区分开的检测单元和所述单元的系统以及方法。
[0011]发明概述
[0012]在一方面，本发明提供检测样品中的靶标分析物的方法，所述方法包括:
[0013]a)提供复合体，所述复合体由以下物质形成:
[0014]i)第一探针，其与颗粒偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，
[0015]和
[0016]ii)第二探针，其与固体支持物偶联并且与如果存在的话，所述分
[0017]析物结合，以使得如果样品中存在靶标分析物，则颗粒通过由第一探
[0018]针和第二探针以及靶标分析物形成的复合体与固体支持物间接偶联，[〇〇19]并且其中所述复合体包含伸长区域;和
[0020]b)i)向间接偶联的颗粒或者包含伸长区域的复合体施加力并测量颗粒位移的量或者复合体的长度，其中位移的量或者复合体的长度指示样品中是否存在靶标分析物，或者i i)测量间接偶联的颗粒的布朗运动，其中布朗运动的量指示样品中是否存在革G标分析物。
[0021]另一方面，本发明提供用于检测样品中的靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包含: a)颗粒;和b)第一探针，所述第一探针能够与所述分析物结合，并且能够与固体支持物或者所述颗粒结合，所述第一探针任选地包含长度为约0.15M1至约20wii的伸长区域;c)包装材料;和任选的d)使用说明。
[0022]另外一方面，本发明提供检测样品中的靶标分析物的方法，所述方法包括:[〇〇23] a)提供复合体，所述复合体由以下物质形成:
[0024]i)第一探针，其与颗粒偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，和
[0025]ii)第二探针，其与基本扁平的固体支持物偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，
[0026]以使得如果所述样品中存在所述靶标分析物，则所述颗粒通过由靶标分析物以及第一探针和第二探针形成的复合体与固体支持物间接偶联，且其中复合体包含伸长区域； 和
[0027]b)利用移除非特异性结合颗粒的基本平行于固体支持物的流，向间接偶联的颗粒施加力，其中施加力之后颗粒的存在指示样品中存在靶标分析物。
[0028]虽然某些颗粒(例如，微米级磁珠)可被用于增强检测系统的敏感性以产生可测量的信号，但这些颗粒倾向于与连接探针的固体支持物非特异性相互作用，从而产生背景噪音。然而，借助于使用经由由靶标分析物以及第一探针和第二探针形成且包含伸长区域的复合体与固体支持物间接偶联的颗粒，可通过测量颗粒的位移来将与靶标分析物的特异性结合和非特异性结合区分开。经由复合体与固体支持物偶联的颗粒迀移的距离是伸长区域长度的函数。与固体支持物非特异性结合的颗粒迀移的距离小于经由复合体与固体支持物特异性结合的颗粒迀移的距离。通过这种方式，可利用颗粒的位移将特异性结合与非特异性结合区分开，在具有低浓度靶标分析物的样品中尤其如此。能够产生颗粒与固体支持物的非特异性连接的其它非特异性相互作用也能被区分，例如与探针非特异性结合的颗粒或者与固体支持物非特异性结合的探针，因为这些颗粒的迀移距离也小于经由复合体与固体支持物特异性结合的颗粒的迀移距离。
[0029]在本发明的实施方式中，与使用报告标记物的其它系统相比，使用经由/通过由靶标分析物以及第一探针和第二探针形成且包含伸长区域的复合体与固体支持物间接偶联的颗粒具有至少三个额外优点。首先，使用具有伸长区域的复合体创造了简单的复用方法。通过针对每个不同的靶标使用不同尺寸的伸长区域，可以在单个试验中检测多个靶标。如实施例3中所示，可容易地在数以千计的复合体中以亚微米分辨率测量颗粒位移和因此伸长区域长度。第二，在一些实施方式中，施加力可增强技术的靶标选择性，这是借助于移除经由与在样品中与靶标分子类似但不完全相同的分子结合的颗粒实现的。第三，在施加基本平行于固体支持物的力的实施方式(例如，施加基本平行于固体支持物的流体拖拽力的实施方式)中，力可以移除非特异性结合颗粒同时不会显著减弱信号，因为伸长区域作为复合体的一部分减小了靶标分析物所经受的力。当在与固体支持物结合的颗粒上施加基本平行于固体支持物的力时，系链上的张力随系链长度减小(Langmuir (1996) 12(9): 2271)。因此，非特异性相互作用(其通常是约lOnm长的系链)经受的张力显著高于伸长的复合体中结合的靶标经受的张力。在本发明的实施方式中，长系链的这种性质允许移除非特异性结合颗粒而不显著影响特异性结合颗粒。
[0030]在另一种实施方式中，所述方法包括:a)提供探针和颗粒，其中所述探针包括用于偶联固体支持物的第一末端、包含第一分析物结合区域的第二末端以及置于第一末端和第二末端之间的伸长区域，且其中所述颗粒包含第二分析物结合区域;b)使探针暴露于样品， 其中如果样品中存在靶标分析物，则靶标分析物结合到探针的第一分析物结合区域;c)使颗粒暴露于样品，其中如果样品中存在靶标分析物，则靶标分析物结合到颗粒的第二分析物结合区域;d)在允许探针的第一末端与固体支持物偶联的条件下，使探针暴露于固体支持物，以使得如果样品中存在靶标分析物，则颗粒经由靶标分析物和探针来与固体支持物间接偶联;e)向颗粒施加力;和f)测量颗粒位移的量，其中位移量指示样品中是否存在靶标分析物。
[0031]在另一种实施方式中，检测样品中的靶标分析物的方法包括:a)提供探针和固体支持物，其中所述探针包括用于偶联颗粒的第一末端、包含第一分析物结合区域的第二末端以及置于第一末端和第二末端之间的伸长区域，且其中所述固体支持物包含第二分析物结合区域;b)使探针暴露于样品，其中如果样品中存在靶标分析物，则靶标分析物结合到探针的第一分析物结合区域;c)在允许探针的第一末端与颗粒偶联的条件下，使探针暴露于颗粒;d)使固体支持物暴露于样品，其中如果样品中存在靶标分析物，则靶标分析物结合到固体支持物的第二分析物结合区域，以使得颗粒经由靶标分析物和探针来与固体支持物间接偶联;e)向颗粒施加力;和f)测量颗粒位移的量，其中位移量指示样品中是否存在靶标分析物。
[0032]在某些实施方式中，探针的第一分析物结合分子包含与靶标分析物的第一区域杂交的第一核酸，且第二分析物结合区域包含与靶标分析物的第二区域杂交的第二核酸。在某些其它实施方式中，探针的第一分析物结合区域包含与靶标分析物结合的第一抗体，且第二分析物结合区域包含与靶标分析物结合的第二抗体。
[0033]在另一种实施方式中，检测样品中的靶标分析物的方法包括:a)提供1)第一探针， 其包括用于偶联颗粒的第一末端和包含第一分析物结合区域的第二末端，和2)第二探针， 其包括用于偶联固体支持物的第一末端和包含第二分析物结合区域的第二末端，其中第一探针或第二探针中至少一种包含置于第一末端和第二末端之间的伸长区域;b)使第一探针和第二探针暴露于样品，其中如果样品中存在靶标分析物，则靶标分析物的第一区域结合到第一探针的第一分析物结合区域且靶标分析物的第二区域结合到第二探针的第二分析物结合区域;C)在允许第一探针的第一末端与颗粒偶联的条件下，使第一探针暴露于颗粒； d)在允许第二探针的第一末端与固体支持物偶联的条件下，使第二探针暴露于固体支持物，以使得如果样品中存在靶标分析物，则颗粒通过第一探针与固体支持物间接偶联，其中所述第一探针与靶标分析物结合，所述靶标分析物与第二探针结合，所述第二探针与固体支持物结合;e)向颗粒施加力;和f)测量颗粒位移的量，其中位移量指示样品中是否存在靶标分析物。
[0034]在其它实施方式中，第一探针和第二探针结合到靶标分析物中的位置被靶标分析物中的伸长区域隔开。在这些实施方式中，复合体中的伸长区域可以与靶标分析物的伸长区域部分或者完全一致。
[0035]在某些实施方式中，第一探针的第一分析物结合区域包含与靶标分析物的第一区域杂交的第一核酸且第二探针的第二分析物结合区域包含与靶标分析物的第二区域杂交的第二核酸。在其它实施方式中，第一探针的第一分析物结合区域包含与靶标分析物结合的第一抗体且第二探针的第二分析物结合区域包含与靶标分析物结合的第二抗体。
[0036]在某些实施方式中，第一探针包含置于其第一末端和第二末端之间的伸长核酸， 而在其它实施方式中，第二探针包含置于其第一末端和第二末端之间的伸长核酸。在其它实施方式中，第一探针包含置于其第一末端和第二末端之间的第一伸长核酸且第二探针包含置于其第一末端和第二末端之间的第二伸长核酸。
[0037]在本文所述的方法中，暴露步骤(b)、(c)和(d)可以以任何顺序进行或者同时进行。因此，在某些实施方式中，步骤b)、c)和d)的顺序为b-d-c、c-b-d、c-d-b、d-b-c或d-c-b。 在其它实施方式中，同时进行b)、c)和d)这三个步骤中的两个。在某些实施方式中，使样品暴露于第一探针在使样品暴露于第二探针之前或者之后进行或者二者同时进行。在其它实施方式中，同时进行步骤b)、c)和d)。
[0038]在某些实施方式中，在步骤b)和/或步骤c)和/或步骤d)之后，所述方法包括洗涤步骤。[0〇39]在某些实施方式中，施加到颗粒的力是磁力、流体拖拽力、流体浮力、机械力、电力、离心力、重力或其组合。
[0040] 在某些实施方式中，伸长区域的长度范围为约0.15M1至约20wii。在其它实施方式中，伸长核酸的长度范围为约0.5M1至约5mi。[〇〇41 ] 在某些实施方式中，颗粒的直径范围为约0.3_至约20wii。在某些其它实施方式中，颗粒是磁性颗粒，包括但不限于超顺磁性颗粒。[〇〇42]在某些实施方式中，不测量在步骤f中施加或者不施加力情况下由力产生的颗粒位移，取而代之的是测量颗粒的布朗运动，其中布朗运动的量指示样品中是否存在靶标分析物。[〇〇43]在某些实施方式中，采用带透镜的成像系统或者利用无透镜显微镜或者利用相干成像技术，来测量颗粒位移。
[0044]在某些实施方式中，祀标分析物是核酸分子，所述核酸分子选自单链DNA或单链 RNA，例如，信使RNA、小干扰RNA、微RNA及其前体或循环RNA。在某些实施方式中，控制样品的温度以使样品中双链核酸变性且/或样品中的核酸与第一分析物结合区域和第二分析物结合区域特异性杂交。在其它实施方式中，首先用核酸外切酶处理样品以将双链核酸转化为单链核酸。在其它实施方式中，靶标分析物是蛋白质。
[0045]本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的靶标分析物的试剂盒或检测单元。所述试剂盒或检测单元包括第一探针，所述第一探针包含用于偶联表面或颗粒的第一末端、包含分析物结合区域的第二末端以及置于第一末端和第二末端之间的伸长区域。根据这种实施方式，第一探针与靶标分析物结合。第一探针还允许将与其结合的颗粒的位移量和与结合有探针的固体支持物非特异性结合的颗粒的位移量区分开。在一种实施方式中，伸长区域是长度为0.5-lOwii的核酸。在另一种实施方式中，试剂盒或检测单元还包括第二探针，所述第二探针包含用于偶联固体支持物或颗粒的第一末端和包含第二分析物结合区域的第二末端，其中如果第一探针的第一末端用于偶联固体支持物，则第二探针的第一末端用于偶联颗粒;如果第一探针的第一末端用于偶联颗粒，则第二探针的第一末端用于偶联固体支持物。附图简要说明
[0046]图1A描述了这样的实施方式，其中在一定条件下，使第一探针(1)和包含伸长区域的第二探针(2)暴露于样品，以使得如果样品中存在靶标分析物(3)，则靶标分析物(3)与第一探针(1)和第二探针(2)结合。使颗粒(4)暴露于样品之后，颗粒(4)与第一探针(1)偶联。 暴露于固体支持物(5)之后，第二探针(2)与固体支持物(5)偶联。
[0047]图1B描述了这样的实施方式，其中在一定条件下，使包含伸长区域的第二探针(2) 暴露于样品，以使得如果样品中存在靶标分析物(3)，则靶标分析物(3)与第二探针(2)结合。使偶联第一探针(1)的颗粒(4)暴露于样品之后，第一探针(1)与靶标分析物(3)结合。暴露于固体支持物(5)之后，第二探针(2)与固体支持物(5)偶联。
[0048]图2A描述了这样的实施方式，其中在一定条件下，使偶联颗粒的第一探针(1)和包含伸长区域的第二探针(2)暴露于样品，以使得如果样品中存在靶标分析物(3)，则靶标分析物(3)与第一探针(1)和第二探针(2)结合。暴露于固体支持物(5)之后，第二探针(2)与固体支持物(5)偶联。
[0049]图2B描述了这样的实施方式，其中在一定条件下，使偶联固体支持物(5)的第二探针(2)和包含伸长区域的第一探针(1)暴露于样品，以使得如果样品中存在靶标分析物(3)， 则靶标分析物(3)与第一探针(1)和第二探针(2)结合。暴露于颗粒(4)之后，颗粒(4)与第一探针(1)偶联。
[0050]图3描述了在与固体支持物相连的颗粒上施加力的效果。如果颗粒通过包含伸长区域的复合体与固体支持物相连(如在(6)所示)，则颗粒移动的距离(8)是探针长度的函数。如果颗粒与固体表面非特异性结合(如在(7)所示)，则颗粒不移动或者移动的距离显著小于特异性结合颗粒移动的距离(6)。
[0051]图4描述了这样的实施方式，其中在一定条件下，使包含伸长区域的第一探针(1) 和包含伸长区域的第二探针(2)暴露于样品，以使得如果样品中存在靶标分析物(3)，则靶标分析物(3)与第一探针(1)和第二探针(2)结合。使颗粒(4)暴露于样品之后，颗粒(4)与第一探针(1)偶联。暴露于固体支持物(5)之后，第二探针(2)与固体支持物(5)偶联。[〇〇52]图5A描述了这样的实施方式，其中第一探针(1)和第二探针(2)能够与靶标分析物 (3)和第二分子(9)二者结合，并向复合体施加旋转力，这可导致复合体的可检测到的螺旋或超螺旋。[〇〇53]图5B描述了这样的实施方式，其中第一探针(1)包含伸长的环状双链DNA。环状双链DNA具有单链区域，其中一条链是不连续的(10)。与第一探针(1)结合的靶标(3)桥接不连续的链，并向复合体施加旋转力，这可导致复合体的可检测到的螺旋或超螺旋。第二探针 (2)结合靶标并偶联固体支持物。[〇〇54]图5C描述了这样的实施方式，其中第一探针(1)包含伸长的环状双链DNA，所述环状双链DNA具有一个或多个荧光标记(11)。环状双链DNA具有单链区域，其中一条链是不连续的(10)。与第一探针(1)结合的靶标(3)桥接不连续的链，并向复合体施加旋转力，这可导致复合体的可检测到的超螺旋。第二探针(2)结合靶标并偶联固体支持物。[〇〇55] 图6A展示了具有44飞(femto)摩尔(fM)靶标(顶部)、4.4fM靶标(中间)和无靶标 (顶部)的实验中珠粒位移的直方图。这些直方图是利用实施例3的实施方式产生的。在不流动时拍摄的图像中测定每个珠粒的第一位置，然后在流动时拍摄的图像中测定每个珠粒的第二位置。珠粒位移是第一位置和第二位置之间的距离。在这种实施方式中，通过第二探针与固体支持物偶联并且与复合体结合的珠粒(这指示靶标的存在)通过流动迀移并形成右侧的峰(12)。不因流动迀移的珠粒形成左侧的峰(13)并对应于通过非特异性相互作用与玻璃相连的珠粒。[〇〇56]图6B展示了具有1皮(pico)摩尔(pM)靶标(顶部)、44fM靶标(中间)和无靶标(顶部)的实验中珠粒位移的直方图。这些直方图是利用实施例3的实施方式产生的。在向一个方向流动时拍摄的图像中测定每个珠粒的第一位置，然后在向另一个方向流动时拍摄的图像中测定每个珠粒的第二位置。珠粒位移是第一位置和第二位置之间的距离。在这种实施方式中，通过第二探针与固体支持物偶联并且与复合体结合的珠粒(这指示靶标的存在)通过流动迀移并形成右侧的峰(12)。不因流动迀移的珠粒形成左侧的峰(13)并对应于通过非特异性相互作用与玻璃相连的珠粒。
[0057]图7描述了检测细菌细胞(例如，导致人类肺结核的那些细菌细胞)的实施方式。在该实例中，使用第一探针(1)和第二探针(2)检测细菌的23S核糖体RNA(3)，其中第一探针 (1)和第二探针(2)各自与RNA分子中不同的30nt序列互补。该图显示了用DNA寡核苷酸官能化的颗粒(4);第一探针(1)，其包含约9000个DNA碱基对和在每个末端的30个核苷酸突出部分的伸长区域，一个突出部分与颗粒(4)表面中的DNA寡核苷酸互补，另一个突出部分与靶标分析物(3)互补;第二探针(2)，其包含DNA寡核苷酸，一部分与靶标分析物(3)互补，另一部分与用于偶联玻璃基质的捕获探针(5)互补；和用捕获探针(5)官能化的玻璃基质。使含有待检测细菌的样品(14)(例如，痰或血液)经受裂解细胞的过程，从而释放其核酸。使第一探针(1)、第二探针(2)和颗粒(4)暴露于样品，以至于包含第一探针(1)、第二探针和靶标的复合体与颗粒偶联。使颗粒流入毛细管中，第二探针在此处杂交以捕获玻璃基质上的探针。 在流体流动存在或不存在时拍摄照片。流体流动产生拖拽力(15)，其使与复合体相连的颗粒迀移约3wii。[〇〇58]图8A描述了通过长L的链与固体支持物(5)相连的半径为a的球形颗粒(4)。颗粒经受与固体支持物的表面平行的水平力(F)，这导致复合体上的张力(T)。[〇〇59]图8B描述了对于图8A中所示的物理情景，张力与水平力之比(T/F)作为系链长度与颗粒半径之比(L/a)的函数。
[0060]发明详述
[0061]应该意识到，本文所展示和描述的特定实施方式仅仅是示例，并非意指以任意方式对本申请的范围另作限定。
[0062]本文所引用的已公布的专利、专利申请、网站、公司名称及科学文献通过引用的方式全文并入本文，以至就如同各自被特别地及单独地指示为通过引用方式而并入那样的程度。在本文所引用的任意参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突应当按照有利于后者的方式来解决。同样，在单词或短语按现有技术来理解的定义与本说明书中所特别教导的该单词或短语的定义之间的任何冲突应当按照有利于后者的方式来解决。[〇〇63]在本说明书中使用时，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”“一种”和“该” 以及不使用量词的情形同样特别地包含它们指代的术语的复数形式。术语“大约”和“基本上”在本文中用来意指近似、在...附近、大致或左右。当术语“大约”和“基本上”结合数字范围来使用时，它通过扩展在所述数字值以上和以下的边界来修饰该范围。一般而言，术语 “大约”和“基本上”在本文中被用来修饰在规定值以上及以下的数字值达小于约20%的变化。
[0064]本文所使用的技术和科学术语具有本申请所涉及领域的技术人员通常所理解的含义，除非另有定义。在本文中对本领域技术人员已知的各种方法和材料进行引用。阐释重组DNA技术一般原理的标准参考工具书包括Sambrook等人，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual，’’第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1989)； Kaufman等人编，“Handbook of Molecular and Cellular Methods in B1logy in Medicine，’’CRC Press,Boca Raton(1995);和McPherson编，“Directed Mutagenesis:A Practical Approach，” IRL Press，0xford( 1991)，各自的公开内容通过引用整体并入本文中。
[0065]术语“靶标分析物”或“分析物”在本文中用于表示试验样品中待检测的分子。根据本发明，试验样品中可存在任意数目的不同靶标分析物(从一个到一千个，或者甚至更多)。 靶标分析物可以是存在天然的或人工制备的特异性结合成员的任何分子。靶标分析物的实例包括但不限于核酸、寡核苷酸、DNA、RNA、蛋白质、肽、多肽、氨基酸、抗体、碳水化合物、月旨质、激素、类固醇、毒素、维生素、为了治疗和非法目的施用的任何药物、细菌、病毒、细胞、以及任何抗原物质、半抗原、抗体、代谢物、水污染物(例如，硝酸盐、磷酸盐、重金属等)和有气味的分子(例如含硫和/或氮的化合物，例如硫化氢、氨、胺类等)及其组合。
[0066]在一个优选的实施方式中，靶标分析物是核酸。核酸可来自任何来源，呈纯化形式或未纯化形式，包括DNA( dsDNA和ssDNA)和RNA，包括tRNA、mRNA、rRNA、s iRNA、线粒体DNA和 RNA、叶绿体DNA和RNA、DNA-RNA杂合体、或其混合物、基因、染色体、质粒、生物材料(包括微生物例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人类)的基因组及其片段。核酸可以是单链DNA，其是通过使双链DNA暴露于核酸外切酶(例如，核酸外切酶III)而得到的。 靶标分析物可通过本领域众所周知的程序从各种生物材料获得。[〇〇67]在另一种优选的实施方式中，靶标分析物是含有少于约200个碱基对或少于约200 个核苷酸的短核酸。一般而言，使用基于PCR的技术难以检测这类分子，因为往往不能在这样的短序列中找到合适的引物。小DNA分子的一种特例是少于约40个核苷酸的分子。这些分子比标准PCR引物(每个引物约20个核苷酸)的组合尺寸还要小。短核酸分子在自然界很常见，实例有小干扰RNA(siRNA)、微-RNA(miRNA)及其前体、pr1-miRNA和pre-miRNA、以及细胞死亡后产生的和存在于血液、尿和其它体液中的片段化DNA分子。
[0068]术语“探针”在本文中理解为表示一种或多种下述分子，所述分子能够与靶标分析物结合并且还能够与固体支持物或颗粒(取决于语境)偶联。探针具有能够与靶标分析物结合的区域。术语“第一探针”在本文中理解为表示能够与颗粒偶联的探针。术语“第二探针” 在本文中理解为表示能够与固体支持物偶联的探针。例如，如果靶标分析物是核酸、寡核苷酸、DNA或RNA，则第一探针和第二探针二者中能够结合靶标分析物的区域可包含具有与靶标分析物互补且能够与其杂交的序列的核酸、寡核苷酸、DNA或RNA分子。又例如，如果靶标分析物是蛋白质、肽、多肽或氨基酸，则第一探针和第二探针二者中能够结合靶标分析物的区域可包含与靶标分析物特异性结合的抗体或抗原结合片段。
[0069]术语“偶联”指的是探针和表面之间、或者探针和与表面共价或非共价相连的另一分子之间的共价结合或非共价结合。术语“结合”指的是探针和靶标分析物之间的共价相互作用或非共价相互作用。在任何一种情况下，非共价相互作用可以是，例如，离子的、通过氢键等。
[0070]该公开内容中所使用的术语“抗体”指的是免疫球蛋白或其抗原结合片段。
[0071]术语“抗原结合片段”指的是包含负责抗体和抗原之间的特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。对于某些抗原，抗原结合结构域或者抗原结合片段可仅与抗原的一部分结合。被抗体特异性识别并结合的那部分抗原被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域和抗原结合片段包括Fab(抗原结合片段);F(ab’)2片段，其是具有两个Fab片段的二价片段，两个Fab片段通过铰链区的二硫键相连;Fv片段;单链Fv片段(scFv)参见例如，Bird 等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85: 5879-5883);具有两个Vh和ChI结构域的Fd片段；dAb(Ward等人，(1989)Nature 341: 544-546)，和保留抗原结合功能的其它抗体片段。Fab片段具有VH-CH1和Vl-Cl结构域，它们通过恒定区之间的二硫键共价连接。Fv片段较小并且具有非共价连接的VH和Vl结构域。为了克服非共价连接结构域解离的趋势，可以构建scFvdcFv含有柔性多肽，所述柔性多肽(1)将VH的 C-末端与Vl的N-末端相连，或者(2)将Vl的C-末端与VH的N-末端相连。可使用15-mer (Gly4Ser)3肽作为连接子，但本领域已知其它连接子。利用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式评估片段的功能。[〇〇72]术语“伸长区域”指的是由靶标分析物、第一探针和第二探针形成的复合体的一部分，其足够长以至于当复合体将颗粒与固体支持物连接在一起时，可检测到的颗粒的位移并且将其与和固体支持物非特异性相连的颗粒的位移区分开。在优选的实施方式中，伸长区域是长度为约〇.15wii至约20mi的生物分子，例如多糖、多肽或核酸。在甚至更优选的实施方式中，伸长区域是长度为约0.5M1至约5mi的双链核酸。
[0073]术语“试验样品”或“样品”在本文中可交换使用，其包括但不限于能够通过本文所述的本发明的方法检测的生物样品，包括人类和动物体液例如全血，血清，血浆，脑脊液， 尿，淋巴液，呼吸道、肠道和泌尿生殖道的各种外分泌物，眼泪，唾液，乳，白血细胞，骨髓瘤及其类似物，生物流体例如细胞培养上清液、固定组织试样和固定细胞试样，PCR扩增产物或者上述样品之一的纯化产物。“样品”可包括气态介质，例如环境空气、化学或工业中间物、化学或工业产物、化学或工业副产物、化学或工业废物、呼出气体、内燃机排气或顶空蒸汽(例如食品、饮料、化妆品周围的蒸汽，植物或动物组织周围的蒸汽和微生物样品周围的蒸汽)。与本发明有关的“样品”的另一实例是通过溶解经由过滤气态样品收集到的物质而产生的液体溶液或者通过使液体暴露于气态样品而产生的液体溶液。额外的样品介质包括超临界流体例如超临界C〇2游离物(extricate)。其它示例性介质包括液体例如水或含水溶液、油或含油产品、油-水乳液、液态的化学或工业中间物、液态的化学或工业产物、液态的化学或工业副产物、和液态的化学或工业废物。额外的示例性样品介质包括半固体介质例如动物或植物组织，微生物样品，或者含明胶、琼脂或聚丙烯酰胺的样品。
[0074]术语“固体支持物”在本文中用于表示适合与探针偶联且经得起本文所公开的检测方法的检验的任何固体材料。可能合适的材料数目巨大且本领域技术人员容易了解。
[0075]术语“颗粒”用于表示适合与探针偶联且经得起本文所公开的检测方法的检验的任何固体物或荧光分子。
[0076]术语“表面”用于表示固体支持物和颗粒的外层。[〇〇77]在示例性实施方式中，固体支持物或颗粒可由以下材料组成:改性的或官能化的玻璃、无机玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、铁氟龙、多糖、尼龙或硝化纤维、树脂、和其它聚合物)、碳、金属、陶瓷、二氧化硅或二氧化硅基材料包括硅和改性硅以及硅片。在某些方面，表面可以是复合材料。
[0078]可以利用分子通过物理吸附或化学吸附使表面官能化。在优选的实施方式中，利用探针或者利用能够与探针偶联的分子使表面官能化。这类官能化方法在本领域是已知的。例如，可以利用在其3’_末端或5’_末端处经烷烃硫醇改性的核酸使金表面官能化。参见，例如，Whitesides,Proceedings of the Robert A.Welch Foundat1n 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry，Houston,Tex?，第109-121页 (1995)。另请参见Mucic等人，Chem.Commun.555-557(1996)(描述了将3 ’硫醇DNA连接到平坦金表面上的方法;该方法可用于将寡核苷酸连接到纳米颗粒上)。烷烃硫醇方法还可用于将寡核苷酸连接到其他金属和半导体。用于将寡核苷酸连接到包含硫代磷酸酯基团的固体表面上的其它官能团(参见，例如，美国专利N0.5，47 2，881，用于使寡核苷酸-硫代磷酸酯结合到金表面上)、经取代的烧基娃氧烧(参见，例如Burwell，Chemical Technology ,4,370-377(1974)以及Matteucci and CaruthersJ.Am.Chem.Soc.,103,3185-3191(1981)用于使寡核苷酸结合到二氧化硅和玻璃表面上;和Grabar等人，Anal.Chem.，67，735-743，用于氨基烷基硅氧烷的结合并用于巯基烷基硅氧烷的类似结合)。以5 ’硫代核苷或3 ’硫代核苷终止的寡核苷酸还可用于将寡核苷酸连接到固体表面。对本发明重要的表面官能化的另一实例是通过物理吸附或者通过直接或间接化学连接键将抗体和其它结合成员固定到表面上。 例如，可以通过将链霉亲和素分子化学连接到表面上来使表面官能化，其能够与包含一个或多个生物素分子的探针偶联。以下参考文献描述了将生物素标记的寡核苷酸连接到链霉亲和素官能化表面上。Shaiu等人，Nucleic Acids Research, 21,99(1993)。地高辛 (Digoxigenin)和抗-地高辛抗体也可用于将探针连接到表面上。
[0079]可以通过单层的一种或多种分子使表面官能化。本领域众所周知产生自组装单层的方法。特别地，存在一些已知方法用来在金属表面上组装硫醇盐单层。参见，例如Love， J.C.等人，Chem.Rev.,105,1103(2005).〇
[0080]上述表面官能化方法可用来偶联能够防止或减少与表面非特异性相互作用的分子。例如，固定到分析物结合分子(例如ssDNA或抗体)的表面上之后，常常进行阻断非特异性相互作用的蛋白质的表面上的物理吸附。用作阻断剂的常见蛋白质有:牛血清白蛋白(BSA)、鱼血清和乳蛋白，例如酪蛋白。
[0081]以下参考文献描述了可用于将寡核苷酸连接到表面上的其它方法:Nuzzo等人， J.Am.Chem.Soc.,109,2358(1987)(金上的二硫化物)；All ara 和 Nuzzo，Langmuir，1，45 (1985)(错上的駿酸)；Allara和Tompkins，J.Colloid Interface Sci ?，49,410-421 (1974) (铜上的羧酸)；Iler, The Chemistry Of Silica,第6 章，(Wiley 1979)(二氧化娃上的羧酸)；Timmons和Zisman，J ? Phys ? Chem ?，69，984-990 (1965)(钼上的駿酸)；Soriaga和 Hubbard，J.Am.Chem.Soc.,104,3937(1982)(钼上的芳环化合物)；Hubbard， Acc.Chem.Res.，13，177( 1980)(钼上的环丁砜、亚砜和其它官能化溶剂)；Hickman等人， J.Am.Chem.Soc.，111 ,7271( 1989)(铂上的异腈类)；Maoz和Sagiv，Langmuir ,3,1045(1987) (二氧化娃上的娃烧)；Maoz和Sagiv，Langmuir，3,1034(1987)(二氧化娃上的娃烧)； Wasserman等人，Langmuir ,5,1074(1989)(二氧化娃上的娃烧)；Eltekova 和Eltekov， Langrnuir，3，951 (1987)(二氧化钛和二氧化娃上的芳族羧酸、醛类、醇类和甲氧基)；Lec等人J.Phys.Chem.,92,2597(1988)(金属上的刚性磷酸盐)。
[0082]在本文中使用时，根据本发明能够产生的“可检测到的信号”包括但不限于电信号、机械信号、光信号、听觉信号或热信号。在优选的实施方式中，可检测到的信号是光信号或电信号。
[0083]在本文中使用时，“聚合物”是由单体形成的分子，其中每个单体与其它单体共价连接。
[0084]术语“单体”在本文中用于指能够在被称为聚合的过程中与相同分子或其它分子结合的分子。聚合反应可以是脱水反应或缩合反应(由于形成水(H20)作为一种产物)，其中氢原子和羟基(一0H)基团丢失从而形成H20以及每个单体单元之间的氧分子键。
[0085]术语“单体”包括可组装成聚合物的任何化学基团。多种单体可被用于合成聚合物。例如，本发明的聚合物可以由具有从其骨架垂下的疏水基团和/或亲水基团的单体组成。因此，聚合物可包括从结构重复的骨架垂下的侧链“R”。示例性的带侧链骨架包括:
[0086]—(CO—N(—R)—CH2) —；
[0087]— (0—S i (—CH3) (—R))—;
[0088]— (CH2—CH (—R) —CO—NH)—；
[0089]--(CH2--CH(—R )—0) — ;和
[0090]—(CH2—C6H4—CO—N(—R))—；[0091 ]--(CH2--CHR)--S--(CH2--CH2--CHR)--;
[0092]-- (CF2—CFR)或一(CF2—CF2—CFR)—;和
[0093]-- (CH2—CH (—C0—NHR))—。[〇〇94]适用于本发明中的聚合物的实例有聚氧化乙烯(PE0)、聚乙二醇(PEG)、聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酸、聚甲基丙稀酸酯和聚乙稀卩比略烧酮(PVP)、聚乙稀基(polyvinyls)、聚酯、聚娃氧烧、聚酰胺、聚氨酯、聚碳酸酯、氟聚合物、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯、 聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯和聚氯乙烯(PVC)。
[0095]合适聚合物的额外实例包括但不限于，本说明书中引用的参考文献中所述的那些和通过应用并入本文中的那些。关于分子结构的命名以及可用于本发明的单体和侧链结构的描述可在美国专利出版N0.U.S.2009/0011946中找到，其通过引用整体并入本文中。
[0096]在本文中使用时，术语“多糖”指的是由通过糖苷键连接在一起的重复单元(单糖或二糖)形成的聚合碳水化合物结构。本发明的多糖优选地是线性的，但也可含有不同程度的分支。此外，多糖通常是异质的，含有略微修饰的重复单元。适合本发明的多糖的实例包括同多糖或均聚糖，其中多糖中的所有单糖为同一种类型;和杂多糖或杂聚糖，其中存在多于一种单糖。在示例性实施方式中，多糖是淀粉、糖原、纤维素或几丁质。[〇〇97] 本发明的多糖具有通式Cx(H20)y。在一些实施方式中，X为约100至约100000、约200 至约10000、约500至约5000或约1000至约2000。在另一种实施方式中，多糖在聚合物骨架中具有约为六碳单糖的重复单元并且可以用通式(C6H1Q〇5)n来代表，其中n为约30至约100000、 约200至约10000、约500至约5000或约1000至约2000。
[0098]在本文中使用时，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可交换使用，其指的是任意长度核苷酸的聚合形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物、或其混合物。该术语仅仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链的、双链的和单链的脱氧核糖核酸(〃DNA〃)，以及三链的、双链的和单链的核糖核酸(〃RNA〃)或RNA/ DNA杂合体。还包括经修饰的(例如，通过烷基化和/或通过加帽)和未经修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸 (包含2-脱氧-D-核糖)，聚核糖核苷酸(包含D-核糖)，包括tRNA、rRNA、siRNA和mRNA，无论是经拼接的或未经拼接的，为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，和包含非核苷酸骨架的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNAs))和聚吗啉基(可商购自Ant1-Virals, Inc.，Corvallis，0reg?的Neugene)，和其它合成的核酸聚合物，条件是所述聚合物含有其构型允许碱基配对和碱基堆积的核酸碱基，例如在DNA和RNA中发现的。术语核苷酸包括其杂合体，例如PNAs和DNA或RNA之间的杂合体，并且还包括已知类型的修饰例如，标签、烷基化、“帽子”、用类似物取代一个或多个核苷酸，内部核苷酸修饰例如， 具有不带电的连接键(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)、具有带负电的连接键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和具有带正电的连接键(例如，氨基烷基磷酰胺酯、氨基烷基磷酸三酯)的那些;含有悬挂片段的那些，例如蛋白质(包括酶(例如，核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；含有嵌入剂(例如，吖啶和补骨脂素)的那些;含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些;含有烷基化剂的那些;含有改性连接键(例如，异头核酸等)的那些。
[0099]在本发明的实践中，具有确定序列的寡核苷酸被用于多种目的。制造预定序列的寡核苷酸的方法众所周知。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)和F.Eckstein(编)01igonucleotides and Analogues，第 1 版(Oxford University Press，New York, 1991)。固相合成法对于寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸二者来说都是优选的(众所周知的DNA合成法也可用于合成RNA)。寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸也可以通过酶法制备。
[0100]在本文中使用时，术语“多肽”指的是由(优选地a-氨基酸、D-氨基酸、L-氨基酸及其组合的)以确定的顺序的连接键形成的聚合物。术语“肽”、“寡肽”和“蛋白质”包含在多肽的定义内。该术语包括含有多肽的翻译后修饰(例如，糖基化、乙酰化、磷酸化和硫化)的多肽。此外，蛋白质片段、类似物(包括并非由遗传密码编码的氨基酸、例如高半胱氨酸、鸟氨酸、D-氨基酸和肌酸)、天然的或人工的突变体或变体或其组合、融合蛋白、衍生化残基(例如，胺基的烷基化、羧基的乙酰化或酯化)等包含在多肽的含义内。一个氨基酸残基和下一个氨基酸残基之间的键被称为酰胺键或肽键。该术语并非指特定长度的多肽。
[0101]在一些实施方式中，一个探针或者两个探针的伸长区域包含非生物亲水性聚合物，例如聚氧化乙烯(PE0)、聚乙二醇(PEG)、聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、聚丙烯酰胺 (PAM)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)或其组合。[〇1〇2]在优选的实施方式中，一个探针或者两个探针的伸长区域和/或靶标分析物包含生物分子，例如多糖、多核苷酸、或多肽、或其组合。
[0103]—个优选的实施方式是检测样品中的靶标分析物的方法。在这种方法中，提供复合体，复合体由以下物质形成:第一探针，其与颗粒偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合;和第二探针，其与固体支持物偶联并且与如果存在的话，分析物结合，以使得如果样品中存在靶标分析物，则颗粒通过由第一探针和第二探针以及靶标分析物形成的复合体与固体支持物间接偶联;且其中复合体包含伸长区域。应该理解的是，所提供的复合体可以以任何可能的方式和步骤顺序形成。同样清楚的是，进行复合体形成步骤中的任何步骤的人员不必是实施方法中随后步骤(即，施加力或者测量布朗运动)的人员。
[0104]优选地，第一探针、第二探针和靶标分析物包含核酸或寡核苷酸。更优选地，第一探针和第二探针各自包含用于结合靶标分析物的区域。第一探针偶联颗粒的位置与靶标分析物结合第一探针的位置不同。第二探针偶联固体支持物的位置与靶标分析物结合第二探针的位置不同。由第一探针和第二探针以及靶标分析物形成的复合体包含伸长区域。在一个优选的实施方式中，由第一探针和第二探针以及靶标分析物形成的复合体的伸长区域包含总长度为约500个碱基对至约60000个碱基对(例如，约1500个碱基对至约15000个碱基对)的双链DNA。
[0105]在优选的实施方式中，如果靶标分析物是核酸，则核酸靶标可与第一探针中未配对的核苷酸和第二探针中未配对的核苷酸形成碱基对。在这种实施方式的一方面，第一探针还包含用于偶联颗粒的区域。例如，第一探针可包含与核酸的5’或3’末端共价连接的蛋白质、肽或抗原。
[0106]在另一优选的方面，靶标分析物不是核酸。当靶标分析物不是核酸时，第一探针和第二探针优选包含抗体。
[0107]在另外一个优选的方面，靶标分析物是核酸且第一探针和第二探针与靶标上彼此相距至少500个核苷酸的位置处结合。根据这方面，靶标可以是双链的或者单链的。当靶标是单链的时，延伸它所需的力显著高于延伸双链核酸所需的力(Current Opin1n in Structural B1logy 2000，10:279;Nucleic Acids Research 2014(42) ,3:2064)。可通过改变溶液性质(例如，离子强度和温度)和/或添加与单链结合的分子来更改延伸单链核酸所需的力。[〇1〇8]当靶标分析物是核酸分子时，优选在高严格度(stringency)条件下使靶标分析物暴露于第一探针和/或第二探针。高严格度条件有利于与探针中的单链核酸完美互补或基本完美互补的核酸分子的杂交并且使没能完美互补或基本完美互补的靶标的结合更加不可能。在靶标溶液暴露于第一探针和/或第二探针之后，洗涤或者使探针暴露于具有高严格度的介质也能够移除非完美互补的分子。高严格度条件出现在高温、低盐浓度和高pH下。某些化学物质(例如，甲酰胺)的存在也能提高溶液的严格度。在实施方式中，当进行使靶标暴露于探针和洗涤时，优选在20 °C-70 °C之间的温度、0.01M-1M之间的离子强度和7-8之间的 pH下进行。
[0109]本发明的一些方法包括“暴露”步骤，其中使探针、颗粒和/或固体支持物暴露于样品或彼此。这些暴露步骤可以以任何顺序进行或者甚至同时进行。例如，在一种实施方式中，在向颗粒施加力和测量位移之前，以下列顺序暴露反应物:a)使第一探针和第二探针暴露于靶标分析物，b)使包含用于偶联固体支持物的第一末端的第二探针暴露于固体支持物，c)使包含用于偶联颗粒的第一末端的第一探针暴露于颗粒。如果在允许反应物结合或偶联的条件下进行这些步骤且如果样品中存在靶标分析物，则颗粒经由由靶标、第一探针和第二探针形成的复合体与固体支持物间接偶联。然而，在本发明的另一实施方式中，以相反的顺序进行各步骤(c-b-a)。如果在允许反应物结合或偶联的条件下进行这些步骤且如果样品中存在靶标分析物，则颗粒像以前一样与固体支持物间接偶联:经由第一探针、靶标分析物和第二探针。在另一种示例性实施方式中，可以同时进行所有步骤。如果在允许反应物结合或偶联的条件下进行这个单独步骤且如果样品中存在靶标分析物，则颗粒以与之前的两个实例相同的方式与固体支持物间接偶联:经由第一探针、靶标分析物和第二探针。如果每个步骤均在允许反应物结合或偶联的条件下进行，则任意顺序和/或组合的同时进行的步骤将具有相同的结果。[〇11〇] 在优选的实施方式中，颗粒是直径为约0.1_至约20_、或约0.3_至约5WI1的固体珠粒。优选的珠粒材料有:二氧化硅基玻璃，例如石英和硼硅酸盐;锆和有机聚合物，例如聚苯乙烯、三聚氰胺树脂和聚丙烯腈。
[0111]在优选的实施方式中，颗粒是直径为约0.5WI1至约5WI1的超顺磁性珠粒。超顺磁性珠粒通常用于生物技术应用中。它们由其中含有铁磁性材料小(<约1〇11111)颗粒的聚合物基体组成。铁磁性颗粒的小尺寸使其具有超顺磁性。因此，珠粒只有在外部磁场的影响下才有磁性。
[0112]在一些实施方式中，颗粒是量子点。量子点通常小于约10nm且由展示出量子力学性质的半导体材料制成。由于这些性质，量子点的电学特性与单个晶体的尺寸和形状有关。 量子点是发荧光的且发射频率随量子点尺寸的减小而增加。因此，可通过量子点的尺寸来控制其颜色。
[0113]在一些实施方式中，颗粒是纳米棒。优选的，纳米棒的长度为至少约0.5wii。本领域已知制造纳米棒或纳米线的方法。参见例如，Hahm和Mieber,Nano Lett,4,51-54(2004)(娃纳米棒)；Li 等人，Appl.Phys.Lett.4,4014-1016(2003)(In203 纳米棒)；Liu等人， Phys.Ev.B.58,14681-14684( 1998)(铋纳米棒)；Sun 等人，Appl.Phys.Lett.74,2803( 1999) (银纳米棒)；Ji等人，J ? Electrochem.Soc ? 150，C523_528(2003) (Au/Ag多层和多节纳米棒)；Celedon等人，Nano Lett ?，9，1720-1725(2009) (Pt/Ni多节纳米棒)；0’ Brien等人， Adv.Mater.18,2379-2383(2006)(聚合物纳米棒)；Liu等人Nanotechnology 20,415703 (2009)(超顺磁性和铁磁性Ni纳米棒)。[〇114]在一些实施方式中，颗粒包含荧光分子。这些分子是本领域技术人员已知的。例如，可以在PCR反应中产生荧光核酸，其中反应混合物中的一种脱氧核苷酸具有荧光标记。该程序常用的标记的脱氧腺苷三磷酸是荧光素-12-dATP。标记核酸分子的实验流程是现成的(Nucl.Acids Res.(1994)22(16):3418;Nat B1technol?(2008)26(3):317;Nat B1technol.(2000) 18(2):233)。荧光分子的另一实例是单一荧光团，例如Cy3和其它青色素，以及荧光素。
[0115]在一些实施方式中，可以在用至少两种颗粒施加力之前或之后标记探针和/或靶标，其中一种颗粒在探针-靶标复合体的一端，另一种颗粒在另一端。在一种实施方式中，可基本沿着复合体的伸长区域的长度用荧光分子对其进行标记。例如，伸长区域可以是用核酸荧光染料(例如Y0Y0-1)标记的双链DNA。可以在施加力之后，由所述颗粒的位置测定伸长区域的近似长度。在这些实施方式中，基于伸长区域的长度区分非特异性相互作用。如果观察到伸长区域的全长，则表示存在靶标分析物。相反，如果观察到伸长区域的一部分长度， 则表示通过非特异性相互作用连接到固体支持物上。[〇116]图1A中展示了本发明的一种实施方式。根据这种实施方式，使第一探针和第二探针暴露于包含靶标分析物的样品。靶标分析物与第一探针和第二探针二者结合之后，将颗粒引入偶联第一探针的样品中。颗粒偶联第二探针之后，使样品暴露于固体支持物，其中第二探针与固体支持物偶联。如在别处所解释的，使探针暴露于样品、固体支持物和/或颗粒的顺序可以变化。因此，例如，可以在使靶标分析物暴露于第一探针和第二探针之前，使颗粒暴露于第一探针。
[0117]图1B中展示了本发明的另一种实施方式。根据这种实施方式，使第二探针暴露于包含靶标分析物的样品。第二探针包含对靶标分析物特异的抗体。靶标分析物与探针结合之后，将颗粒引入样品中。利用包含对靶标分析物特异的抗体的第一探针使颗粒官能化。第一探针与靶标分析物结合之后，使样品暴露于固体支持物，其中第二探针与固体支持物偶联。如在别处所解释的，使探针暴露于样品、固体支持物和/或颗粒的顺序可以变化。因此， 例如，可以在使靶标分析物暴露于第二探针之前，使第一探针暴露于靶标分析物。
[0118]图2中展示了本发明的其它实施方式。根据这些实施方式，分析物包含核酸且探针包含核酸。一种探针包含用于偶联颗粒或固体支持物的第一末端或区域;和用于结合分析物的第二末端或区域；以及包含第二分析物结合区域的颗粒或固体支持物。在一种实施方式中(图2A)，第一探针(1)与颗粒(4)表面共价连接。靶标分析物(3)结合第一探针(1)和第二探针(2)之后，使样品暴露于固体支持物(5)，其中第二探针(2)与固体支持物偶联。如在别处所解释的，使探针暴露于样品、固体支持物和/或颗粒的顺序可以变化。在另一种实施方式中(图2B)，第二探针(2)是与固体支持物(5)偶联的核酸。可以在使靶标分析物(3)暴露于第二探针(2)之前使靶标分析物(3)暴露于第一探针(1)，或者可以在使靶标分析物(3)暴露于第一探针(1)之前使靶标分析物(3)暴露于第二探针(2)。在另一种替代性实施方式中， 可以使靶标分析物同时暴露于探针和固体支持物。靶标分析物结合第一探针和第二探针二者之后，将颗粒引入样品中，其中颗粒与第一探针偶联。或者，可以在暴露于样品之前和/或在暴露于第二探针之前，使第一探针与颗粒偶联。
[0119]图4中展示了本发明的另一实施方式。根据这种实施方式，使第一探针(1)和第二探针(2)暴露于包含靶标分析物(3)的样品。可以在使靶标分析物暴露于第二探针之前使靶标分析物暴露于第一探针，或者可以在使靶标分析物暴露于第一探针之前使靶标分析物暴露于第二探针。在另一种替代性实施方式中，可以使靶标分析物同时暴露于第一探针和第二探针。靶标分析物结合第一探针和第二探针二者之后，将颗粒(4)引入样品中，其中颗粒与第一探针偶联。颗粒与第一探针偶联之后，使样品暴露于固体支持物(5)，其中第二探针与固体支持物偶联。或者，可以在使靶标分析物暴露于第一探针和第二探针之前，使颗粒暴露于第一探针。[〇12〇]在一方面，根据一些实施方式，向颗粒施加力。力场作用于颗粒并将其从初始位置拉开(例如，磁场作用于磁性颗粒或者向颗粒施加拖拽力的流)。在一定条件下，使设备暴露于样品，以使得如果存在靶标分析物，则由靶标分析物以及第一探针和第二探针形成复合体。因此，当施加力时，与复合体相关联的颗粒移动的距离是复合体长度的函数。如图3中所示，这种位移(8)的量指示特异性结合。相应地，与固体支持物非特异性结合的颗粒(7)如果移动的话，则其移动距离将比特异性结合颗粒的移动距离短。[0121 ]在一种实施方式中，在一定条件下，使检测设备暴露于样品，以使得通过探针连接的珠粒的数目与靶标分析物的浓度成比例。以这种方式，可检测到的信号与靶标分析物的浓度成比例，从而允许测定样品中靶标分析物的浓度。
[0122]优选的实施方式使用具有多种不同长度的伸长区域的探针，其中每种一定长度的探针具有能够结合特定靶标分析物的区域，以使得每种探针长度与不同的靶标分析物相关。在这种实施方式中，可以在单个试验中测定样品中多种靶标分析物的近似浓度，这是通过测量施加力之后颗粒的不同位移，基于位移量将它们分组和计算与每种可能的位移相关的颗粒的数目来实现的。
[0123]在相关实施方式中，通过以下述方式修饰具有伸长区域的探针进一步增强复用能力:每种探针可具有多于一种长度且长度变化由外部动因触发。能够触发长度变化的外部动因的实例有温度、离子强度、PH、力、辅助分子(例如核酸，酶、清洁剂等)。在这些实施方式中，触发长度变化之前和之后，在测量颗粒位移之后确定靶标的身份。可触发长度变化多次。例如，在含有100个具有伸长区域的不同探针的试验中，可通过触发长度变化之前具有 10种不同长度的一组探针产生特异于不同靶标分析物的每种探针，其中每种探针在触发长度变化之后经受10种可能的不同长度变化中的一种。带有长度可被外部动因改变的伸长区的探针的实例是这样的探针，其中探针中的两个遥远位置以形成内部环的方式相互作用。 在这种情况下外部动因可触发内部环的释放或形成。触发长度变化所需的外部动因的特征由相互作用的特征来控制。例如，如果相互作用是核酸分子之间的杂交，则可使用特定序列类调节触发动因的特征。能够触发通过核酸分子之间的杂交形成的内部环释放的外部动因的一个实例是与在保持内部环的杂交区域中的一种分子互补的辅助核酸。当使探针暴露于这种辅助核酸时，辅助核酸可取代杂交区域中的一条链，从而释放环。外部动因的另一个实例是具有第一区域和第二区域的辅助核酸，其中第一区域与核酸探针中的第一区域互补， 第二区域与探针中的第二区域互补。当使探针暴露于这种核酸时，核酸结合产生内部环的探针中的两个区域。在相关实施方式中，辅助分子是可以以释放或形成内部环为目的类似于上述核酸使用的蛋白质。
[0124]本发明的表面和探针可以与许多不同的分析物结合分子相连，因此许多靶标分析物可触发珠粒与固体支持物的连接。
[0125]在一种实施方式中，固体支持物可具有区域阵列，每个区域包含特异于唯一靶标分子的第二探针。因此，将固体支持物暴露于样品会在阵列中的不同位置处捕获不同靶标。所以，在特定阵列区域中检测到颗粒位移指示样品中存在相应的靶标分子。根据这种实施方式，提供用于产生具有任何数目的不同靶标分析物(例如，一千或者甚至更多中的任何两个)的样品的唯一图谱或指纹的方法。就这一点而言，可将来自不同样品的图谱储存在数据库中并/或出于诊断目的进行比较以检测疾病或病症。
[0126]另一种实施方式使用多种可区分的颗粒，其中每种不同颗粒包含特异于不同分子的不同的第一探针。例如，利用不同抗体使不同颜色的荧光珠粒官能化，针对每种珠粒颜色使用一种抗体。以这种方式，通过检测在力的作用下迀移的相连珠粒的颜色来鉴定样品中存在的特定靶标分子。或者，可以使用不同尺寸的珠粒或者可区分的成串荧光分子或颗粒 (Nat.B1tech.26，317-325，2008)〇
[0127]在一些实施方式的优选方面，施加的力是流体拖拽力。这种类型的力是通过其中浸有颗粒和/或分子的液体溶液的流动产生的。更准确来说，当液体的速度与颗粒和/或分子的速度之间存在差异时，便施加这种力。这种力通常平行于固体支持物，但如果固体支持物有孔，它也可以具有垂直于固体支持物的要素。在优选的实施方式中，颗粒接近固体支持物表面且流动基本平行于固体支持物的表面。在这些实施方式中，流体的速度随着远离固体支持物的表面而增加，且不仅产生基本平行于固体支持物表面的线性力而且还产生力矩。术语“流体拖拽”和“流体拖拽力”用于表示颗粒所经受的线性力和力矩(当其存在时)二者的组合。在优选的实施方式中，颗粒的直径或长度小于约20微米且流动是层状的，雷诺数小于约1。通常，颗粒和/或分子在毛细管内部且可利用通过软管与毛细管相连的栗(例如， 注射栗)来产生流动。产生合适流动的另一种方法是在与毛细管相连的栗上施加外部压力。 压力使少量流体移入毛细管中，这使颗粒远离施加压力之处的毛细管侧迀移。释放软管中的压力使珠粒以相反方向迀移。
[0128]在一些实施方式的一方面，施加在颗粒上的力是流体浮力。这种类型的力等于颗粒所取代的流体的重量且方向与重力相反。
[0129]在一些实施方式的一方面，施加的力是磁力。在这些实施方式中，颗粒是磁性珠粒，例如超顺磁性珠粒。力是磁场存在的结果，磁场可以利用永磁体(例如，铁或稀土磁体、 或电磁体)产生。磁力可用于拖拉颗粒远离玻璃表面，从而使得经由伸长区域连接的颗粒迀移至高于与表面非特异性结合的颗粒的平面。利用能够获取平行于固体支持物的平面的图像的成像系统可光学检测这种类型的迀移。在这种成像系统中，当颗粒移动到不同焦平面时，这种类型的迀移产生衍射谱的变化。或者，磁力可用于在平行于固体支持物表面的方向拖拉颗粒。使用光学系统，这种类型的迀移容易被检测为图像中颗粒位置的变化。[〇13〇]在一些实施方式的另一方面，施加的力是重力。在这些实施方式中，力的方向始终朝向地球中心，因此其相对于固体支持物的方向由固体支持物的空间定向决定。[〇131]在一些实施方式的另一方面，施加的力是离心力。在这些实施方式中，使颗粒经受改变方向的运动。优选地，运动是旋转运动。
[0132]在一些实施方式的另一方面，施加的力是电力。当具有不同电压的至少两个电极被引入溶液时会产生电压梯度，从而产生电力。
[0133]在一些实施方式的另一方面，利用流动、后退弯月面(receding meniscus)或电压梯度向靶标-探针复合体施加力。
[0134]在另一种实施方式中，使形成的复合体与基本扁平的固体支持物偶联，并经受基本平行于固体支持物的力。在这种实施方式中，对力进行选择以使得它从支持物上移除非特异性结合颗粒。然后，使用合适的检测方法，剩余颗粒的存在指示样品中存在靶标分析物。
[0135]在利用基本平行于固体支持物的力的实施方式中，例如施加基本平行于固体支持物的流体拖拽力的实施方式，力可以移除非特异性结合颗粒而不会显著减弱信号，因为伸长区域作为复合体的一部分减小了靶标分析物所经受的力。当在与固体支持物结合的颗粒上施加基本平行于固体支持物的力时，系链上的张力随系链长度减小(Langmuir 1996,12 (9):2271)。因此，非特异性相互作用(其通常是约10nm长的系链)经受的张力显著高于伸长的复合体中结合的靶标经受的张力。在本发明的实施方式中，长系链的这种性质允许移除非特异性结合颗粒而不显著影响特异性结合颗粒。使用包含大于特定试验中出现的非特异性系链的伸长区域的复合体能够改善该试验中非特异性结合颗粒的选择性去除。如果连接的颗粒是接触固体支持物的半径为a的球体，固体支持物经受平行于固体支持物的力，如图 8A中所示，则可以通过平衡力和力矩计算作为水平力(F)的函数的系链(长度为L)中的张力 ⑴。图8B展示了张力与水平力的比值(T/F)作为系链长度与颗粒半径之比(L/a)的函数。对于小于颗粒半径一半的系链长度，系链中的张力大幅增加。例如，对于颗粒半径的0.01倍的系链来说，张力比水平力高7倍;而对于颗粒半径的2倍的系链来说，张力仅比水平力高6% 倍。在施加基本平行于固体支持物的流体拖拽力的实施方式中，通过拖拽力施加在颗粒上的力矩进一步增大了短系链与长系链所经受的张力之差。
[0136]直接或间接经由施加于颗粒的力来向由靶标分析物以及第一探针和第二探针形成的复合体施加力能够增加检测系统的靶标特异性，这通过移除其中靶标不是探针的结合区域的精确结合搭档的复合体来实现。当靶标是核酸时，在大多数情况下，如果靶标与在探针中的核酸区域不能完美互补，则会发生这种情况。施加力是杂交严格度的新形式。这种严格度可以通过当探针与靶标结合时由探针形成的结构的构型来调节。特别地，对于核酸来说，探针可以与处于两种主要类型的构型的靶标杂交。在第一种构型中，双链体的轴朝着力的方向且施加力倾向于同时破坏所有碱基对。在第二种构型中，双链体的轴垂直于力的方向且施加力倾向于从靠近施力点开始以渐进顺序破坏碱基对。可以通过施加的力的量来调节严格度(Current Opin1n in Chemical B1logy 2008,12:640，PNAS 2006(103),16: 6190)。
[0137]在本文中使用时，术语“螺旋”指的是经受旋转力的两种或更多种聚合物的束所遭受的构型改变。当两种线性聚合物通过使来自每种聚合物的第一末端在一个位置结合在一起且聚合物的第二末端在第二个位置结合在一起而被结合在一起时，如果一种聚合物的第二末端围绕另一种聚合物的第二末端旋转，这两种聚合物将彼此缠绕，则发生“螺旋”的简单例子。随着旋转积累，两种聚合物将开始呈现更紧凑的构型。这种现象在本发明中被称为 “螺旋”。螺旋的另一种例子是“超螺旋”。在这种情况下，两条或更多条核酸链通过碱基配对并且在不存在扭转应力彼此缠绕的情况下连接。当链从其天然缠绕量缠绕或者松开时，“超螺旋”发生。“超螺旋”结构具有扭曲(PNAS 1978,75(8)3557)。
[0138]在一些实施方式中，本发明可被并入2013年4月25日公开的题为“用于检测靶标分析物的检测单元和方法”国际专利公开W0 2013/059044、2014年4月10日公开的美国专利申请公开US 2014/0099635A1和2014年4月24日递交的美国临时申请61/983,684中所述的试验中，这些公开的内容通过引用并入本文中。在这些实施方式中的一些之中，并且参考本发明的图5A，颗粒可以是磁性颗粒(4)且两种探针均可以是双链DNA分子，第一探针(1)偶联具有至少两个连接点的颗粒，且第二探针(2)偶联具有至少两个连接点的固体支持物。此外， 第一探针和第二探针具有结合不同于靶标分析物(3)的第二分子(9)的区域，以使得当靶标和第二分子二者均与探针结合时，整个复合体由两条链组成，一条链包含靶标，另一条链包含第二分子。如果通过旋转磁场向磁性颗粒施加旋转力，则复合体中积累扭转应力，扭转应力达到一定水平之后，会形成显著缩短复合体的末端-到-末端距离的超螺旋。因此，超螺旋能够容易以以下形式被检测到:颗粒布朗运动的减少或者在施加力的条件下颗粒(4)位移的减少。这种策略可用来提高系统中非特异性相互作用的区分和特异性。复合体中的扭转应力倾向于比完美匹配的靶标更快地破坏错配的靶标。因此，需要首先珠粒迀移然后复合体超螺旋的靶标检测强加了提高靶标特异性的第二条件。此外，由于非特异性结合的珠粒不能超螺旋，所以能够区分非特异性相互作用。
[0139]在其它实施方式中，并参考图5B，第一探针是环状双链DNA分子，其中一条链具有被称为“活性区段”(1〇)的不连续区域。由于这种不连续性，环状分子不能超螺旋。不连续链具有活瓣(flap)，所述活瓣具有与靶标分析物(3)的不同区域互补的序列。当靶标分析物 (3)与活性区段(10)结合时，其桥接不连续链的两侧，从而使得环状分子能够超螺旋。如果向第一探针施加旋转力，例如通过嵌入分子，则探针中积累扭转应力，这会形成明显改变探针构型的超螺旋。因此，超螺旋能够容易以以下形式被检测到:颗粒(4)布朗运动的改变或者在施加力的条件下颗粒(4)位移的改变。如在上述实施方式中，这种策略可用来提高系统中非特异性相互作用的区分和特异性。在其它实施方式中，并参考图5C，第一探针包含环状双链DNA分子，其中一条链具有不连续性且颗粒包含荧光分子(11)。第一探针可具有多个荧光标签。不连续链具有活瓣，所述活瓣具有与靶标分析物(3)的不同区域互补的序列。当靶标分析物(3)与活性区段(10)结合时，其桥接不连续链的两侧，从而使得环状分子能够超螺旋。如果向第一探针施加旋转力，例如通过嵌入分子，则探针中积累扭转应力，这会形成明显改变探针构型的超螺旋。因此，超螺旋能够容易以以下形式被检测到:在施加力的条件下颗粒位移的改变或者在施加力的条件下复合体长度的改变。如在上述实施方式中，这种策略可用来提高系统中非特异性相互作用的区分和特异性。
[0140]在本发明的一些实施方式中，使用成像系统检测颗粒位移，其中成像系统生成由传感装置检测到的颗粒和/或探针_靶标复合体的图像。该图像可以是规则的图像或者物体的转换示意图例如阴影。成像系统由四个主要组件组成:照明、样本、成像部件和检测器，它们被有序放置在空间路径上。成像系统的一个例子是光学显微镜，在这种情况下，成像部件是透镜。光学显微镜为本领域技术人员众所周知。光学显微镜可以通过利用散射、吸收或相位差的图像对比而使未染色样品可视化，或者利用荧光或者光发射的其它方案使染色样品可视化。显微镜中使用的光源可以是相干光源(例如，激光)或非相干光源(例如，LED或白光源)。显微镜的透镜可以是单个透镜、一系列透镜或者复合透镜，其通常被称为物镜。巨视显微镜(macroscope)是成像系统的另一个例子。巨视显微镜与显微镜之间的主要差别是它们使用的透镜/物镜。显微镜透镜的放大率通常等于或者大于IX，这表示图形的尺寸大于物体。这导致视野小。巨视显微镜的放大率可小于IX，这允许大区域的可视化。无透镜的成像系统是成像系统的另一个例子。这种类型的系统使用数字光电传感器阵列，例如电荷耦合装置(CCD)或CMOS芯片对穿过样品传播的光直接取样，而不在物体和传感器平面之间使用成像透镜(Greenbaum，Nat.Methods 2012,9，9,889-895;Gurkan，U.A.等人， B1technol ? J? 2011，6，138-149)。无透镜的超广视野细胞监测阵列平台(LUCAS) (Ozcan，A.和Demirci，U.Lab Chip,2008,8,98-106)是这种类型显微镜的一个例子。LUCAS平台基于将微观物体的“阴影图像”记录在传感器阵列平面上。用非相干光源或激光均匀照亮微观物体。利用CCD或CMOS传感器阵列数字记录细胞阴影图形。相干成像系统是成像系统的另一个例子。这种类型的系统使用物体来调节照明激光束并且使经调节的激光束干扰参照激光束或相同照明束，然后记录干扰信息以重建物体的信息。数字全息术(Javidi，Opt.Lett.， 2000,25,9,610-612)和同轴全息术(Xu，PNAS, 2001,98,20,11301-11305)是这种技术的例子。
[0141]在一些实施方式中，由螺线管中的感应电流检测磁性颗粒的位移。
[0142]如上所述，本发明还涉及用于检测样品中的靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包含:a)颗粒;和b)第一探针，所述第一探针能够与分析物结合，并且能够与固体支持物或者颗粒结合，所述第一探针任选地包含长度为约0.15M1至约20wii的伸长区域;c)包装材料;和任选的d)使用说明。在一个特定实施方式中，试剂盒可进一步包含第二探针，所述第二探针能够在不同于第一探针与分析物结合的位置的位置处与分析物结合，且其还能够与固体支持物或者颗粒结合。第二探针可任选地包含长度为约0.15M1至约20wii的伸长区域。如果第一探针用于和固体支持物偶联，则第二探针用于和颗粒偶联;且如果第一探针用于和颗粒偶联，则第二探针用于和固体支持物偶联。包装材料将是本领域技术人员已知的，且在某些实施方式中，将包括常规的瓶子(bottle)、小瓶(vial)、盒子等。任选的使用说明优选地包括包含在包装材料内的常规印刷材料。
[0143]除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实践或试验中可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的那些，但下文描述了合适的方法和材料。如果发生冲突，则以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅仅是示例性的且并非旨在限制。
[0144]实施例1
[0145]该实施例展示了使用磁性珠粒检测样品中的低浓度靶标的程序。以下列方式产生第一探针:使用切割质粒(约1万个碱基对)一次的限制酶使其线性化。购买能够连接到线性化质粒上的两类短DNA分子(IDT):第一短DNA分子用地高辛标记，第二短DNA分子具有与靶标的一部分互补的单链区域。将两类短DNA分子连接到线性化质粒上。购买第二探针(生物素标记的单链分子)(IDT)，其具有与靶标的一部分互补的序列。购买包覆有链霉亲和素的超顺磁性珠粒(Life Technologies)。将第一探针和第二探针以高浓度(>0.01yM)与样品混合并孵育几分钟。将磁性珠粒加入溶液中并孵育几分钟。为了洗涤未结合的分子，使溶液暴露于吸引磁性珠粒的外部磁体，从而将它们从溶液中移除。从容器中提取溶液并丢弃。拿走外部磁体并将珠粒悬浮在缓冲溶液中。然后使珠粒流入先前用抗-地高辛蛋白质(Roche)官能化的毛细管中，进行沉淀以及与管表面相互作用。为了洗涤未结合的珠粒，当磁体经过毛细管时，流动新的缓冲液。将大磁体放置在毛细管上以提起剩余的未结合珠粒。使用与毛细管底部直接接触的图像传感器获得仍然与毛细管底部相连的珠粒的图像。使管中的溶液以拖拽珠粒的方向流动，然后，颠倒流动的方向以向相反方向拖拽珠粒。该过程期间珠粒的连续图像显示:一些珠粒在每个方向移动约3微米，而剩余的与表面结合的珠粒不移动或者显著较少地移动。在每个方向移动约3微米的珠粒通过探针和靶标的复合体与玻璃表面结合。 样品中靶标分子的初始浓度决定了这些珠粒的数目。
[0146]实施例2
[0147]该实施例遵循与前述实施例相同的程序，但不是使溶液在毛细管中流动以辨别与探针相连的珠粒，而是检测珠粒的布朗运动。通过探针与固体支持物相连的珠粒经受布朗运动并且在直径约为1微米的圆内移动。可以将这些珠粒与和固体支持物非特异性结合的珠粒区分开，后者的运动显著较少。
[0148]实施例3
[0149]该实施例展示了具有结核杆菌rRNA的一部分的序列的60个核苷酸(nt)的合成DNA 寡核苷酸靶标的检测。第一探针购自IDT并且由24nt的单链寡核苷酸组成，所述单链寡核苷酸具有与靶标的3’末端互补的序列和5’生物素修饰。第二探针以下述方式产生:使用限制酶BsmB I(New England B1labs)使质粒(8.5kbps)线性化，BsmB I切割质粒两次从而产生了在每个末端具有不同的4nt突出部分的大片段(约8.4kbps/2.8微米)，和小片段，其通过琼脂糖凝胶纯化(QIAquick Gel Extract1n Kit,Qiagen)被分离和丢弃。使用T4连接酶将线性化的质粒连接到通过杂交合成的寡核苷酸而产生的两个双链DNA片段上。第一个片段的一个末端具有与质粒的一个突出部分相容的突出部分，另一个末端具有与靶标的5’末端互补的30nt突出部分。第二个片段的一个末端具有与质粒的另一个突出部分相容的突出部分，片段的另一个末端具有5’地高辛修饰。将第一探针与含有靶标的溶液混合并将温度升高至65°C持续1分钟，然后在室温下孵育10分钟。缓冲液包含800mM NaCl。添加与第一探针互补的阻断寡核苷酸并孵育5分钟。添加第二探针并孵育10分钟。添加包覆有链霉亲和素的超顺磁性珠粒(Life Technologies)并孵育30分钟。然后使混合物流入先前用抗-地高辛蛋白质(Roche)官能化的玻璃毛细管(50mm x 2mm x 0.2mm)中并使珠粒沉淀5分钟。使100mM NaCl缓冲液流动以洗涤未结合的珠粒。首先在不流动时获取仍然与毛细管底部相连的珠粒的图像(45张图像)，然后在流动时获取仍然与毛细管底部相连的珠粒的图像(160微升/分， 45张图像)。或者，首先在向一个方向流动时获取珠粒的图像(160微升/分，45张图像)，然后在向相反方向流动时获取珠粒的图像(160微升/分，45张图像)。用于获取珠粒图像的光学系统由LED环形灯、远心透镜和照相机组成。LED环形灯提供暗场照明。机器视觉中普遍使用的远心透镜对于不同距离的物理展示出相同的放大率。透镜具有约500微米的巨大景深。系统的放大率为1:1，这有助于实现6.14mmX4.6mm的大视野。根据透镜的光学分辨率，每个颗粒的图像尺寸为约4微米，这足以研究颗粒的位移。系统中使用的相机具有1/2.3英寸互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片，其具有4384 X 3288像素且像素尺寸为1.4微米。[〇15〇]用在Matlab中写的自定义代码分析图像并测定视野中出现的大部分珠粒的位移。 彼此过于接近(小于约6微米)的珠粒不被包括在分析内。珠粒的位置被定义为45张图像中其位置的平均值。该系统允许在每个实验中以亚微米分辨率测量超过3000个珠粒的位移。 代码产生了珠粒位移的直方图(图6)。当在不流动的情况下获取第一系列图像时(图6A)，移动多于2.5微米的珠粒被视为与靶标-探针复合体结合(直方图中的右侧峰)。移动少于2.5 微米的珠粒被视为与毛细管表面非特异性结合。大多数移动少于2.5微米的珠粒移动了少于0.5微米并且具有平均为0的位移。这些珠粒的数目通常多于2000。当在流动的情况下获取第一系列图像时(图6B)，移动多于约5微米的珠粒被视为与靶标-探针复合体结合(直方图中的右侧峰)。
【主权项】
1.检测样品中的靶标分析物的方法，所述方法包括:a)提供复合体，所述复合体由以下物质形成:i)第一探针，其与颗粒偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，和i i)第二探针，其与固体支持物偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，以使得如果所述样品中存在所述靶标分析物，则所述颗粒通过由所述靶标分析物以及 所述第一探针和第二探针形成的复合体与所述固体支持物间接偶联，并且其中所述复合体 包含伸长区域;和b)i)向间接偶联的颗粒或者包含伸长区域的复合体施加力并测量颗粒位移的量或者 所述复合体的长度，其中位移的量或者所述复合体的长度指示所述样品中是否存在所述靶 标分析物，或者i i)测量间接偶联的颗粒的布朗运动，其中布朗运动的量指示所述样品中是 否存在所述靶标分析物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一探针包含与所述靶标分析物相结合的第一 抗体且所述第二探针包含与所述靶标分析物相结合的第二抗体。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一探针包含与所述靶标分析物的第一区域杂 交的第一核酸且所述第二探针包含与所述靶标分析物的第二区域杂交的第二核酸。4.如权利要求1所述的方法，其中所述伸长区域位于所述第一探针、所述第二探针、所 述靶标分析物或其任意组合之上。5.如权利要求4所述的方法，其中所述伸长区域包含生物分子或非生物聚合物。6.如权利要求5所述的方法，其中所述生物分子包含伸长的核酸、多糖、多肽或其组合。7.如权利要求4所述的方法，其中所述伸长区域包含聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇 (PEG)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺 (PEI)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其组合。8.如权利要求1所述的方法，其另外包括以下步骤:使所述第一探针与所述颗粒偶联。9.如权利要求1所述的方法，其另外包括以下步骤:使所述第二探针与所述固体支持物 偶联。10.如权利要求1所述的方法，其另外包括以下步骤:使所述样品暴露于所述第一探针 和使所述样品暴露于所述第二探针。11.如权利要求10所述的方法，其中有顺序地或者同时进行另外的步骤。12.如权利要求11所述的方法，其中在一个或多个步骤之后，所述方法另外包括洗涤步骤。13.如权利要求1所述的方法，其中施加到所述颗粒上的力是磁力、流体浮力、流体拖拽 力、机械力、电力、离心力或重力。14.如权利要求1所述的方法，其中施加到包含所述伸长区域的所述复合体上的力是利 用流体流动、后退弯月面或电压梯度产生的。15.如权利要求1所述的方法，其中所述伸长区域的长度范围为约0.15wii至约20wii。16.如权利要求1所述的方法，其中在单个试验中检测多于一个靶标，且其中基于所述 复合体与所述固体支持物结合后所述靶标产生的不同颗粒位移或者颗粒布朗运动的量来 区分所述靶标。17.如权利要求1所述的方法，其中至少一种探针包含伸长区域，所述伸长区域具有至少一个可以释放或者形成的内部环，且其中释放或者形成所述环会改变颗粒位移的量。18.如权利要求17所述的方法，其中利用力、离子强度、温度或pH的变化来释放或者形 成所述探针的内部环。19.如权利要求18所述的方法，其中利用辅助分子来释放或者形成所述探针的内部环。20.如权利要求1所述的方法，其中在单个试验中检测多于一个靶标，且其中使用至少 两种不同的第二探针，所述第二探针在与其靶标结合之前在不同位置与所述固体支持物偶 联，且其中基于所述复合体与所述固体支持物结合的位置来区分所述靶标。21.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒的长度或直径范围为约0.3wii至约20wii。22.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒。23.如权利要求22所述的方法，其中所述磁性颗粒是超顺磁性的。24.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒是发荧光的。25.如权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中测量所述颗粒的布朗运动。26.如权利要求1所述的方法，其中采用带透镜的成像系统或者利用无透镜显微镜或者 利用相干成像技术，来测量所述颗粒的位移。27.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标分析物是核酸分子。28.如权利要求27所述的方法，其另外包括:控制所述样品的温度以使所述样品中的双 链核酸变性且/或所述样品中的核酸与所述第一探针和第二探针特异性杂交。29.如权利要求27所述的方法，其中首先用核酸外切酶处理所述样品以将双链核酸转 化为单链核酸。30.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标分析物包括蛋白质、碳水化合物、脂质、激 素、类固醇、毒素、维生素、半抗原、代谢物、药物或其组合。31.如权利要求12所述的方法，其中使所述第一探针和第二探针暴露于所述样品以形 成溶液;然后将所述颗粒加入所述溶液中；接着将含所述颗粒的溶液加入与所述第二探针 相结合的毛细管中以形成结合复合体;洗涤所述结合复合体;在施加力存在或者不存在的 情况下测定所述颗粒的第一位置;然后在朝不同方向施加的力的存在下测定所述颗粒的第 二位置或者任选地，如果颗粒位置是之前在施加力存在下测定的，则在施加力不存在的情 况下测定所述颗粒的第二位置;并从所述第一位置和第二位置测定颗粒位移。32.如权利要求3所述的方法，其中所述靶标分析物是核酸，且所述第一探针和第二探 针与所述靶标上彼此相距至少约500个核苷酸的位置结合。33.如权利要求1所述的方法，其中临界数目的具有特定位移或者布朗运动的颗粒指示 所述样品中存在所述靶标分析物。34.如权利要求1所述的方法，其中由具有特定位移或者布朗运动的颗粒的数目估计所 述靶标在所述样品中的浓度。35.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括:向所述间接偶联的颗粒或者向所述复 合体施加扭转力或旋转力，然后测量所述复合体中螺旋的量。36.检测样品中的靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包含:a)颗粒;和b)第一探针，所述 第一探针能够与所述分析物结合，并且能够与固体支持物或者所述颗粒结合，所述第一探 针任选地包含长度为约〇.15mi至约20mi的伸长区域;c)包装材料;和任选的d)使用说明。37.如权利要求36所述的试剂盒，其另外包含:第二探针，所述第二探针能够在不同于所述第一探针与所述分析物结合的位置的位置处与所述分析物结合，且其还能够与固体支 持物或者所述颗粒结合，所述第二探针任选地包含长度为约〇.15wii至约20wii的伸长区域， 其中如果所述第一探针用于和所述固体支持物偶联，则所述第二探针用于和所述颗粒偶 联;且如果所述第一探针用于和所述颗粒偶联，则所述第二探针用于和所述固体支持物偶联。38.检测样品中的靶标分析物的方法，所述方法包括:a)提供复合体，所述复合体由以下物质形成:i)第一探针，其与颗粒偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，和 i i)第二探针，其与固体支持物偶联并且与如果存在的话，所述分析物结合，以使得如果所述样品中存在所述靶标分析物，则所述颗粒通过由所述靶标分析物以及 所述第一探针和第二探针形成的复合体与所述固体支持物间接偶联，且其中所述复合体包 含伸长区域;和b)利用能够移除非特异性结合颗粒的具有平行于所述固体支持物的要素的力向间接 偶联的颗粒施加力，其中施加力之后所述颗粒的存在指示所述样品中存在所述靶标分析 物。
【文档编号】G01N33/53GK105980854SQ201580007600
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年2月5日
【发明人】阿尔弗雷多·安德烈斯·赛乐顿, 萨拉瓦纳·拉达·克里什纳·穆尔蒂, 许志广, 丹尼尔·爱丽丝·舒尔茨, 托里·艾伦·霍恩
【申请人】思甘诺基公司