包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱及其制造和使用的方法

包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱及其制造和使用的方法
【专利摘要】提供了包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱。还提供了包括主题装置的试剂盒以及使用所述装置的方法，例如用于样品制备(诸如蛋白质纯化)方案中。
【专利说明】包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱及其制造和使用的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年2月21日提交的美国临时专利申请序列 第61/943,174号和2014年6月4日提交的美国临时专利申请序列第62/007,798号的提交日 期的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式并入本文中。
[0003] 引言
[0004] 从非均质混合物中纯化出蛋白质通常是使用待纯化蛋白质的物理、化学和电性质 的多步骤方法。与纯化相关的重要蛋白质特征是蛋白质的溶解度、电荷、大小和具体结合容 量。因此，蛋白质的分离和清除由于这些生物分子的不同的化学和物理性质而特别具有挑 战性。此外，从中分离出蛋白质的物质还有所分离的蛋白质的后续应用是多样性的。因此对 延伸用于纯化和分离蛋白质的已存在技术感兴趣。
[0005] 概述
[0006] 提供了包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱。还提供了包括主题装置的试剂盒以及使 用所述装置的方法，例如用于样品制备(诸如蛋白质纯化)方案中。
[0007] 附图简述
[0008] 图1提供了多种旋转柱配置的视图，包括经配置以符合收集管的旋转柱。
[0009] 图2A至图2B提供了与多孔板相容的呈96单元阵列形式的旋转柱阵列以及其封盖 和未封盖个别旋转柱的视图。
[0010] 图3描绘了用根据本发明的一个实施方案的2型（刷状)膜旋转柱从600yL细胞溶解 产物中纯化出的墨绿多管水母GFP (AcGFP)。
[0011] 图4描绘了用根据本发明的一个实施方案的2型（刷状)膜旋转柱从900yL细胞溶解 产物中纯化出的AcGFP。
[0012] 图5描绘了用根据本发明的实施方案的具有呈顶侧向上（向上)或顶侧向下（向下） 配置的膜的1型(逐层(LBL))膜旋转柱从200yL细胞溶解产物中纯化出的AcGFP。
[0013] 图6描绘了用根据本发明的实施方案的具有呈顶侧向上（向上)或顶侧向下（向下） 配置的膜的2型(刷状)膜旋转柱从200yL细胞溶解产物中纯化出的AcGFP。
[0014] 图7描绘了用根据本发明的实施方案的具有呈顶侧向上（向上)或顶侧向下（向下） 配置的膜的1型(LBL)膜旋转柱纯化出的聚组氨酸标记的泛素(HisU)。
[0015] 图8描绘了用根据本发明的实施方案的LBL或刷状膜旋转柱纯化出的HisU。
[0016] 图9描绘了用根据本发明的实施方案的具有呈顶侧向上（向上)或顶侧向下（向下） 配置的膜的2型(刷状)膜旋转柱从900yL细胞溶解产物中纯化出的AcGFP。
[0017] 图10描绘了使用根据本发明的实施方案的具有单层顶侧向下(样品Ι-d)或双层顶 侧向上膜配置的膜旋转柱在细胞溶解缓冲液中使用咪唑从细胞溶解产物中纯化出的 AcGFP〇
[0018] 图11描绘了用根据本发明的实施方案的各种LBL膜从500yL细胞溶解产物中纯化 出的紫外GFP(GFPuv)。
[0019] 图12A至图12B描绘了用根据本发明的实施方案的各种LBL膜从490yL细胞溶解产 物中纯化出的GFPuv。
[0020] 图13A至图13B描绘了用根据本发明的实施方案的各种LBL膜从470yL细胞溶解产 物中纯化出的GFPuv。
[0021]
[0022] ??另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领 域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。但为了清楚和容易参考起见，以下仍定 义某些要素。
[0023]短语"金属离子亲和性组合物"是指具有与配体/金属离子络合物键接的聚合物基 质的物质组合物。本公开的金属离子亲和性组合物可以变化且在一些情况下利用螯合剂， 例如能固定金属离子以形成配体/金属离子络合物的配体。本公开的螯合剂可以变化且包 括能够充当多齿配体，例如多齿螯合配体、二齿螯合配体、三齿螯合配体、四齿螯合配体、五 齿螯合配体、六齿螯合配体等的那些试剂。
[0024] 短语"螯合剂"在本文中与术语"配体"可互换使用。在一些情况下，术语配体是用 来指多齿配体与其所键接的中心原子之间的个别相互作用，即，个别键。举例来说，三齿螯 合配体可被认为具有三个配体，或与中心原子，例如金属离子形成具有三个配体的结构。此 类配体键是可逆的且因此，此类配体/中心原子络合物可以通过改变螯合配体和中心原子 所存在的环境条件而缔合和离解。此类络合物的中心原子可以是金属离子(更详细描述于 下文中），且可以因此形成配体/金属离子络合物。在某些情况下，此类配体/金属离子络合 物对特定蛋白质或特定蛋白质基序，例如金属离子亲和肽具有亲和力。
[0025] 所述组合物可以带电或不带电。组合物当其配体与金属离子络合时带电。相反，络 合物当其配体未络合且不含金属离子时不带电，但可以与金属离子络合。
[0026] 短语"金属离子源"是指包括金属离子的物质组合物，诸如流体组合物。如本文中 所使用，术语金属离子是指亲和肽对其具有亲和力且可以用于纯化或固定融合蛋白质的任 何金属离子。此类金属离子包括但不限于附 2+、0)2+^3+^13+、2112+和(：1 12+。如本文中所使用， 术语"硬金属离子"是指对氧显示出结合偏好的金属离子。硬金属离子包括Fe 3+、Ca2+和Al3+。 如本文中所使用，术语"软金属离子"是指对硫显示出结合偏好的金属离子。软金属离子包 括Cu+、Hg 2+和Ag+。如本文中所使用，术语"中间金属离子"是指络合氮、氧和硫的金属离子。 中间金属离子包括Cu2+、Ni 2+、Zn2+和Co2+。
[0027] 如本文中所使用，术语"接触"意指使在一起或放在一起。因而，当例如通过使第一 个物品与第二个物品彼此相触而使其在一起或放在一起时，第一个物品与第二个物品接 触。
[0028] 如本文中所使用的术语"样品"是指流体组合物，其中在某些实施例中，所述流体 组合物是水性组合物。如本文中所使用，样品可以是研究实验样品，例如在研究实验室中生 成的样品。
[0029] 如本文中所使用，短语"在...存在时"意指事件在对象存在时发生。举例来说，如 果两种组分在存在第三组分时得以混合，则所有三种组分被混合在一起。
[0030] 短语"氧化态"是以其常规意义使用，参见例如Pauling,General Chemistry (Dover Publications,NY.)(1988)〇
[0031]术语"亲和肽"、"高亲和力肽"和"金属离子亲和肽"在本文中可互换用于指结合金 属离子的肽，诸如富组氨酸或HAT肽。术语"亲和标记的多肽"是指亲和肽例如出于纯化或固 定目的而融合的任何多肽，包括蛋白质。
[0032] 术语"杂聚物"和"共聚物"在本文中可互换用于指来源于至少两个种类的组成单 元，即单体的那些聚合物，并且可以定义为不同种类的组成单元如何排列。举例来说，共聚 物可以是交替共聚物，其中所述共聚物的各单元与一个或多个不同的单元交替（例如，-X-γ-(χ-γ-) η…、-χ-γ-ζ-(χ-γ-ζ-)η…等等）。或者，共聚物可以是周期性共聚物，其中所述共聚 物的单元以重复顺序排列(例如，?-"^-)^··、?^-"^^-)^··、-"-Υ-Χ-Υ-Υ-Χ-Χ-Χ-Χ-Υ-Υ-Υ-) η...等等）。周期性共聚物可以是嵌段共聚物，其中一个种类内 的组成单元倾向于与相同种类的另一个成员结合(例如，-(Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-) n-(Υ-Υ-Υ-Υ-Υ-Υ-Υ-)η…）。共聚物可以是统计共聚物，其中组成单元的顺序遵循统计规则，例如，随机共聚 物(例如，沿共聚物链的任何位置具有与整个聚合物中所存在的单体X和Υ的相对量成比例 的相等的被单体X或单体Υ占据的概率的共聚物）、梯度共聚物(例如，占据共聚物中特定位 置的单体X的概率向着共聚物的相对端增加或降低的共聚物)等等。构成杂聚物的组成单元 的种类数目变化并且可以是任何数值，例如，在一些情况下，所述种类数目可以介于2-20的 范围内，例如2至10、2至5、2至4、4至10或3至7。
[0033] 杂聚物或共聚物可以是"线性的"，即，由单个主链组成的杂聚物或共聚物，或"分 支的"，即，由至少两个链，例如单个主链和至少一个侧链组成的杂聚物或共聚物。构成分支 共聚物的侧链的数目变化并且可以是任何数值，且例如，在一些情况下，可以介于1-20的范 围内，例如1至1〇、1至5、1至3、2至4、4至10或3至7。
[0034]如本文中所使用，术语"分支共聚物"可以指含有两种不同的均聚物，例如单体X的 主链均聚物和单体Υ的至少一种侧链均聚物的共聚物。该术语还可以指含有主链均聚物和 至少一种侧链杂聚物，例如单体X的主链均聚物以及单体γ和单体ζ的至少一种侧链杂聚物 的共聚物。该术语还可以指含有主链杂聚物和至少一种侧链均聚物，例如单体Υ和单体Ζ的 主链杂聚物以及单体X的至少一种侧链均聚物的共聚物。在一些情况下，单体物质可以存在 于主链聚合物和侧链聚合物中，例如单体X的主链均聚物以及单体X和单体Υ的至少一种侧 链杂聚物，或单体X和单体Υ的主链杂聚物以及单体X的至少一种侧链均聚物。因而，本公开 的分支杂聚物或共聚物可以是接枝共聚物，即，侧链在结构上与主链不同的分支共聚物。
[0035] 如本文中所使用，术语"分支共聚物"亦可指特殊分支共聚物或特殊分支共聚物的 组合或非特殊分支共聚物与特殊分支共聚物的组合。特殊分支共聚物的非限制性实例包括 星状共聚物、刷状共聚物、梳状共聚物、二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、连接嵌段共聚物、三 聚物等等。
[0036] 如本文中所使用，术语"共聚物"还可以指"立体嵌段共聚物"或由重复单体形成空 间结构使得嵌段由各嵌段的等规度定义的共聚物。立体嵌段共聚物包括含有二价基(例如 内消旋二价基和外消旋二价基）、三价基（例如等规三价基、间规三价基和杂规三价基）、四 价基、五价基等嵌段的那些共聚物。举例来说，在某些实施例中，立体嵌段共聚物可以是或 可以包括"共晶聚合物"，即，由共晶大分子组成的聚合物，其中所述共晶大分子的取代基是 按沿聚合物主干的顺序或模式排列。共晶聚合物的实例包括但不限于等规聚合物、间规聚 合物等等。举例来说，在某些实施例中，立体嵌段共聚物可以是或可以包括"等规聚合物"， 即，由内消旋二价基组成且含有等规大分子的聚合物，其中所述大分子的取代基全都位于 大分子主干的同一侧上。在某些实施例中，本公开的立体嵌段共聚物可以是或可以包括"间 规"或"错规聚合物"，即由外消旋二价基组成且含有间规大分子的聚合物，其中所述大分子 的取代基沿主干链交替位置。
[0037] 如本文中所使用，术语"立体嵌段共聚物"还可以指或还可以包括"无规聚合物"， 即，由介于1%与99%之间的内消旋二价基组成且含有无规大分子的聚合物，其中所述无规 大分子的取代基沿主干链随机分布。
[0038] 关于本公开的聚合物或聚合物组合件的定义被视为本领域技术人员通常已知的 那些定义。此类定义可见于例如Whelan T. (1994)Polymer technology dictionary. London: Chapman&Hal 1中，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。
[0039] 详述
[0040] 提供了包括聚(酸)膜分离基质的旋转柱。还提供了包括主题装置的试剂盒以及使 用所述装置的方法，例如用于样品制备(诸如蛋白质纯化)方案中。
[0041] 在更详细地描述本公开的方法和试剂盒之前，应理解，所述方法和试剂盒不局限 于所描述的具体实施方案，因而当然可以变化。还应该理解，本文中所使用的技术名词仅出 于描述具体实施方案的目的，而不意图具有限制性，因为所述方法和试剂盒的范围将仅受 所附权利要求书限制。
[0042]在提供值的范围时，应理解，除非上下文另外清楚指出，否则介于该范围的上限与 下限之间的各居中值(直至距下限十分之一个单位)和该所述范围中的任何其他所述值或 居中值都涵盖所述方法和试剂盒内。根据该所述范围中的任何明确排除的界限，这些较小 范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围中，并且也涵盖在所述方法和试剂盒 内。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些所包括的界限中的任一者或两者 的范围也包括在所述方法和试剂盒中。
[0043] 某些范围在本文中是利用前缀有术语"约"的数值来提供。术语"约"在本文中用于 给以其为前缀的准确数值以及接近于或近似于以该术语为前缀的数值的数值提供字面支 持。在确定数值是否接近于或近似于明确叙述的数值时，接近或近似的未叙述的数值可以 是在其存在的情况下提供明确叙述的数值的实质性相等的数值。
[0044] 除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与所述方法所属 领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文中所描述的那些类似或等 效的任何方法和试剂盒也可以用于所述方法和试剂盒的实践或测试中，但现在描述代表性 说明性方法和材料。
[0045] 本说明书中所引用的所有出版物和专利都以引用的方式并入本文中，就如同各个 别出版物或专利被明确地且个别地指出是以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文 中以结合所引用的出版物来公开和描述所述方法、试剂盒和/或材料。对任何出版物的引用 都是由于其公开内容在提交日期之前，而不应该被视为承认本发明方法和试剂盒由于现有 发明而无权优先于此类出版物。此外，所提供的出版物日期可能与实际出版物日期不同，这 可能需要独立地证实。
[0046] 应注意，除非上下文另外清楚指出，否则如本文中和所附权利要求书中所使用，单 数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数个参考物。还应注意可起草权利要求书以排除任何 任选要素。因而，这种陈述意图充当结合权利要求要素的叙述来使用诸如"仅仅"、"仅"等排 他性术语或使用"否定"限制的前提基础。
[0047]应了解，个别实施方案的内容中出于清楚性目的而描述的方法和试剂盒的某些特 征还可以呈组合型式提供于单个实施方案中。相反，单个实施方案的内容中出于简便目的 而描述的方法和试剂盒的各种特征还可以个别地或呈任何合适的子组合形式提供。所述实 施方案的所有组合明确地被本发明涵盖且公开于本文中，就如同个别地且明确地公开各个 和每个组合，达到此类组合涵盖可操作方法和/或装置/系统/试剂盒的程度。另外，例如描 述此类变量的实施方案中所列出的所有子组合也明确地被本发明方法和试剂盒涵盖且公 开于本文中，就如同各个及每个此类子组合个别地且明确地公开于本文中。
[0048]如本领域技术人员在阅读本公开后显而易见，本文中所描述和说明的个别实施方 案各自具有可在不背离本发明方法和试剂盒的范围或精神的情况下容易地与其他若干个 实施方案中任一个的特征分开或组合的离散分量和特征。任何所叙述的方法都可以按叙述 要素的顺序或按逻辑上可能的任何其他顺序进行。
[0049] 旋转柱
[0050] 如以上所概述，本发明的方面包括经配置以分离复杂样品的组分的旋转柱。所述 旋转柱的方面包括细长空心结构，其具有第一端处的样品入口和第二端处的样品出口；和 聚（酸)膜基质，其位于所述细长空心结构中，使得流体必须流过所述聚(酸)膜以从所述第 一端横跨所述结构至所述第二端。
[0051] 所述聚（酸）膜基质可以变化。在一些情况下，所述聚（酸）膜基质包括被吸附至多 孔膜载体表面的聚(酸)组件。所述聚(酸)组件可以在所述多孔膜组件的表面上具有多种配 置。举例来说，所述聚（酸)组件可以在所述多孔膜的表面上布置为膜，例如涂层或层(包括 逐层)配置。或者，所述聚（酸)组件可以配置为多孔膜表面上的多个聚合物刷。多孔膜的表 面可以是任何表面，包括上表面、膜孔隙表面等，其中在一些情况下，膜的所有表面都可以 稳定地与聚(酸)组件缔合，例如吸附。
[0052] 配置为膜的聚(酸)组件的配置可以变化。举例来说，在一些情况下，经配置而呈涂 层配置的聚（酸）膜可以经配置而呈均聚物涂层形式。均聚物涂层配置是可以由均聚物，即 来源于单一种类的组成单元的聚合物构成的那些聚(酸)膜。均聚物涂层还包括可能由单一 种类的杂聚物或共聚物构成的那些聚(酸)膜，即均-杂聚物涂层。
[0053] 在某些实施方案中，经配置而呈逐层配置的聚（酸)膜可以经配置而呈杂聚物涂层 或杂聚物逐层配置。杂聚物逐层配置是可以由两种或更多种不同的杂聚物构成的那些聚 (酸)膜。杂聚物逐层配置还包括可能由至少两种不同种类的均聚物，即杂均聚物构成的那 些聚(酸)膜。
[0054]配置为多个聚合物刷的聚（酸）组件，即聚（酸）聚合物刷的配置可以变化。举例来 说，聚(酸）聚合物刷可以经配置而呈均聚物刷结构或者杂聚物或共聚物刷结构。均聚物刷 结构是可以由均聚物构成的那些聚(酸)聚合物刷。均聚物刷结构还包括可能由单一种类的 杂聚物或共聚物构成的那些聚(酸)聚合物刷，即均-杂聚物刷结构。杂聚物刷结构还包括可 能由至少两种不同种类的均聚物构成的那些聚(酸)聚合物刷，即杂-均聚物刷结构。
[0055]感兴趣的聚(酸)组件可以包括由任何适宜的均聚物或共聚物构成的聚(酸)膜和/ 或聚（酸)刷。均聚物和共聚物配置可以变化。可以控制均聚物和共聚物的合成以产生聚合 物嵌段的任何所期望的顺序或模式，以便产生特定的均聚物或共聚物以供用于聚(酸)组件 中。
[0056] 聚合物嵌段，无论是单元嵌段(例如，在共聚物中）还是结构嵌段(例如，立体嵌段 聚合物)的所期望的顺序或模式可以通过如例如以下文献中所描述的任何适宜的聚合物合 成或组装方法来实现:Braun等（2013)Polymer Synthesis:Theory and Practice.第5版 Springer;Ciferri A.(2005)Supramolecular Polymers，第2版CRC Press :Boca Raton, FL，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。举例来说，在某些实施方案中，聚合物 嵌段的所期望的顺序或模式可以通过以头至尾配置接合单元嵌段或结构嵌段来实现。在某 些实施方案中，聚合物嵌段的所期望的顺序或模式可以通过以头至头配置接合单元嵌段或 结构嵌段来实现。在某些实施方案中，聚合物嵌段的所期望的顺序或模式可以通过以尾至 尾配置接合单元嵌段或结构嵌段来实现。
[0057] 聚(酸)膜可以包括通过任何适宜的方法合成的那些聚（酸)膜。可用于合成聚(酸） 膜的方法可以变化，但可以包括例如通过借助于聚电解质与基底之间的电荷差异使聚电解 质附接至基底而使一种或多种聚电解质（即，具有带电基团的均聚物或共聚物)吸附至固体 基底上的方法。可用于合成聚(酸)膜的方法还可以包括随后借助于第一聚电解质与第二聚 电解质之间的电荷差异将第二聚电解质附接至第一聚电解质。在某些情况下，第二聚电解 质附接至第一聚电解质在第一聚电解质已经附接至基底之后发生。在一些实施方案中，聚 (酸)膜可以由单一聚电解质构成。在某些实施方案中，聚（酸)膜可以由两种或更多种不同 的聚电解质，包括例如3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多 种、8种或更多种、9种或更多种或者10种或更多种构成。
[0058]得以用于聚(酸)膜中的聚电解质可以广泛变化。举例来说，在一些情况下，此类聚 电解质可以表示阴离子聚电解质或聚阴离子，即与基底或其所附接的相邻聚电解质相比具 有更多负电荷的聚电解质。在一些情况下，此类聚电解质可以表示阳离子聚电解质或聚阳 离子，即与基底或其所附接的相邻聚电解质相比具有更多负电荷的聚电解质。由于特定聚 电解质的电荷可能取决于溶解聚电解质的溶液的特征，例如pH值，故特定聚电解质可能作 为聚阴离子或聚阳离子存在于不同的溶液中，例如具有不同的pH值的溶液中。因而，在某些 情况下，聚电解质还可以定义为弱聚电解质，例如，具有介于2至10范围内的pKa或pKb，或强 聚电解质，例如，具有在2至10范围之外的pKa或pKb。
[0059] 得以用于聚(酸)膜中的阴离子聚电解质包括但不限于可得自市面供应商的那些。 举例来说，在某些实施方案中，阴离子聚电解质是可得自Sigma-Aldri Ch(St.L〇uis，MO)的 那些，诸如聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸）、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸_共_ 丙烯腈）、聚(丙烯酸）、聚茴香脑磺酸、聚(4-苯乙烯磺酸钠）、聚(4-苯乙烯磺酸）、聚(4-苯乙 烯磺酸-共-马来酸）、聚（乙烯基硫酸酯）、聚（乙烯基磺酸）、4_苯乙烯磺酸、聚-L-谷氨酸、其 盐等等。
[0060] 得以用于聚(酸)膜中的阳离子聚电解质包括但不限于可得自市面供应商的那些。 举例来说，在某些实施方案中，阳离子聚电解质是可得自Sigma-Aldri Ch(St.L〇uis，MO)的 那些，诸如聚(烯丙胺盐酸盐）、聚(二烯丙基二甲基氯化铵）、二烯丙基二甲基铵、聚(丙烯酰 胺-共-二烯丙基二甲基氯化铵）、聚甲基丙烯酸(2_二甲基氨基）乙酯、聚乙烯亚胺、聚-L-谷 氨酸、8-苯胺基-1 -萘磺酸、其盐等等。
[0061 ]在某些实施方案中，在低pH值下，例如，在介于2至5之间的pH值(例如pH 3至5,例 如pH 3、pH 4或pH 4.7)下，使来源于阴离子聚电解质，例如聚(丙烯酸）（PAA)的聚(酸)膜吸 附至基底，例如多孔载体上。在某些实施方案中，阴离子聚电解质被直接吸附至基底，例如， PAA可以被直接吸附至多孔膜载体。在一些实施方案中，阴离子聚电解质被间接吸附至基 底，例如，借助于粘附层，例如PAA可以被吸附至粘附层，所述粘附层被吸附至多孔膜载体。 附接至基底以促进聚阴离子或聚阳离子的随后附接的任何适宜试剂都可以用作粘附层。在 一些情况下，得以用于粘附层中的试剂可以是与多孔膜载体形成多重疏水性相互作用的那 些试剂。粘附层试剂可以广泛变化，但在一些情况下可以包括聚(苯乙烯磺酸酯）（PSS)。
[0062] 在某些实施方案中，聚(酸)膜的逐层配置可以包括使含有一种或多种粘附层试剂 (例如PSS)的粘附层首先层叠在多孔载体上的那些聚(酸)膜。在某些实施方案中，聚(酸)膜 的逐层配置可以包括例如在不使用粘附层的情况下使一种或多种阴离子聚电解质（例如 PAA)首先层叠在多孔载体上的那些聚（酸)膜。在某些实施方案中，在一种或多种阴离子聚 电解质形成层之后，使一种或多种阳离子聚电解质，例如质子化聚(烯丙胺）（PAH)、聚乙烯 亚胺(PEI)等，层叠在阴离子聚电解质上。在某些实施方案中，在使用或不使用粘附层的情 况下使两种以上聚电解质的组合层叠在多孔载体上，例如，PAH与PAA的组合或PEI与PAA的 组合。相应地，聚(酸)膜可以是简单的或可以是复杂的。简单的聚(酸)膜将变化但可以包括 有包括较小数目的聚电解质层，例如单个层、两个层或三个层的那些聚(酸)膜。复杂聚(酸） 膜将变化但可以包括有包括多于较小数目的聚电解质层，例如3个或更多个层，例如4个或 更多个层、5个或更多个层、6个或更多个层、7个或更多个层、10个或更多个层、15个或更多 个层、或者20个或更多个层的那些聚（酸)膜。可以在所获得的聚（酸)膜中构建任何所期望 的数目或组合的层。
[0063] 聚(酸）聚合物刷可以包括通过任何适宜的方法合成的那些聚(酸)聚合物刷。举例 来说，可用于合成聚(酸)聚合物刷的方法包括但不限于:等离子聚合、热辅助或UV辅助接枝 聚合、硝基氧化物介导的聚合、可逆加成-断裂链转移聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)、表 面引发的ATRP等等。可以利用任何特定方法，或可以组合或交换方法的一部分，以便实现所 期望的反应特征。此类所期望的反应特征可以变化。举例来说，在一些实施方案中，所期望 的反应特征包括但不限于在水溶液中聚合(例如，在不是有机溶剂的溶液中聚合）、使溶液 中聚合减至最少（即，相对于非基底结合的聚合物，高度偏好基底结合的聚合物的聚合）、受 控聚合物生长速率、有效聚合物生长和低多分散性(即，小范围的聚合物大小）。
[0064]在某些实施方案中，聚（酸）聚合物刷可以是通过表面引发的ATRP合成的那些，其 中通过引发剂附接至基底来引发ATRP。在某些实施方案中，引发剂所附接的基底可以是多 孔膜载体。在其他实施方案中，引发剂所附接的基底可以是在中间基底附接至多孔膜载体 之前、期间或之后在上面引发ATRP的中间基底。举例来说，在某些实施方案中，在中间基底 被附接至多孔载体之后将引发剂附接至中间基底，例如，聚合物底层涂料。
[0065]可用于介导ATRP引发剂与多孔载体的附接的中间基底可以广泛变化。此类中间基 底是同时附接至主要基底(例如多孔载体)和聚合物组分(例如引发剂或单体)的那些基底。 在一些情况下，中间基底可以是聚合物。在某些情况下，粘附层试剂可以用作中间基底，例 如，PSS可以用作中间基底。
[0066]引发剂可以变化，并且可以是能够引发聚合，例如自由基聚合，例如ATRP的任何适 宜引发剂。感兴趣的聚合引发剂包括但不限于可得自市面供应商，例如Sigma-Aldrich (St.Louis，MO)的那些。自由基聚合引发剂包括但不限于以下文献中所公开的那些自由基 聚合引发剂：Denisov等（2005)Free Radical Initiators.John Wiley&Sons:New Jersey， 其公开内容以引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，自由基聚合引发剂还可以包括 硅烷引发剂，例如二氯硅烷。
[0067] 可以用于构建聚（酸)组件的ATRP引发剂的实例包括但不限于:双[2_(2'_溴异丁 酰氧基）乙基]二硫化物、双[2-(2-溴异丁酰氧基)十一基]二硫化物、2-溴异丁酸酐、α-溴异 丁酰溴、丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基）乙酯、甲基丙烯酸2-(2-溴异丁酰氧基）乙酯、叔丁基α-溴异丁酸酯、2-溴异丁酸3-丁炔酯、二季戊四醇六（2-溴异丁酸酯）、2_溴异丁酸十二酯、α-溴异丁酸乙酯、双(2-溴异丁酸酯）乙二酯、2-溴异丁酸2-羟基乙酯、2-溴异丁酸1-(DL-1，2-亚异丙基甘油基)酯、溴异丁酸甲酯、2-溴异丁酸十八酯、季戊四醇四（2-溴异丁酸酯）、2_ 溴异丁酸1-(酞酰亚胺基甲基）酯、聚（乙二醇)双（2-溴异丁酸酯）、聚（乙二醇）甲醚2-溴异 丁酸酯、2-溴异丁酸炔丙酯、1，1，1_三(2-溴异丁酰氧基甲基）乙烷2-溴异丁酸10-十一烯基 酯等等。
[0068] 在某些实施方案中，引发剂进一步结合聚合物的一个或多个单元，例如，单元嵌 段、单体或大分子单体，以便形成大分子引发剂。构建大分子引发剂的方法可以变化，且在 一些情况下，聚合物可以用引发剂，例如ATRP引发剂聚合后修饰，或在其他情况下，聚合物 可以与引发剂，例如ATRP引发剂共聚。聚合物的任何适宜单元都可以用作引发剂的并入位 点以便形成大分子引发剂。合适的引发剂能够以所形成的聚合物的任何所期望的数值百分 比并入大分子引发剂中，其中较高引发剂并入百分比引起较高随后聚合速率，例如，较高聚 合物密度，且较低引发剂并入百分比引起较低随后聚合速率，例如较低聚合物密度。举例来 说，在一些情况下，引发剂，例如ATRP引发剂，能够以1%至50%间的任一值存在于大分子引 发剂中，例如，1 %至30%、10%至40%、10%至30%、1 %至20%、15%至25%或 10%至20%。
[0069] 在某些情况下，大分子引发剂可以包括与阳离子和阴离子聚合物，例如阳离子聚 电解质或阴离子聚电解质结合的引发剂。举例来说，大分子引发剂可以包括与阳离子聚合 物，例如甲基丙烯酸(2-二甲基氨基）乙酯(DMAEMA)结合的引发剂，例如丙烯酸2-(2-溴异丁 酰氧基）乙酯(BIEA)。在一些情况下，大分子引发剂进行进一步修饰以改良反应性，例如大 分子引发剂可以进行进一步修饰，例如用烷基化剂进行烷基化，例如用甲基化剂进行甲基 化，以便形成修饰大分子引发剂，例如聚(DMAEMA-共-BIEA)可以用碘甲烷进行烷基化以生 成修饰大分子引发剂聚甲基丙烯酸（2-三甲基碘化铵）乙酯-共-BIEA)(TMAEMA-共-BIEA)。 在一些情况下，聚(酸)组件的大分子引发剂或修饰大分子引发剂被直接附接至多孔载体。 在其他情况下，大分子引发剂或修饰大分子引发剂是通过使用插入层或基底，例如粘附层 或中间基底而被附接至多孔载体。
[0070] 得以用于本发明的实施方案中的聚（酸)层和刷包括但不限于以下文献中所描述 的那些：Jain 等，"Prote in Purification with Polymeric Affinity Membranes Containing Functionalized Poly(acid)Brushes"，Biomacromolecules(2010年4月12 日）：11:1019_1026;Anuraj等，"An All Aqueous Route to Polymer Brush-Modified Membranes with Remarkable Permeabilities and Protein Capture Rates"， J·Memb·Sci·(2012年2月1日）389:117-125;Bhattacharjee等，"Formation of High-Capacity Protein-Adsorbing Membranes Through Simple Adsorption of Poly (acrylic acid)-Containing Films at Low pH"，Langmuir(2012年5月1日）：28:6885-6892;Jain等，"Completely Aqueous Procedure for the Growth of Polymer Brushes on Polymeric Substrates"，Langmuir(2007)23:11360-11365;所述文献的公开内容以引 用的方式并入本文中。还感兴趣的是美国公开申请第20130244338号中所公开的聚(酸)膜； 其公开内容以引用的方式并入本文中。
[0071] 除聚（酸)组件以外，所述基质进一步包括多孔膜载体。所述膜的孔隙度可以视需 要而变化。举例来说，在需要高流速通过所述膜的实施方案中，可以使用具有高孔隙度的 膜，或在需要膜刚性的实施方案中，可以使用具有低孔隙度的膜。所述膜的孔隙的平均孔隙 大小也可以视需要而变化，并且其直径可以在0 · 2至20μπι范围内，包括例如0 · 2至0 · 4μπι、0 · 2 至0 · 5ym、0 · 3至0 · 5ym、0 · 3至0 · 6ym、0 · 2至 1μηι、0 · 5至 1μηι、0 · 7至 1 · 5ym、0 · 9至 1 · 3ym、1 至 10μ m、1至5μηι、1至3μηι、1至2μηι、2至5μηι、2至4μηι、3至5μηι或4至5μηι。在一些情况下，可以基于粘附 至膜的聚(酸)组件的大小来选择膜的平均孔隙大小。举例来说，在粘附较小聚(酸)组件，例 如小聚（酸)膜的情况下，可以使用具有较小平均孔隙大小，例如直径为1至2μπι，包括例如 1.2μπι的膜。在粘附较大聚（酸)组件，例如大聚(酸)刷的其他情况下，可以使用具有较大平 均孔隙大小，例如直径为3至6μπι，包括例如5μπι的膜。使用大聚(酸)组件可能需要或可能不 需要使用具有大平均孔隙大小的薄膜。举例来说，在一些情况下，大聚(酸)组件可以连同具 有小平均孔隙大小的膜一起使用。同样，在一些情况下，小聚(酸)组件可以连同具有大平均 孔隙大小的膜一起使用。
[0072] 平均孔隙大小是指膜孔隙大小的算术平均值。孔隙大小的任何适宜标准量度，例 如孔隙直径或孔隙体积，都可以用于计算平均孔隙大小。在一些情况下，平均孔隙大小还可 以通过直接测量代表性样品的大小或代表性孔隙数目来测定，且不必测量膜的每个孔隙来 测定膜的平均孔隙大小。在一些情况下，平均孔隙大小可以通过测量主题膜的功能特征和 基于在具有已知平均孔隙大小的参考膜中测量的相同功能特征的测量值来估计孔隙大小 而间接地测定。这些间接方法还必须考虑且在一些情况下测量孔隙分布或孔径密度，以便 准确地测定平均孔隙大小。孔隙大小和孔隙分布可以通过任何适宜的方法来测量，包括但 不限于:始沸点法、水银孔隙度法、热孔隙度法、渗透孔隙度法、吸附法、基于液体或气体输 送的方法、显微镜法(例如光显微术、扫描电子显微术、透射电子显微术、原子力显微术等）。 此类方法包括但不限于以下文献中所描述和回顾的那些：Khulbe等，（2008)Synthe tic polymeric membranes:characterization by atomic force microsco py.Berlin: Springer，其公开内容以引用的方式并入本文中。
[0073] 多孔膜载体可以由多种材料制成，包括但不限于:聚合物材料，例如尼龙、塑料等。 在某些实施方案中，可以使用聚酰胺作为多孔膜载体。可用作本公开的膜的聚酰胺可以变 化并且可以是天然存在的或合成的。在某些实施方案中，聚酰胺膜是尼龙膜。尼龙膜可以是 羟基化的或未羟基化的。在某些情况下，未羟基化膜(例如，未羟基化尼龙膜）的表面基团 (例如，表面酰胺基)可以通过转化至活性表面基团以形成羟基官能化膜，例如未羟基化尼 龙膜上的表面酰胺基转化至N-羟甲基聚酰胺(尼龙-OH)表面基团而被激活。任何适宜的材 料都可以用于多孔膜载体中，包括诸如以下非限制性实例:含砜聚合物，例如，聚砜、聚醚砜 等等;含氟聚合物，例如，聚偏二氟乙烯等等;纤维素聚合物;等等。如本文中所描述，多孔膜 载体的材料不局限于在有机溶剂中稳定的那些材料，例如正常情况下在有机溶剂中溶解或 离解的材料也可以通过使用水性组合件而用于多孔膜载体中。
[0074] 在需要时，所述聚（酸)基质可以进一步包括亲和性元件。亲和性元件是对一个类 别的分子或特定的分子显示结合亲和力的元件或组件。亲和性元件可以在一些情况下定义 为非特异性亲和性元件，例如结合一个类别的分子的那些亲和性元件，或在一些情况下可 以定义为特异性亲和性元件，例如结合特定的分子的那些亲和性元件。
[0075] 在一些情况下，亲和性元件是非特异性亲和性元件，诸如与例如结合给定样品中 的任何合适的标记的蛋白质的金属离子络合的金属离子螯合配体。与金属离子络合的金属 离子螯合配体可以随配体和金属离子而变化。感兴趣的配体的实例包括但不限于：亚氨基 二乙酸（IDA)、次氮基乙酸(NTA)、羧甲基化天冬氨酸(CM-Asp)、三(2-氨基乙基)胺(TREN)和 三羧甲基乙二胺(TED)。这些配体提供了最多具有相应金属离子的三齿络合物（IDA)、四齿 络合物(NTA、CM-Asp)和五齿络合物(TED)。多种不同类型的金属离子可以与主题化合物的 配体络合。感兴趣的金属离子可以基于其对亲核试剂的优先反应性而分成不同的类别（例 如，硬、中间和软）。感兴趣的硬金属离子包括但不限于:Fe 3+、Ca2+和Al3+等等。感兴趣的软金 属离子包括但不限于:Cu +、Hg2+、Ag+等等。感兴趣的中间金属离子包括但不限于:Cu2+、Ni 2+、 Zn2+、C〇2+等等。在某些实施方案中，配体所螯合的金属离子是Co 2+。在某些实施方案中，配体 所螯合的感兴趣的的金属离子是Fe3+。感兴趣的其他金属离子包括但不限于镧系元素，诸如 Eu3+、La3+、Tb3+、Yb3+等等。
[0076] 在某些实施方案中，亲和性元件包括天冬氨酸基团，且称为基于天冬氨酸的金属 离子亲和性元件，其中此类组合物包括由天冬氨酸，例如L-天冬氨酸合成的结构。基于天冬 氨酸的金属离子亲和性元件包括基于天冬氨酸的配体/金属离子络合物，例如基于天冬氨 酸的四齿配体/金属离子络合物，其中所述金属离子络合物对蛋白质，例如金属离子亲和性 肽所靶向的蛋白质具有亲和性。在一些情况下，本公开的基于天冬氨酸的组合物包括具有 四个能够与金属离子相互作用，即螯合的配体，使得金属离子取决于配体的环境条件而稳 定但可逆地与所述配体缔合的结构。
[0077] 在某些实施方案中，非特异性亲和性元件包括直接结合蛋白质标记(例如表位标 记)或基底标记(例如化学标记）的标记结合亲和性元件。标记结合亲和性元件可以随标记 而变化。
[0078] 举例来说，在一些情况下，标记可以是多肽表位标记，例如FLAG表位，且标记结合 亲和性元件可以是直接结合多肽表位标记的多肽，例如抗体，例如抗FLAG抗体。结合多肽表 位标记的抗体包括但不限于:抗FLAG抗体、抗Hi s表位标记抗体、抗HA标记抗体、抗My c表位 标记抗体、抗GST标记抗体、抗GFP标记抗体、抗V5表位标记抗体、抗6xHi s标记抗体、抗6xHN 标记抗体等等。此类抗体可得自市面供应商，例如Clontech(Mountain View，CA)、Thermo Scientific( Rockford，IL)等等。
[0079] 在其他情况下，所述标记可以是直接与结合伴侣结合的化学基底。化学基底可以 是具有一个或多个结合伴侣的任何适宜的化学基底。举例来说，化学基底可以是生物素且 因此标记结合亲和性元件可以是生物素的任何结合伴侣，例如亲和素、链霉亲和素、抗生物 素抗体等等。结合化学基底的标记结合亲和性元件的其他实例包括但不限于抗辣根过氧化 物酶抗体、抗地高辛抗体、抗碱性磷酸酶抗体、抗异硫氰酸荧光素抗体、抗四甲基罗丹明抗 体等等。此类标记结合亲和性元件可得自市面供应商，例如，Thermo Scientif ic (Rockford，IL)、LifeTechnologies(Carlsbad，CA)、Sigma-Aldrich(St ·Louis，MO)等等。
[0080] 在一些情况下，亲和性元件是特异性亲和性元件。特异性亲和性元件是对感兴趣 的分析物具有特定亲和性的那些元件。特异性亲和性元件可以变化，其中此类元件的实例 包括但不限于:抗体，例如单克隆或多克隆抗体，或其结合片段。特异性亲和性元件明确排 除可结合常用标记，例如蛋白质表位标记的那些亲和性元件，且因此与如本文中所描述的 非特异性亲和性元件不同。开发和使用特异性亲和性元件的方法描述于例如以下文献中： Harlow&Lane(1999)Using Antibodies:A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press : Cold Spring Harbor，NY;和Shepherd&Dean(2000)Monoclonal antibodies-practical approach.Oxford University Press:0xford，UK，其公开内容以引用的方式并 入本文中。
[0081] 柱的聚(酸)基质可以由单个膜或者两个或更多个不同的膜组成，例如堆叠在彼此 顶部，诸如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个膜，视需要而定。在某些实施方案 中，堆叠膜可以通过间隔物而隔开。膜间隔物的配置可以广泛变化，且包括但不限于：空心 间隔物、固体间隔物、多孔间隔物、液体间隔物、凝胶间隔物、纤维间隔物、聚合物间隔物等 等。聚(酸)基质的尺寸可以变化，其中所述基质可以经配置以占据旋转柱体积的一部分，且 这样的部分可以变化，介于0.1 %至100%范围内，包括例如0.1 %至0.5%、0.1 %至0.3%、 0.2%至0.3%、0.1%至1%、0.1%至10%、1%至10%、1%至50%、5%至100%、10%至 100%、25%至100%、50%至100%、75%至100%，且包括旋转柱的总体积。在聚(酸)基质仅 占据旋转柱体积的一部分的情况下，其可能位于任何所期望的位置上，诸如在中间或一端， 诸如样品出口所位于的第二端近端的位置。
[0082] 除聚（酸)基质以外，旋转柱包括细长空心结构，其具有第一端处的样品入口和第 二端处的样品出口。所述结构可以具有任何所期望的配置，其中在一些情况下，所述结构配 置为管。所述结构的体积可以变化，其中在一些情况下，细长结构具有?μL或更大的体积，诸 如5μ或更大，包括10、25、50或75μ1或更大，其中在一些情况下，所述体积是lml或更大，诸如 5ml或更大，包括10、25、50、100、250、500、7501111或更大，至多11或更大，其中在一些情况下 所述体积在?μL至11的范围内。
[0083]如以上所提到，细长结构包括第一端处的样品入口和第二端处的样品出口。入口 和出口各自的尺寸可以相同或不同，其中在一些情况下，入口的最长尺寸（例如直径）比出 口的长，例如，长出 5%、10%、15%、20%、25%、50%、75% 或 100% 或更多。
[0084]所述细长结构可以由任何适宜的材料制造，包括但不限于聚合物材料，例如塑料， 其中所述材料可以是不透明的或透明的，视需要而定。可用于制造细长结构的材料包括但 不限于常用于研究和工业设定中的那些聚合物材料，例如塑料、树脂等，包括但不限于:缩 醛、环状烯烃共聚物、乙烯丙烯二烯单体橡胶、乙烯丙烯橡胶、乙烯-氯三氟乙烯共聚物 (THalar?)、乙稀-四氟乙稀(Tefzel)、氟化乙稀丙稀(Teflon?)、氟化聚乙稀、高抗冲聚苯乙 稀、高密度聚乙稀、低密度聚乙稀、改性聚亚苯醚、Permanox、聚碳酸酯、聚醚酰亚胺、聚对苯 二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚物、聚氟烷氧基(Teflon? )、聚甲基丙烯酸甲 酯（丙烯酸系）、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚丙烯共聚物、聚苯乙烯、聚砜、聚偏二氟乙烯、 Re sMer?、苯乙稀丙稀腈、四氟乙稀、四氟乙稀(? eflon?)、Thermanox、热塑性弹性体、热塑 性聚酯聚氨酯、Tritan?等等。
[0085] 细长结构的尺寸可以广泛变化并且可以基于多种因素加以选择。举例来说，在某 些实施方案中，所述细长结构的尺寸可以基于随后附加在细长结构内的聚(酸)基质的最大 结合容量加以选择。在一些情况下，细长结构的尺寸为负载某一体积的样品作准备，使得样 品中的革巴蛋白的可能量几乎等于聚(酸)基质的最大结合容量，例如在98%内、在95%内、在 90%内。在某些情况下，细长结构的尺寸为负载某一体积的样品作准备，使得样品中的靶蛋 白的可能量超过聚(酸)基质的最大结合容量，例如多出1.5倍、多出2倍、多出3倍、多出5倍、 多出10倍。在又其他实施方案下，细长结构的尺寸为负载某一体积的样品作准备，使得样品 中的靶蛋白的可能量小于聚(酸)基质的最大结合容量，例如少1.5倍、少2倍、少3倍、少5倍、 少10倍。
[0086] 细长结构的尺寸可以根据蛋白质产生的所期望的应用规模而加以缩放。举例来 说，细长结构的尺寸可以缩放，从而使其足以封闭足量的空间以便施加含有研究规模蛋白 质量的样品，和足量聚（酸）基质以便分离研究规模蛋白质量，例如纳克量，例如〇.5ng至 500ng〇
[0087] 在某些实施方案中，细长结构的尺寸可以缩放，从而使其足以封闭足量的空间以 便施加含有筛选规模蛋白质量的样品，和足量聚（酸)基质以便分离筛选规模蛋白质量，例 如微克量，例如〇. 5yg至500yg。
[0088] 在某些实施方案中，细长结构的尺寸可以缩放，从而使其足以封闭足量的空间以 便施加含有批量规模蛋白质量的样品，和足量聚（酸)基质以便分离批量规模蛋白质量，例 如毫克量，例如〇. 5mg至1 OOmg，包括例如lmg至50mg。
[0089] 在某些实施方案中，细长结构的尺寸可以缩放，从而使其足以封闭足量的空间以 便施加含有试验规模蛋白质量的样品，和足量聚（酸)基质以便分离试验规模蛋白质量，例 如毫克至克量，例如l〇〇mg至10g，包括例如500mg至5g和lg至10g。
[0090] 在某些实施方案中，细长结构的尺寸可以缩放，从而使其足以封闭足量的空间以 便施加含有工艺规模蛋白质量的样品，和足量聚（酸)基质以便分离工艺规模蛋白质量，例 如克至千克量，例如l〇g至lkg，包括例如50g至500g、100g至500g和500g至lkg。
[0091] 足以封闭足量空间以便施加样品和足量聚（酸)基质以便从样品中分离蛋白质的 细长结构的实际长度和直径尺寸可以大幅变化，例如从毫米直至米，从而考虑了可以使用 本公开的旋转柱分离的蛋白质量的广泛范围。举例来说，适用于研究规模、筛选规模、批量 规模、试验规模和工艺规模应用的细长结构的长度可以且在一些情况下介于5至500mm的范 围内，例如臟至40mm、40mm至80mm、80mm至110mm、90mm至200mm和200mm至lm，且直径分别可 以介于3謹至15謹、ICtam至2Ctam、1?5謹至3Ctam、3Ctam至lOCtam和9Ctam至 5〇Ctam的范围内。
[0092] 如本文中其他部分所公开，在某些情况下，从中分离或纯化蛋白质的样品可以是 预先浓缩的，例如，在将样品负载至本公开的装置中之前，可以从样品中去除水、培养基、缓 冲液或其他样品组分，由此增加靶蛋白质的相对浓度。在某些情况下，这种浓缩允许将大量 蛋白质，例如，批量规模量、试验规模量、工艺规模量等负载至所描述尺寸的细长结构中。在 又其他实施方案中，样品多次施用至所描述尺寸的细长结构中可以用于通过大量蛋白质， 例如批量规模量、试验规模量、工艺规模量等，与能够结合这种大量的聚(酸)基质结合来分 离或纯化大量蛋白质。
[0093] 本公开的细长结构的实际配置和尺寸可以广泛变化，并且在一些情况下可以包括 经配置以便与常规实验室或工业离心机相容，例如经配置以络合常规实验室或工业离心机 的常规转子的基本上呈圆柱形的管子。此类转子可以是例如可得自市面供应商的那些，诸 如Beckman Coulter(Indianapolis，IN)、Eppendorf(Hamburg，Germany)、Thermo Scientific (Rockford，IL)等等。举例来说，此类转子可以是以下文献中所描述的那些或类 似于以下文献中所描述的那些：可得自Thermo Fisher Scientific(Rockford，IL)的 Thermo Scientific Rotor Guide (2011)、可得自 Beckman Coulter (Indianapolis, IN) |3tl High-Performance and High-Capacity Centrifuges(2008)目录和可得自Eppendorf (Hamburg，Germany)的2014/15Eppendorf Products Catalog:Liquid Handling,Sample Handling,and Cell Handling，其公开内容全部以引用的方式并入本文中。
[0094] 在某些实施方案中，细长结构可以经配置以便与本领域中称为微型离心机的离心 机中用于离心小体积，例如2mL或更小的常规转子相容。举例来说，在一些情况下，细长结构 可以经配置以便与经配置用于1 · 5mL或2 · OmL管，例如40mm长或更短且直径为11mm或更小的 常规转子相容。在其他实施方案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于〇. 5mL管，例如 30mm或更短且直径为8mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。
[0095] 在某些实施方案中，细长结构可以经配置以便与本领域中称为通用或多用途离心 机的离心机中用于离心中等体积，例如2mL至50mL的常规转子相容。在一些实施方案中，细 长结构可以经配置以便与经配置用于5mL管，例如75mm长或更短且直径为12mm或更小的常 规转子或常规转子接头相容。在一些实施方案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于 13mL或14mL管，例如100mm长或更短且直径为18mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。 在一些实施方案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于15mL管，例如120_长或更短且 直径为17mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。在一些实施方案中，细长结构可以经 配置以便与经配置用于50mL管，例如115mm长或更短且直径为30mm或更小的常规转子或常 规转子接头相谷。
[0096] 在某些实施方案中，细长结构可以经配置以便与本领域中称为大容量离心机的离 心机中离心大体积，例如大于50mL的常规转子相容。通用或多用途离心机还可以经配置以 离心大体积。在一些实施方案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于85或100mL瓶子， 例如121mm长或更短且直径为38mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。在一些实施方 案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于225mL或250mL瓶子，例如137mm长或更短且直 径为62mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。在一些实施方案中，细长结构可以经配 置以便与经配置用于400或500mL瓶子，例如136mm长或更短且直径为98mm或更小的常规转 子或常规转子接头相容。在一些实施方案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于750mL 瓶子，例如150mm长或更短且直径为104mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。在一些 实施方案中，细长结构可以经配置以便与经配置用于1L瓶子，例如189_长或更短且直径为 98mm或更小的常规转子或常规转子接头相容。在一些实施方案中，细长结构可以经配置以 便与经配置用于2L瓶子的常规转子或常规转子接头相容。
[0097] 在某些实施方案中，细长结构被配置为经配置以放在收集管内的基本上呈圆柱形 的管子。收集管可以变化且可以经过特别设计以便与细长结构相容，或可以是与所述细长 结构相容的任何常规实验室管子。举例来说，常规实验室管子，例如经配置以便与常规实验 室或工业离心机相容的实验室管子，包括但不限于0.5mL微量离心管、1.5mL微量离心管、 2. OmL微量离心管、5mL离心管、13mL离心管、15mL离心管、50mL离心管。此类常规实验室或工 业离心管包括市售的那些，例如得自Eppendorf (Hamburg，Germany)、BD Bio sciences (San Jose，CA)、Thermo Fisher Scientific (Rockford，IL)等等。举例来说，在一些情况下，细长 结构可以经配置以便与2.OmL收集管相容，例如直径为9.8_或更小、长度为39_或更短(例 如长度为5mm至33mm)且有或无直径为9.9mm或更大的上唇板。在一些情况下，细长结构可以 经配置以便与1.5mL收集管相容，例如直径为9.8mm或更小、长度为38mm或更短(例如长度为 5mm至20mm)且有或无直径为9.9mm或更大的上唇板。在一些情况下，细长结构可以经配置以 便与0.5mL收集管相容，例如直径为6.7mm或更小、长度为29mm或更短（例如长度为5mm至 17mm)且有或无直径为6.7mm或更大的上唇板。在一些情况下，细长结构可以经配置以便与 5mL收集管相容，例如直径为17mm或更小、长度为65mm或更短且有或无直径为17mm或更大的 上唇板。在一些情况下，细长结构可以经配置以便与15mL收集管相容，例如直径为17_或更 小、长度为125mm或更短且有或无直径为17mm或更大的上唇板。在一些情况下，细长结构可 以经配置以便与50mL收集管相容，例如直径为31mm或更小、长度为121mm或更短且有或无直 径为31mm或更大的上唇板。
[0098] 在某些实施方案中，细长结构被配置为经配置以放在收集瓶内的基本上呈圆柱形 的管子。收集瓶可以变化且可以经过特别设计以便与细长结构相容，或可以是与所述细长 结构相容的任何常规实验室瓶子。举例来说，常规实验室瓶子，例如经配置以便与常规实验 室或工业离心机相容的实验室瓶子包括但不限于100mL瓶子、175-225mL锥形瓶、250mL平底 瓶、400mL瓶子、500mL瓶子、750mL瓶子、1L瓶子、1.5L瓶子、2L瓶子等等。此类常规实验室或 工业离心瓶包括但不限于市售的那些，例如得自Eppendorf (Hamburg，Germany)、BD Biosciences(San Jose，CA)、Thermo Fisher Scientific(Rockford，IL)等等。
[0099] 在某些实施方案中，细长结构被配置为经配置以放在多孔板的孔内的基本上呈圆 柱形的管子。在一些实施方案中，多孔板可以经配置以接受经配置以放入上述管子，例如 0.5mL收集管、1.5mL收集管或2mL收集管之一中的细长结构。在其他实施方案中，细长结构 经特别配置以放在特定多孔板的孔内。多孔板可以变化且可以经过特别设计以便与细长结 构相容，或可以是与所述细长结构相容的任何常规实验室多孔板。举例来说，常规实验室多 孔板，例如经配置以便与常规实验室或工业离心机或离心机转子或离心机转子插头相容的 实验室多孔板，包括但不限于96孔板、384孔板、1536孔板等等。此类常规实验室或工业多孔 板包括市售的那些，例如得自 Sigma-Al dr i ch (St. Louis，M0)、Eppendorf (Hamburg， Germany)、BD Biosciences(San Jose，CA)、Thermo Fisher Scientific(Rockford,IL)^ 等。在一些实施方案中，可以提供补充附接，例如夹持器、夹具、偶联器等以维持细长结构与 特定多孔板的充分缔合。
[0100] 在某些实施方案中，细长结构可以例如为或被配置为市售的管子或旋转柱。此类 市售的管子和旋转柱包括可得自 Thermo Scientific (Rockford，IL)、Sigma-Al dr ich (St·Louis，M0)、G_Biosciences(St·Louis，M0)、Pall Life Sciences(Ann Arbor，MI)、GE Healthcare Life Sciences(Pittsburgh，PA)等等的那些。
[0101 ] 举例来说，市售的管子和旋转柱包括但不限于可得自Thermo Scientific (Rockford，IL)的那些，例如，具有扣盖的那些(例如，具有以下尺寸:9mm直径和20mm高度与 直径大于9mm的唇板;9mm直径和24mm高度与直径大于9mm的唇板;9mm直径和30mm高度与直 径大于9mm的唇板等等）、具有旋盖的那些(例如，具有以下尺寸:8mm直径和32mm高度;4mm直 径和37mm高度等等）、具有旋盖和拧开底部的那些(例如，具有以下尺寸:9mm直径和39mm高 度;9mm直径和100mm高度;12mm直径和105mm高度、17mm直径和112mm高度等等）。
[0102] 在某些实施方案中，细长结构还可以经配置以用于附接延伸器，此类延伸器允许 向装置施加额外样品体积，否则将会超过细长结构的最大体积。此类延伸器可以通过任何 适宜的手段，例如通过摩擦力、通过张力或通过粘附剂等被适当地固定至细长结构的第一 样品入口处。细长结构与延伸器之间的连接可能是或可能不是气密性的。举例来说，在延伸 器经配置以允许样品重力流动至细长结构中的情况下，可以使用非气密性连接。在延伸器 经配置以允许样品压力流动，例如真空压力流动或正压力流动至细长结构中的情况下，可 能需要气密性连接。在一些情况下，延伸器还可以充当前置过滤器。举例来说，延伸器可以 含有任何适宜过滤材料的过滤器，例如纸过滤器、玻璃纤维过滤器、塑料过滤器、凝胶过滤 器等，其可以保留样品的一些组分以便防止所述组分进入细长结构。在某些实施方案中，可 以通过位于延伸器与细长结构之间的流量控制装置，例如阀门或旋塞阀来控制被动或主动 流动。
[0103] 在一些情况下，聚（酸)基质可以通过载体构件负载在细长结构中。载体构件可以 在结构上大幅变化，例如插脚、横杆等，其中在一些情况下，所述载体构件被结构化为玻璃 料。载体构件可能容易或可能不容易从细长结构中去除。任何合适的载体材料都可以用作 载体构件。合适的载体构件的实例包括但不限于塑料、聚乙烯、聚丙烯、滤纸、玻璃纤维纸、 石英纤维纸、矿物纸、纤维玻璃、织物、纤维素滤纸等等。载体构件可以通过任何适宜的方法 适当地固定聚（酸）基质。举例来说，载体构件可以通过摩擦力或通过张力适当地附加聚 (酸）基质。此类载体构件和使用此类载体构件的方法包括但不限于德国专利公布第 DE4321904B4号中所描述的那些，其公开内容全部以引用的方式并入本文中。
[0104] 细长结构可以具有位于第一和/或第二端上的盖帽或其他密封元件。所述盖帽可 以被配置为扣盖、旋盖或任何其他适宜的配置。具有此类盖帽和密封元件的细长结构的实 例包括但不限于细长结构的配置和尺寸的描述中所提供的那些。
[0105] 在一些情况下，细长结构例如旋转柱存在于收集容器中，例如，呈嵌套关系。所述 收集容器可以是独特结构，例如收集管，或者多孔板的孔或类似结构。经配置以接受细长结 构的收集管的实例包括但不限于细长结构的配置和尺寸的描述中所提供的那些。
[0106] 图1和图2提供了具有收集管和多孔板的多种旋转柱配置的视图。图1提供了不同 大小的示例性旋转柱配置的图像，所述图像是并列拍摄以用于比较。拍摄了图1的旋转柱， 其中相应的收集管介于2mL至50mL体积的范围内且呈扣盖和旋盖配置。还与图1的扣盖旋转 柱一起拍摄是配置为玻璃料的载体构件的实例。图2A提供了含有呈多路配置阵列化例如以 便与多孔板(202)相容的聚（酸)膜(201)的示例性旋转柱(200)的视图。图2B描绘了含有聚 (酸)膜(201)的无盖(左)和有盖(右)个别旋转柱的视图。例如，如图2B中所描绘的旋转柱可 以配置有螺纹(204)以便与旋盖(203)相容。
[0107]使用方法
[0108]本发明的方面进一步包括使用本发明的旋转柱处理液体样品的方法，例如，如本 文中所描述。所述方法的方面包括通过柱的样品入口将样品引入具有聚(酸)基质的旋转柱 中，例如，如上所述;和使所述样品移动通过聚（酸)膜以处理所述样品。可以使用任何适宜 的方案，例如通过移液管将样品引入柱中。样品移动通过柱从入口至出口可以使用任何适 宜的方案来实现，例如通过使柱旋转，诸如在离心机中，或通过向柱的样品出口施加负压， 例如通过向样品出口施加真空，或通过向样品入口施加正压，例如通过向样品入口施加压 缩空气、气体或液体。
[0109] 所述方法可以是从样品中分离一种或多种类型的分子，例如蛋白质、核酸等的方 法，或从样品中分离一种或多种特定分析物的方法。因而，在一些情况下，所述聚（酸)膜经 配置以结合样品中的蛋白质且所述方法是从所述样品中分离蛋白质的方法。在一些情况 下，所述聚（酸）膜经配置以结合样品中的核酸且所述方法是从所述样品中分离核酸的方 法。在一些情况下，所述聚（酸)膜经配置以特异性结合样品中的感兴趣的分析物且所述方 法是从所述样品中分离所述分析物的方法。感兴趣的分析物可以变化，例如蛋白质、核酸和 小分子等。
[0110] 在某些情况下，所述方法可以进一步包括在使用前对聚（酸）膜进行填充或再填 充。如本文中所描述，对聚（酸)膜进行填充描述了使聚（酸)膜与可以跟螯合配体络合以形 成金属离子亲和性络合物的金属离子接触。含有用于对聚(酸)膜进行填充的所期望的金属 离子的任何适宜的介质都可以用于对聚（酸)膜进行填充或再填充。举例来说，在某些情况 下，将所期望的金属离子的盐，例如氯化物盐或硫酸盐，例如CuCl 2、NiCl2、CuS〇4或NiS〇4,溶 解于水或缓冲液中，以生成适用于对聚(酸)膜进行填充的介质。使聚(酸)膜与填充介质接 触的方法可以变化且在一些情况下可以包括孵育聚(酸)膜与填充介质和/或使填充介质流 过聚(酸)膜，例如，通过重力、通过真空压力、通过正压力或使柱旋转，例如在离心机中。在 某些情况下，旋转柱中所存在的聚(酸)膜可能先前已经用特定金属离子填充，即，预填充， 且随后在使用前以即用形式存储。
[0111] 在一些情况下，所述方法可以进一步包括在使用前使聚(酸)膜平衡。举例来说，可 以使填充的柱与一种或多种平衡缓冲液接触。本公开的平衡缓冲液可以变化并且是制备聚 (酸)膜以用于实现样品的施加和靶标与亲和性元件的最佳结合的那些缓冲液。举例来说， 在一些情况下，感兴趣的平衡缓冲液包括但不限于含有盐，例如钠盐，例如磷酸钠和/或氯 化钠的溶液，例如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。在一些情况下，可以使用常用缓冲液，例如， 包括但不限于:Tris-HCl、Tris-乙酸盐、HEPES、M0PS、乙酸钠等等。在一些情况下，螯合剂， 例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、柠檬酸盐等被从平衡缓冲液中排除或如 果存在则以低量存在，以便增加靶标与亲和性元件的结合。在某些情况下，洗脱剂，例如咪 唑，和/或螯合剂是以低浓度，即，以比所述试剂用于洗脱靶标时的浓度低的浓度包括在平 衡缓冲液中作为竞争性结合剂，以便增加聚（酸)膜的严格度和减少非所期望的分子，例如 污染物与亲和性剂的结合。
[0112] 在某些情况下，本公开的缓冲液可以包括用于改变特定靶标或靶标群组的特征的 某些附加试剂，以便有助于使用本文中所描述的旋转柱和方法纯化靶标。此类附加试剂可 以变化但将会是与如本文中所描述的旋转柱和聚（酸)膜相容或以与其相容的量存在，即， 在所述附加试剂所存在的量下不会致使所述组件不适用于其预定功能的那些。此类附加试 剂包括但不限于还原剂(例如二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、巯基乙醇、三[2-羧乙基]膦、谷 胱甘肽等）、变性剂(例如脲、胍-HC1等）、清洁剂(例如Triton、Tween、ΝΡ-40、胆酸盐、3-[ (3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯等）、醇(例如乙醇、甘油等)等等。
[0113]在一些情况下，所述方法可以进一步包括在结合缓冲液中溶解或稀释样品，随后 将所述样品施加至本公开的旋转柱。在一些情况下，结合缓冲液可以具有与平衡缓冲液相 同的组分，且在一些情况下可以具有与平衡缓冲液相同的组成。在一些情况下，结合缓冲液 可能因存在或不存在一种或多种组分而与平衡缓冲液不同。在一些情况下，结合缓冲液可 能在一种或多种组分的量方面与平衡缓冲液不同。举例来说，在一些情况下，结合缓冲液可 以包括比平衡缓冲液多或少的洗脱剂以便视需要调节结合严格度。在一些情况下，结合缓 冲液可以包括或多或少的洗脱缓冲液中所存在的特定附加试剂，以便增加或减少靶主题特 定特征，以便视需要调节结合严格度。
[0114]在一些情况下，所述方法可以进一步包括在有或无结合缓冲液的情况下孵育所述 样品，与聚(酸)膜接触以允许靶标结合亲和性剂。这种孵育可以在将样品施加至聚（酸)膜 之后通过任何适宜的手段来进行，例如通过将样品吸移至聚（酸）薄膜上且允许样品与聚 (酸)膜充分接触，例如通过重力对样品的作用或通过对样品进行旋转，例如在离心机中。这 种孵育可以在适宜的温度下进行以增加靶主题结合或减少非特异性结合，例如，在室温 (RT)下、在4°C下、在0与4°C之间、在4°C与10°C之间、在10°C与室温之间、在室温与37°C之 间、在37 °C与55 °C之间、在55 °C与95 °C之间或超过95 °C。
[0115] 在某些情况下，所述方法可以进一步包括用一种或多种合适的洗涤缓冲液进行一 次或多次洗涤。在一些情况下，洗涤缓冲液可以与结合缓冲液和/或平衡缓冲液相同。在某 些情况下，洗涤缓冲液将由于存在或不存在特定组分或由于特定组分的量而与结合缓冲液 或平衡缓冲液不同。在一些情况下，洗涤缓冲液可以仅在pH值方面与结合缓冲液或平衡缓 冲液不同。在使用多种洗涤缓冲液的某些情况下，多种洗涤缓冲液的不同之处可能在于存 在或不存在一种或多种组分，例如存在或不存在一种或多种上述附加试剂，例如清洁剂，或 在于一种或多种组分的量，例如洗涤缓冲液可以含有不同的量的洗脱剂。在某些情况下，多 种洗涤缓冲液可能仅在pH值方面不同。
[0116] 在一些情况下，所述方法进一步包括从聚(酸)膜释放结合的分子，例如，通过洗脱 等。可以利用任何适宜的方法从聚(酸)膜释放结合的分子，例如，通过使用含有洗脱剂的洗 脱缓冲液。本公开的洗脱缓冲液可以变化，且在一些情况下可能在仅一种组分，例如洗脱剂 组分的存在或不存在或量方面与洗涤缓冲液、结合缓冲液和/或平衡缓冲液不同。举例来 说，在一些情况下，洗脱缓冲液可能基本上与先前描述的缓冲液相同，但具有较高浓度的洗 脱剂，例如多出1.5至100倍的洗脱剂，例如多出1.5-2倍、多出2-5倍、多出2-10倍、多出5-10 倍、多出10-20倍、多出20-50倍、多出50-100倍。在其他情况下，洗脱缓冲液可能在多于一种 组分方面与先前描述的缓冲液不同，并且还包括较高浓度的洗脱剂，例如多出1.5至100倍 的洗脱剂，例如多出1.5-2倍、多出2-5倍、多出2-10倍、多出5-10倍、多出10-20倍、多出20-50倍、多出50-100倍。本公开的洗脱剂可以变化，但一般包括能够破坏靶标与亲和性元件之 间的结合的任何分子，包括但不限于与亲和性元件竞争性地结合的分子，即竞争剂(例如咪 唑、咪唑衍生物、组氨酸、甘氨酸等）、螯合剂(例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等)等等。在一些情 况下，洗脱剂，例如竞争剂，能够以在从聚(酸)膜中释放结合的分子，例如蛋白质方面有效 的浓度存在于洗脱缓冲液中。此类有效浓度可以变化，且在一些情况下包括介于ImM至10M 范围内的浓度，例如ImM至10mM、ImM至100mM、10mM至100mM、10mM至0 · 5M、100mM至0 · 5M、 200mM至0.5M、300mM至0.5M、400mM至0.5M、200mM至0.7M、0.5M至1M、1M至2M、2M至3M、1M至5M 和5M至10M。
[0117] 在一些情况下，释放结合的分子可以通过破环金属离子与螯合配体之间的键，即 金属离子剥离来实现。可以使用任何适宜的金属离子剥离方法，包括例如改变围绕聚（酸） 膜的溶液的pH值。降低pH值意指增加围绕聚（酸)膜的溶液的酸度，这可以通过以下方式来 实现:使新溶液流入聚(酸)膜中，例如具有低pH值的洗脱溶液;或通过直接降低目前围绕聚 (酸)膜的溶液的pH值，例如通过加入酸，例如浓酸。在一些情况下，金属离子剥离是通过将 围绕聚（酸)膜的溶液的pH值降至pH 2至pH 8内，包括例如pH 2.5至pH 7.5、pH 2至pH 6、pH 3至pH 8、pH 2至pH 4或pH 3至pH 5来实现。在一些情况下，在金属离子剥离后，可以通过任 何适宜的方法，例如通过脱盐(例如，通过跑过脱盐柱）、通过缓冲液交换、通过沉淀等来进 一步纯化洗脱的分子，例如，以去除金属离子。
[0118] 在一些情况下，所述方法进一步包括使分离的分子跑过相同聚(酸)膜以便进一步 纯化所分离的分子。举例来说，在某些情况下，分离的分子，例如蛋白质，可以再施加至聚 (酸）膜且与所述膜再结合并且从所述膜再洗脱。在某些情况下，当分离的分子再跑过聚 (酸)膜时使用不同的缓冲液，例如较高严格度缓冲液。在某些情况下，使用一个或多个不同 的柱，例如新的柱来进一步纯化分离的分子，其中不同的柱可以与初步纯化所述分离的分 子的柱属于相同的类型或不同的类型。
[0119] 在某些情况下，所述方法进一步包括分析所释放的分子或分析物。可用于分析所 释放的分子的分析和/或检测方法可以变化，且包括但不限于酶促测定法(例如，ELISA、抗 标记ELISA、抗His ELISA等）、凝胶测定法(例如免疫印迹法、斑点印迹测定法、基于抗体(例 如抗His抗体）的测定法等）、结合信号扩增的测定法、结合荧光检测和/或定量的测定法等 等。在某些情况下，可以使用凝胶测定法，例如SDS-PAGE凝胶，通过以任何适宜的方法，包括 但不限于考马斯染色、银染色、深紫染色、荧光染色等等对凝胶进行染色来分析所释放的分 子。在一些情况下，对所释放的分子的分析可以通过功能测定法，即，测试所分离的分子的 一些功能性质以便检测其存在、测量其量或评估其纯度的测定法来进行。可用于分析根据 本公开分离的分子，例如蛋白质的功能测定法可以变化且包括但不限于可测定分离的蛋白 质的功能的测定法，例如，酶促测定法。
[0120] 在一些情况下，所述方法进一步包括通过将蛋白质或肽施加至含有修饰剂，例如 蛋白质或肽修饰剂的聚（酸)基质而以受控方式修饰样品的组分，例如蛋白质或肽。蛋白质 修饰剂包括但不限于蛋白质和肽修饰酶和作用于蛋白质和肽修饰(糖基化、乙酰化、烷基 化、甲基化、生物素化、谷氨酰化、甘氨酰化、异平基化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺化、磷酸化、 硫酸化、硒化、C末端酰胺化等）的酶，且包括但不限于:氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解 酶、异构酶、连接酶、聚合酶、激酶、磷酸酶、乙酰酶、脱乙酰酶、甲基化酶、脱甲基酶、泛素化 酶、脱泛素化酶、淀粉酶和蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天 冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等)等。根据某些实施方案，本公开的修饰剂可 以直接与聚(酸)基质结合或可以经由亲和性元件结合。在某些情况下，受控的蛋白质和肽 修饰，例如，受控的蛋白质或肽消化，是通过控制蛋白质或肽暴露于特定修饰剂的速率或时 间量，由此控制修饰，例如蛋白质或肽消化的速率和/或时间来实现。在一些情况下，这种控 制可以通过控制样品通过旋转柱的流量来调节蛋白质或肽对蛋白质修饰剂，例如蛋白酶的 暴露速率或暴露时间而得以实现。在一些情况下，旋转柱可以限制流体完全处于环境条件 下，使得蛋白质或肽在样品被施加至基质之后便暴露于蛋白质修饰剂且直至从所述膜引出 样品，例如通过施加力，例如通过使所述柱在离心机中旋转。在一些情况下，旋转柱可以限 制流体部分处于环境条件或施力条件下，使得蛋白质或肽在样品移动通过基质时暴露于蛋 白质修饰剂，例如，通过由重力、正压力、真空压力或离心力(例如，通过使用离心机来施加） 施加的力，且可以通过调节为了移动样品通过基质而施加的力来控制暴露速率。在样品移 动通过基质的一些情况下，为了控制对修饰剂的暴露速率，可以通过施加额外的力或增加 已经施加的力，例如通过使柱在离心机中旋转或增加离心机的速度而从基质中完全去除样 品。在一些情况下，待修饰的蛋白质可以与如本文中在其他部分描述的旋转柱的聚（酸)膜 结合，且修饰剂能够以受控的方式与聚(酸)膜接触，例如，持续受控量的时间，或以受控的 速率流过所述膜。在一些情况下，可以通过修饰聚(酸)膜的一些分量来控制暴露于修饰剂 的时间或速率，例如聚(酸)膜的厚度、聚(酸)膜的孔隙度、聚(酸)膜的聚合物密度等。在一 些情况下，修饰待修饰的蛋白质的一些物理性质，例如修饰蛋白质的三维结构，例如通过使 蛋白质经历变性条件，可以用作控制蛋白质修饰速率的附加手段。在一些情况下，可以根据 本文中先前描述的洗涤和洗脱方法，对如本文中所描述通过受控的手段加以修饰的经修饰 蛋白质或肽进行进一步洗涤或从基质中洗脱。
[0121] 在一些情况下，所述方法进一步包括对聚(酸)膜进行再使用和/或再填充。在其他 情况下，所述膜可以在未进行剥离/再填充的情况下直接再使用，例如，当将要结合相同的 靶标或分析物时。在一些情况下，可以再使用细长结构且替换聚(酸)膜。在一些情况下，如 本文中所描述的收集管可以与新的或再生的旋转柱一起再使用。
[0122] 效用
[0123] 如本文中所描述的旋转柱和方法得以用于多种不同的应用，包括但不限于蛋白质 纯化应用、抗体纯化应用、分析物检测应用、选择性分析物富集应用、受控的蛋白质和肽消 化应用、受控的蛋白质或肽修饰应用、环境纯化应用等。
[0124] 在某些情况下，本公开的旋转柱和方法可以用于出于研究目的纯化个别分析物的 研究设定，或用于非诊断性分析物检测应用。此类研究分析物的分离可以由研究样品，即， 实验室衍生的研究样品或实验室生成的研究样品来进行，其中此类样品是在研究试验室中 生成。此类研究样品可以用作所期望的非诊断性分析物，即，并非获自或来源于活的多细胞 生物体(例如，哺乳动物）的分析物的来源，以便作出诊断。换言之，尚未获得用于确定一种 或多种疾病分析物的存在的样品以便诊断疾病或病状。感兴趣的非诊断性样品包括获自体 外来源的那些，例如，细胞培养物、组织培养物、非诊断性动物组织样品或体液（即，不被用 于诊断时的此类样品）。在某些情况下，特定非诊断性样品的复杂性需要从样品中分离或纯 化出非诊断性分析物，以便允许对分析物的有效检测。
[0125] 在某些情况下，本公开的旋转柱和方法可以用于临床设定以用于分离疾病分析 物。可以从诊断样品，即，来源于生物体，例如植物、动物、哺乳动物等的样品中分离疾病分 析物，以便诊断诊断性分析物的存在且随后允许诊断疾病或病状。在某些情况下，特定诊断 性样品的复杂性需要从样品中分离或纯化出诊断性分析物，以便允许对分析物的有效检 测。可以从中分离出诊断性分析物的诊断性样品包括但不限于：组织样品、血液、尿液、精 液、粪便、唾液、粘液、痰液、泪液、脑脊髓液、淋巴、胆汁、胃酸等等。在某些情况下，诊断性样 品在施加至本公开的旋转柱之前必须首先经过处理，例如，均质化、研磨、溶解、稀释或浓 缩。在其他情况下，诊断性样品可以在不进行预处理的情况下直接施加至旋转柱。
[0126] 在某些实施方案中，在诊断性分析物与旋转柱结合后，没有从聚（酸)膜中洗脱诊 断性分析物，且在聚（酸)膜上直接进行分析物的检测。在聚（酸)膜上检测诊断性分析物可 以通过任何适宜的手段来进行，并且可以例如由以下组成:使所述膜与检测剂，例如与结合 对的第二成员（例如抗体、抗原、配体、受体等)或与反应对的第二成员（例如，基底、酶等）的 成员接触，该成员能在临界量的诊断性分析物与聚(酸)膜结合时生成或使得可能生成可检 测信号。对浓缩在本公开的旋转柱的聚(酸)膜上的诊断性分析物的这种检测允许在不进行 分析物扩增或检测信号扩增的情况下通过常规手段检测正常情况下不会以足以被检测到 的浓度存在于诊断样品中的分析物。
[0127] 在某些情况下，本公开的旋转柱和方法可以用于需要选择性富集某些靶分析物的 应用中。举例来说，某些靶分析物，例如非诊断性分析物、诊断性分析物或环境分析物可以 使用如本文中所描述的旋转柱或方法，基于样品中许多不同的靶分析物所共有的一些一般 特征，例如物理特征或化学特征(例如pK a、pKb、疏水性、大小、电荷、磷酸化状态、泛素化状态 等）加以富集，使得富集的产物可以用于下游应用，例如进一步分析或者进一步富集或纯 化。在一些情况下，这种进一步下游应用没有效率或不具功能，例如，在不进行先前选择性 富集的情况下可能检测不到个别分析物或个别分析物的个别方面。举例来说，在一些情况 下，本公开的旋转柱和方法得以用于在下游应用之前选择性富集某些靶分析物，包括但不 限于:蛋白质组学应用、肽测序应用、质谱应用、电子转移离解应用、串联质谱应用、高效液 相色谱应用、基质辅助激光解吸/电离应用等等。
[0128] 在某些情况下，本公开的旋转柱和方法可以用于从环境样品，即，来源于环境的样 品中分离出分析物。如本文中所使用，环境样品明确不包括在实验室设定中出于研究目的 而得到的研究样品或其他样品。可以使用本文中所描述的旋转柱和方法从中分离出环境分 析物的环境样品包括但不限于空气样品、颗粒样品、水样品（即，雨水样品、淡水样品、海水 样品）和土壤样品。在某些情况下，可以将环境样品直接施加至旋转柱以便在未对样品进行 预处理的情况下分离如本文中所描述的环境分析物。在一些情况下，且在施加至旋转柱之 前首先对环境样品进行处理，例如研磨、稀释、浓缩、溶解、吸附等。
[0129] 在某些实施方案中，在环境分析物与旋转柱结合后，没有从聚（酸)膜中洗脱环境 分析物且直接在聚(酸)膜上进行分析物的检测。在聚(酸)膜上检测环境分析物可以通过任 何适宜的手段来进行，并且可以例如由以下组成:使所述膜与检测剂或与反应对的第二成 员接触，该成员可在临界量的诊断性分析物与聚(酸)膜结合时生成或使得可能生成可检测 信号。对浓缩在本公开的旋转柱的聚(酸)膜上的环境分析物的这种检测允许在不进行分析 物扩增或检测信号扩增的情况下通过常规手段检测正常情况下不会以足以被检测到的浓 度存在于环境样品中的分析物。
[0130] 在某些情况下，本公开的旋转柱和方法可以用于环境纯化应用。举例来说，能够结 合一种或多种环境分析物，诸如以上所讨论的那些的旋转柱可以用于纯化需要去除特定环 境分析物的环境样品。可以从环境样品中去除的此类特定环境分析物是已知能结合所述分 析物的特异性或非特异性亲和性元件的那些环境分析物，且包括但不限于:环境毒素、污染 物(例如重金属、持续有机污染物、环境持续药物污染物、多环芳香烃、氯化烃、挥发性有机 化合物、环境异源生物质、肥料、杀虫剂、除草剂、污水、污垢等)和生物体(例如入侵生物体、 致病生物体等）。在某些实施方案中，本公开的旋转柱和方法可以通过使一个或多个环境样 品，例如水，流过此类旋转柱以便生成经纯化的，即，无分析物或基本上无分析物的环境样 品而加以利用。
[0131] 在某些情况下，本公开的旋转柱和方法可以用于蛋白质纯化应用，例如分离重组 蛋白质或分离天然蛋白质。可以使用本公开的旋转柱和方法分离的重组蛋白质广泛变化且 包括在实验室中产生或生长的那些重组蛋白质。在一些情况下，从中分离出重组蛋白质的 重组蛋白质样品可以是获自实验室生物体(例如植物或动物）或实验室生物体培养物（例 如，细菌培养物、酵母培养物、细胞培养物、藻类培养物、海洋生物培养物等）的样品，这些是 生物工程改造的结果，即，表达在正常情况下野生型生物体中没有发现，即在自然界中的宿 主生物体中没有发现的重组或突变蛋白质。
[0132] 本公开的旋转柱和方法得以用于快速分离蛋白质以用于筛选应用，例如，用于高 通量筛选应用。根据某些实施方案，多种感兴趣的蛋白质，例如，突变或重组蛋白质库，可以 在多路配置下分离，以允许针对特定蛋白质功能或特征，例如与特定底物的结合、荧光、酶 活性、持续合成性等对多种蛋白质进行高通量筛选。感兴趣的多路配置包括但不限于96单 元、384单元或1536单元阵列中的旋转柱。多种感兴趣的蛋白质可以变化，并且可以根据任 何适宜的方法来生成，包括但不限于生物体或生物体基因组或生物体基因或人工基因的随 机或定向诱变。在某些情况下，使用本公开的旋转柱和方法分离的多种蛋白质可以直接用 于蛋白质组学应用。
[0133] 本公开的旋转柱和方法得以用于快速分离在工业设定下产生的分子，例如蛋白 质。举例来说，本公开的旋转柱和方法可以用于分离大量生成，例如生长的分子，包括例如 批量规模量、试验规模量或工艺规模量。工业设定下产生的分子可以是合成分子、工程改造 分子(例如重组蛋白质）或天然存在的分子。举例来说，在某些情况下，通过肽合成法，例如 液相肽合成或固期合成产生的合成蛋白质或合成肽可以使用本文中所描述的旋转柱和方 法加以纯化，以便去除杂质或去除不正确的合成产物，例如截短肽、缺失肽、非所期望的异 构体、非所期望的副产物等等。
[0134] 在一些情况下，例如，如本文中所描述如研究实验室中所生成的重组蛋白质或肽 可以在工业设定下大量地，例如以批量规模量、试验规模量或工艺规模量生成。细胞或无细 胞蛋白质或肽合成的适合适宜方法都可以用于生成可使用本文中所描述的柱和方法分离 的蛋白质，包括但不限于通过以下生成的蛋白质：体外合成，例如无细胞体外蛋白质合成； 体内合成，例如通过蛋白质生物合成；或在生物反应器中生长。在其他情况下，可以使用本 文中所描述的旋转柱和方法在工业设定下分离天然分子，例如天然存在的蛋白质或肽。举 例来说，可以分离的天然蛋白质或肽包括但不限于在天然存在的生物体，例如细菌、古细菌 或真核生物(例如动物、霉菌、真菌、植物或原生动物）中生长的蛋白质。在一些情况下，可以 分离的感兴趣的蛋白质包括但不限于酶(例如氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构 酶、连接酶、核酸内切酶、核酸酶、聚合酶、DNA修饰酶、发光酶、激酶、磷酸酶、乙酰酶、脱乙酰 酶、甲基化酶、脱甲基酶、泛素化酶、脱泛素化酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等）、荧光蛋白、 颜料蛋白、细胞信号传递蛋白、信号转导蛋白、配体结合蛋白、蛋白激素、抗体、蛋白质和肽 抗原、结构蛋白等等。使用本公开的旋转柱和方法分离的蛋白质得以使用的工业包括但不 限于生物技术工业、制药工业、化学工业、食品产生和食品加工业(例如发酵相关的食品加 工(例如烘焙、酿造、干酪制造、酸奶制造等）以及食品提取物和果汁产生）、维生素和营养物 工业、生物燃料工业、造纸工业、农用工业等等。
[0135]本公开的旋转柱和方法得以用于受控的蛋白质和肽加工应用，包括例如受控的蛋 白质和肽消化、受控的蛋白质和肽修饰等等。举例来说，本公开的旋转柱和方法可以用于控 制含有蛋白质的特定样品、多种特定蛋白质或一种特定蛋白质对本文中所描述的蛋白质修 饰剂的暴露。在某些情况下，被应用于受控的蛋白质和肽修饰应用的本公开旋转柱和方法 可能得以用于在以下应用中修饰或消化蛋白质或肽以进行进一步分析或加工，包括但不限 于:蛋白质组学应用、肽测序应用、质谱应用、电子转移离解应用、串联质谱应用、高效液相 色谱应用、基质辅助激光解吸/电离应用等等。
[0136]试剂盒
[0137] 本发明的方面还包括用于实践主题方法的试剂盒。所述试剂盒至少包括旋转柱， 例如，如以上所描述。所述试剂盒和系统还可以包括许多得以用于主题方法中的可选组件。 感兴趣的可选组件包括缓冲液，包括提取/负载/洗涤缓冲液(例如，如以上所描述）；容器， 例如收集管和/或多孔板等等。此外，所述试剂盒和系统可以包括用于产生亲和性肽标记的 多肽的试剂，例如编码金属离子亲和性肽的载体，诸如美国专利第7，176,298号中所公开的 那些;所述载体的公开内容以引用的方式并入本文中。在主题试剂盒中，视乎方便或需要， 一个或多个组件存在于相同或不同的容器中。
[0138] 除以上组件以外，主题试剂盒可以进一步包括(在某些实施方案中）关于实践主题 方法的说明。这些说明能够以多种形式存在于主题试剂盒中，其中一种或多种可以存在于 试剂盒中。这些说明可以存在的一种形式是作为印刷信息处于合适的介质或基底(例如上 面印刷有所述信息的一张或多张纸)上、试剂盒的包装中、包装插页中等等。这些说明的另 一种形式是上面记录有信息的计算机可读介质，例如磁盘、高密度磁盘(CD)、闪存驱动器等 等。这些说明可能存在的又另一种形式是网址，其可以用于经由因特网访问远程站点的信 息。
[0139] 以说明而非限制的方式提供以下实施例。
[0140] 实验
[0141] 材料：
[0142] 评估的膜
[0143] 评估了若干个25mm直径的膜。亲水性高度羟基化尼龙膜(LoProdyne? LP(尼龙6， 6膜，Pall Corporation，Port Washington，NY)，1 · 2μηι孔隙大小，ΙΙΟμπι厚）。用3种不同的化 学反应修饰膜孔隙。1型膜是在逐层(LBL)配置下用聚（丙烯酸）/聚乙烯亚胺/聚（丙烯酸） (ΡΑΑ/ΡΕΙ/ΡΑΑ)聚合物加以修饰且用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)进行官能化以用于在极高 结合容量下快速纯化his标记的蛋白质。2型膜是在膜刷配置下用聚（琥珀酸2-甲基丙烯酰 基酯）聚合物加以修饰且用Ni-NTA进行官能化以用于在极高结合容量下快速纯化his标记 的蛋白质。3型膜是用胰蛋白酶进行官能化以用于受控的蛋白质消化。
[0144] 旋转柱制造
[0145] 将膜切成~7mm直径的圆片且以不同的变化形式组装至旋转柱中：单层、双层、三 层、顶侧向上、顶侧向下等。在旋转柱组装之后，有效过滤/结合区域的直径是~5_。
[0146] 蛋白质样品
[0147] 使用多种起始物质来评估所制造的旋转柱。蛋白质样品起始物质是先前经纯化的 蛋白质样品或表达重组蛋白质的细胞的完整细胞溶解产物。所使用的先前经纯化的蛋白质 样品包括被表达的无亲和性标记的墨绿多管水母GFP(AcGFP)蛋白（无标记的旧GFP)、新纯 化的6x组氨酸-天冬酰胺标记的AcGFP(6HN-AcGFP)和经纯化的组氨酸标记的泛素 (His标记 的泛素 (HisU) (Sigma-Aldrich，St .Louis，M0)。所使用的完整细胞溶解产物蛋白质样品包 括表达6HN-AcGFP和6His-GFPuv的细胞溶解产物。
[0148] 实验/结果：
[0149] 由完整细胞溶解产物进行蛋白质纯化
[0150] 使表达6HN-AcGFP的细胞生长且通过离心形成球粒。将0.25g细胞球粒溶解于4mL xTractor缓冲液(细胞溶解缓冲液，Clontech Laboratories，Mountain View，CA)中。所有 离心步骤都在9000 Xg下进行4min。使用500yL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤3次使2型（刷 状)单层(顶侧向上)膜旋转柱平衡。将600yL和900yL细胞溶解产物负载至单独的平衡过的 柱中。随后用30(^洗涤缓冲液11(20禮似?〇4、0.151似(：1，？!17.6)将柱洗涤两次。在洗涤 后，利用2次施加30(^洗脱缓冲液(20禮恥?04、0.51咪唑、0.51恥(：1，？!17.6)从柱中洗脱 蛋白质。分开保持连续洗脱液以进行个别分析。洗脱后，测定600yL和900yL溶解产物样品的 蛋白质产率分别是142yg和231yg。
[0151] 跑蛋白凝胶以评估600yL (图3)和900yL (图4)细胞溶解产物样品的产率和纯度。通 过使柱流过液(流过液)和柱洗涤液(洗涤液)在凝胶上跑来进一步评估旋转柱性能。使先前 经纯化的无标记AcGFP(无标记的旧GFP)作为对照跑凝胶。
[0152] 比较多种旋转柱配置和靶蛋白质
[0153] 对所制造的具有呈多种取向的膜的旋转柱评估旋转柱性能。
[0154] 头至头地评估具有顶侧向上（向上）和顶侧向下（向下）膜取向的1型（LBL)膜旋转 柱且头至头地评估具有顶侧向上（向上)和顶侧向下（向下)膜取向的2型(刷状)膜旋转柱的 蛋白质纯化特征。所有离心步骤都在11，〇〇〇 X g下进行lmin。用400yL PBS洗涤2次使各柱平 衡。将柱负载先前制备以用于以上实验的200yL细胞溶解产物。用300yL洗涤缓冲液I(20mM NaP〇4、0.1 %Tween，pH 7.6)将旋转柱洗涤一次且用300yL洗涤缓冲液II(20mM NaP〇4、0.15M NaCl，pH7.6)洗涤一次。用300yL洗脱缓冲液（20mM NaP〇4、0.5M咪唑、0.5M NaCl，pH 7.6)将 各旋转柱洗脱一次。洗脱后，具有顶侧向上和顶侧向下取向的1型(LBL)膜旋转柱以及具有 顶侧向上和顶侧向下取向的2型（刷状)膜旋转柱的蛋白质产率据测定分别为34yg、47yg、 115yg和84yg。
[0155] 跑蛋白凝胶以针对1型(LBL)(图5)和2型(刷状）（图6)膜旋转柱的蛋白质洗脱液来 评估产率和纯度。头至头地顶侧向上和顶侧向下取向跑凝胶以评估不同的膜取向的相对蛋 白质纯化特征。通过使柱流过液(流过液)和柱洗涤液(洗涤液)在凝胶上跑来进一步评估旋 转柱性能。使原始样品作为对照跑凝胶。
[0156] 针对用于纯化不同的靶蛋白的旋转柱来评估旋转柱性能。
[0157] 针对预纯化的His标记的泛素的结合和洗脱来评估1型(LBL)膜旋转柱蛋白质纯化 特征。所有离心步骤都在11，〇〇〇\8下进行11^11。用40(^蛋白质溶解缓冲液(？08)(2〇11^ 似卩〇4 4117.6)洗涤2次使各旋转柱平衡。将各旋转柱用50(^1^含0.311^/1^把81]的^^负载 两次。将各负荷的渗透物再负载三次。用300yL洗涤缓冲液B(20mM NaP〇4、0.1%TWeen、 0.15M NaCl，pH 7.6)将旋转柱洗涤两次。用30(^1^冼脱缓冲液将蛋白质洗脱两次。
[0158] 跑蛋白凝胶以针对顶侧向上（向上）和顶侧向下（向下）取向的膜旋转柱的蛋白质 洗脱液来评估产率和纯度（图7)。通过使柱流过液(FT)和柱洗涤液(洗涤液)在凝胶上跑来 进一步评估旋转柱性能。使原始样品(0S)作为对照跑凝胶。
[0159] 针对预纯化的His标记的泛素的结合和洗脱来评估LBL和刷型旋转柱性能的头至 头比较。
[0160] 使LBL和刷型旋转柱平衡且负载有400yL含lmg/mL预纯化的His标记的泛素的缓冲 液(20mM磷酸盐，pH 7.4)。用400yL磷酸盐缓冲液将柱洗涤两次。在第二次洗涤时未观察到 蛋白质。用400yL 0.1M EDTA从柱中洗脱蛋白质。
[0161] 跑蛋白凝胶以针对LBL和刷型旋转柱的蛋白质洗脱液评估产率和纯度（图8)。已知 浓度的蛋白质跑凝胶(图8,泳道1至5)以允许校正和估算洗脱液中的蛋白质浓度。通过使柱 流过液在凝胶上跑来进一步评估旋转柱性能。
[0162] 旋转柱性能的评估
[0163] 对具有不同的膜取向的旋转柱评估旋转柱性能。
[0164] 对先前用过的具有顶侧向上和顶侧向下膜取向的2型（刷状)膜旋转柱进行剥离、 再生和再填充。将柱负载900yL细胞溶解产物且蛋白质纯化程序遵循先前所描述。洗脱后， 针对顶侧向上和顶侧向下取向测定的蛋白质产率分别是188yg和196yg。再使用的膜旋转柱 的产率因此类似于先前未用过的膜旋转柱上所见的那些。
[0165] 跑蛋白凝胶以针对旋转柱的蛋白质洗脱液评估产率和纯度（图9)。通过使柱流过 液和洗涤液在凝胶上跑来进一步评估旋转柱性能。使起始细胞溶解产物作为对照在凝胶上 跑。
[0166] 在旋转柱的膜具有不同数目的层且在细胞溶解缓冲液中加入10mM咪唑的情况下 评估旋转柱性能。
[0167] 对具有呈顶侧向下取向的单层膜的1型柱(样品Ι-d)和具有呈顶侧向上取向的双 层膜的2型柱(样品2-2)进行剥离、再生和再填充。将1型和2型柱分别负载3.6mL和4.2mL细 胞溶解产物，以及含10mM咪唑的溶解缓冲液。如先前所描述进行其他步骤，例如洗涤和洗 脱。洗脱后，针对1型和2型柱测定的蛋白质产率分别是49yg和300yg。在2型柱的蛋白质洗脱 之前的最终洗涤液中测量到88yg蛋白质。
[0168] 跑蛋白凝胶以针对旋转柱的蛋白质洗脱液评估产率和纯度（图10)。通过使柱流过 液和洗涤液在凝胶上跑来进一步评估旋转柱性能。使原始样品（溶解产物)作为对照在凝胶 上跑。
[0169] 不同的膜的评估
[0170] 针对在以蠕动栗抽吸试剂通过的歧管上使用3头过滤装置针对所制造的LBL膜来 评估旋转柱性能。使用Ni-NTA(NTA-赖氨酸）、镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA，无连接子)和Ni-IDA-聚乙二醇（PEG)(具有PEG连接子的IDA)制备小规模47mmLoPl?dyne?(尼龙6,6膜， Pall Corporation，Port Washington，NY)膜。还使用200yLTALON?.(钴亲和性树脂， Clontech Laboratories，Mountain View，CA)树脂来制备旋转柱。使用标准打孔机在膜夹 在两张纸之间的情况下对膜进行切割。膜体积是2.16yL且TAL0N体积是200yL。自己手动组 装旋转柱。
[0171] 如先前所描述由500yL 6His-GFPuv表达细胞溶解产物进行蛋白质纯化。测定蛋白 质产率，如以下表1中所指示。
[0172] 表1
[0173]
[0174]跑蛋白凝胶以针对各种旋转柱的蛋白质洗脱液评估产率和纯度（图11)。通过使柱 流过液和洗涤液在凝胶上跑来进一步评估旋转柱性能。使原始样品溶解产物作为对照在凝 胶上跑。
[0175] 膜结合容量的测定
[0176] 针对在以蠕动栗抽吸试剂通过的歧管上使用3头过滤装置针对所制造的LBL膜来 评估蛋白质结合容量。制备小规模ATmmLoPlOdyne 1?:(尼龙6，6膜，Pal 1 Corporation，Port Washington，NY)膜。
[0177] 如下进行结合容量测定。将以1.6mg/mL处于PBS缓冲液中的经纯化的6His-GFPuv 交换至PDB中，并且用PDB将蛋白质浓度调节至lmg/mL。将膜旋转柱用300yL蛋白质负载两 次。离心在4000 X g下进行lmin。将第二流过液再负载至膜上。用洗涤缓冲液I (补充有0.1 % Tween-20的20mM磷酸盐缓冲液)将柱洗涤一次且用缓冲液11(补充有0.15M NaCl的20mM磷 酸盐缓冲液)洗涤一次。用300yL洗脱缓冲液(含有0.5M咪唑和0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲 液）将蛋白质洗脱两次。通过Bradford测定法估计蛋白质产率。与柱结合的纯化的6His-GFPuv的产率测定为79.3yg且在36.6mg/mL下洗脱。获自6Hi s-GFPuv溶解产物洗脱和最终洗 涤的蛋白质量分别是84yg和13yg，且获自纯化的6Hi s-GFPuv洗脱和最终洗涤的量分别是79 yg矛口15yg。
[0178] 膜性能的可再现性的评估
[0179] 针对在以蠕动栗抽吸试剂通过的歧管上使用3头过滤装置针对所制造的LBL膜来 评估旋转柱可再现性。在未加修饰和使用单独PAA/PEI/PAA聚合物以及存在Ni-NTA或Ni-IDA的情况下制备小规模47 mm L&Prodyne? (尼龙6,6膜，Pa 11 Corporation，Port Washington，NY)膜。使用独立的三批Ni-NTA膜。在不同天制备两批Ni-NTA膜(Ni-NTA 1和 Ni-NTA 2)，且在同一天制备两批并储存在不同的条件下，标准条件和-20°C下（分别是Ni-NTA 1和Ni-NTA-20)。如先前所描述来制备膜和旋转柱。
[0180] 如先前所描述由490yL 6His-GFPuv表达细胞溶解产物进行蛋白质纯化，具有以下 微小变化:将经过滤的水用于所有反应和洗涤，在干燥器中在氯化钙上将膜干燥过夜，且用 新的打孔机对膜进行切割。测定蛋白质产率，如以下表2中所指示。
[0181] 表2
[0182]
[0183] 跑蛋白凝胶以评估不同的旋转柱对蛋白质洗脱液的产率和纯度（图12A至图12B)。 通过使柱流过液和洗涤液在凝胶上跑进一步评估旋转柱性能。使原始样品溶解产物作为对 照在凝胶上跑。
[0184] 堆叠膜的性能的评估
[0185] 针对在以蠕动栗抽吸试剂通过的歧管上使用3头过滤装置针对所制造的多层LBL 膜来评估旋转柱性能。如先前所描述而制得小规模47 mmLoProdyne⑧（尼龙6，6膜，Pal 1 Corporation，Port Washington，NY)和Sterli Tech (Kent，WA)膜，且用稍微修饰的Ni-NTA 进 行功能化。相较于先前试验中的在使用前8-10分钟，在使用前4分钟将1-乙基-3-[3-二甲基 氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC)加入到N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中。
[0186] 自己手动组装含有三层和五层堆叠膜的旋转柱。仅使用单层SterliTech膜。
[0187] 如先前所描述由470yL 6His-GFPuv表达细胞溶解产物进行蛋白质纯化。流速在多 层膜中有所降低，从而使得接触时间增加10%。测定蛋白质产率，如以下表3中所指示。
[0188] 表3.
[0189]
[0190] 跑蛋白凝胶以评估不同的旋转柱对蛋白质洗脱液的产率和纯度（图13A至图13B)。 如在以上表3中，个别地评估堆叠膜的蛋白质结合容量。将个别膜标记如下：五层膜旋转柱 的第一层（1-5)、五层膜旋转柱的第三层（3-5)、五层膜旋转柱的第五层（5-5)、三层膜旋转 柱的第一层（1-3)和三层膜旋转柱的第二层(2-3)。通过使柱流过液和洗涤液在凝胶上跑进 一步评估旋转柱性能。使原始样品溶解产物作为对照在凝胶上跑。
[0191] 结论：
[0192] 1型和2型膜都能有效地分离靶蛋白与经过预纯化的细胞溶解产物和粗细胞溶解 产物。在初步试验中，2型膜对His标记的AcGFP具有较高容量，高达~106mg/cm3结合容量。2 型膜具有较长样品接触时间且1型膜具有更快速样品流过。顶侧向上对比顶侧向下配置不 显著影响性能，因为膜能够在任一取向下进行有效而又快速的蛋白质纯化。在再利用时和 在存储后，膜性能显著得以保留。多层膜维持蛋白质纯化容量，在蛋白质结合容量方面显示 极小变化，而不管多层堆叠内的个别膜位置。
[0193] 尽管有所附条款，但是还通过以下条款限定本公开：
[0194] 1. 一种旋转柱，其包括：
[0195] 细长空心结构，其具有第一端处的样品入口和第二端处的样品出口；和
[0196] 聚（酸)膜基质，其位于所述细长空心结构中，使得流体必须流过所述聚（酸)膜以 从所述第一端横跨所述结构至所述第二端。
[0197] 2.根据条款1所述的旋转柱，其中所述聚（酸)膜基质包括被吸附至多孔膜载体表 面的聚(酸)组件。
[0198] 3.根据条款2所述的旋转柱，其中所述聚(酸)组件包括聚(酸)膜。
[0199] 4.根据条款2所述的旋转柱，其中所述聚(酸)组件包括聚(酸)刷。
[0200] 5.根据条款3或4所述的旋转柱，其中所述聚(酸)组件还包括与金属离子络合的金 属离子螯合配体。
[0201] 6.根据条款5所述的旋转柱，其中所述金属离子螯合配体包括基于天冬氨酸的金 属离子螯合配体。
[0202] 7.根据条款5或6所述的旋转柱，其中所述金属离子包括Co2+。
[0203] 8.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述细长空心结构是管。
[0204] 9.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述聚(酸)膜位于所述第二端的近 端。
[0205] 10.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述聚（酸)基质包括两个或更多 个堆叠膜，所述膜各自具有被吸附至多孔膜载体表面的聚(酸)组件。
[0206] 11.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述聚（酸)基质包括三个或更多 个堆叠膜，所述膜各自具有被吸附至多孔膜载体表面的聚(酸)组件。
[0207] 12.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述样品入口具有第一直径且所 述样品出口具有第二直径。
[0208] 13.根据条款12所述的旋转柱，其中所述第一直径比所述第二直径长。
[0209] 14.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述柱具有介于ΙμL至1升范围内 的体积。
[0210] 15.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述旋转柱包括与所述聚(酸)膜 呈负载关系的玻璃料。
[0211] 16.根据条款15所述的旋转柱，其中所述玻璃料可与所述细长结构隔开。
[0212] 17.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述旋转柱是嵌套在收集管中。
[0213] 18.根据条款17所述的旋转柱，其中所述收集管包括盖帽。
[0214] 19.根据前述条款中任一条所述的旋转柱，其中所述旋转柱包括所述第一端处的 盖帽。
[0215] 20.根据条款18或19所述的旋转柱，其中所述盖帽是扣盖。
[0216] 21.根据条款18或19所述的旋转柱，其中所述盖帽是旋盖。
[0217] 22. -种处理液体样品的方法，所述方法包括：
[0218]经由所述样品入口将所述样品引入根据条款1至21中任一条所述的旋转柱中；和
[0219] 使所述样品移动通过所述聚(酸)膜以处理所述样品。
[0220] 23.根据条款21所述的方法，其中通过使所述柱旋转而使所述样品移动通过所述 聚(酸)膜。
[0221] 24.根据条款22所述的方法，其中通过向所述结构的所述第二端施加真空而使所 述样品移动通过所述聚(酸)膜。
[0222] 25.根据条款22至24中任一条所述的方法，其中所述聚（酸)膜经配置以结合所述 样品中的蛋白质且所述方法是从所述样品中分离蛋白质的方法。
[0223] 26.根据条款22至24中任一条所述的方法，其中所述聚（酸)膜经配置以结合所述 样品中的核酸且所述方法是从所述样品中分离核酸的方法。
[0224] 27.根据条款22至24中任一条所述的方法，其中所述聚（酸）膜经配置以特异性结 合所述样品中的感兴趣的分析物且所述方法是从所述样品中分离所述分析物的方法。 [0225] 28.根据条款27所述的方法，其中所述分析物是选自由蛋白质、核酸和小分子组成 的群。
[0226] 29.根据条款25至28中任一条所述的方法，其中所述方法还包括从所述聚（酸)膜 释放结合的分子。
[0227] 30.-种试剂盒，其包括：
[0228] 根据条款1至14中任一条所述的旋转柱;和
[0229] 经配置以便呈嵌套关系接收所述旋转柱的收集管。
[0230] 虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例较详细地描述上述发明，但是 对一般技术人员来说容易显而易见的是，根据本发明的教导，可以对其进行某些改变和修 改而不脱离附加的权利要求书的精神或范畴。
[0231]相应地，前述仅仅说明了本发明的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各 种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但是它们体现了本发明的原理并且 包括在其精神和范围内。此外，本文所叙述的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理 解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的实 施例和条件构成限制。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例 的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。此外，希望此类等效物包括目前已知 的等效物和未来开发出来的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。 因此，本发明的范围不意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和 精神由所附权利要求书体现。
【主权项】
1. 一种旋转柱，其包括： 细长空心结构，其具有第一端处的样品入口和第二端处的样品出口；和 聚（酸)膜基质，其位于所述细长空心结构中，使得流体必须流过所述聚（酸)膜以从所 述第一端横跨所述结构至所述第二端。2. 根据权利要求1所述的旋转柱，其中所述聚（酸)膜基质包括被吸附至多孔膜载体表 面的聚(酸)组件。3. 根据权利要求2所述的旋转柱，其中所述聚(酸)组件包括聚(酸)膜或聚(酸)刷。4. 根据权利要求3所述的旋转柱，其中所述聚（酸)组件还包括与金属离子络合的金属 离子螯合配体。5. 根据权利要求4所述的旋转柱，其中所述金属离子螯合配体包括基于天冬氨酸的金 属离子螯合配体。6. 根据前述权利要求中任一项所述的旋转柱，其中所述细长空心结构是管。7. 根据前述权利要求中任一项所述的旋转柱，其中所述聚(酸)膜位于所述第二端的近 端。8. 根据前述权利要求中任一项所述的旋转柱，其中所述聚(酸)基质包括两个或更多个 堆叠膜，所述膜各自具有被吸附至多孔膜载体表面的聚(酸)组件。9. 根据前述权利要求中任一项所述的旋转柱，其中所述样品入口具有第一直径且所述 样品出口具有第二直径。10. 根据权利要求9所述的旋转柱，其中所述第一直径比所述第二直径长。11. 根据前述权利要求中任一项所述的旋转柱，其中所述旋转柱包括与所述聚（酸)膜 呈负载关系的玻璃料。12. 根据前述权利要求中任一项所述的旋转柱，其中所述旋转柱是嵌套在收集管中。13. -种处理液体样品的方法，所述方法包括： 经由所述样品入口将所述样品引入根据权利要求1至12中任一项所述的旋转柱中；和 使所述样品移动通过所述聚(酸)膜以处理所述样品。14. 根据权利要求13所述的方法，其中通过使所述柱旋转而使所述样品移动通过所述 聚(酸)膜。15. -种试剂盒，其包括： 根据权利要求1至12中任一项所述的旋转柱;和 经配置以便呈嵌套关系接收所述旋转柱的收集管。
【文档编号】G01N30/38GK105980846SQ201480074301
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月23日
【发明人】乔治·G·乔克哈兹, 撒安坦·米特拉
【申请人】宝生物工程美国有限公司