一种中药中黄曲霉素b1含量测定的方法
【专利摘要】本发明公开了一种中药中黄曲霉素B1含量测定的方法：将待测中药溶液调节pH值至2～5，加入磁性纳米颗粒，搅拌混匀，混合液在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀加入体积比2:1的二氯甲烷和丙酮混合液，搅拌解吸附，在外加磁场作用下分层，收集上层清液，自然挥干后用无水甲醇复溶，过0.22μm滤膜，滤液采用高效液相色谱进行黄曲霉素B1测定；本发明是首次将磁性固相萃取技术用于中药中黄曲霉毒素的含量测定，具有操作简便、成本低、准确度高等优点。
【专利说明】
一种中药中黄曲霉素Bi含量测定的方法 (一)
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种黄曲霉素出含量测定的方法，特别涉及一种中药中黄曲霉素出含 量测定的方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 黄曲霉素是一组化学结构类似的真菌次级代谢产物，其基本结构为二呋喃环合香 豆素，主要包括黄曲霉素81(4?8 1)』2(4?82)、61以?61)、62以?62)，具有严重的致癌、致畸、致 突变等作用，危害巨大。其中，AFBi毒性最强也最为常见，在1993年被世界卫生组织癌症研 究机构划定为I类致癌物。
[0003] 黄曲霉素不仅广泛存在于玉米、麦类、稻谷等农产品以及坚果、花生等多种食用植 物中，也存在于中药等药用植物中。中药材种类繁多，种植地区广泛，多数药材在生产、加 工、贮藏、运输的过程中，很容易发生霉变而被黄曲霉素污染。有学者在对中药黄曲霉素的 污染情况进行调研时发现，中药材、饮片及中成药被黄曲霉素污染的情况十分普遍。如检测 不同批号的25批含豆豉、曲类等中药制剂中AFBi的含量，检测结果显示100%污染AFBi，沉香 化滞丸、银翘解毒丸、柏子养心丸的AFBi质量分数均在600ng/g以上。
[0004] 因其剧毒和强致癌性，且对于其污染预防研究的薄弱，黄曲霉素成为国内外政府 和消费者监管与关注重点。针对农产品及食品，我国及世界各国就其污染问题采取控制措 施，即设置严格的限量标准来保障农产品质量安全。而相较之下，对于中药中的污染控制甚 为薄弱。《中国药典》2010年版首次收载了桃仁、僵蚕、酸枣仁、胖大海、陈皮等少数中药材中 黄曲霉素残留限量检测，规定其中AFB^最高允许量不得超过5yg/kg，黄曲霉素(Bi+BdGd G 2)含量不得超过10yg/kg。中成药作为中药的主要临床使用形式，尚未有标准对其黄曲霉 素的限量进行规定。所以对于中药安全性的监管和黄曲霉素污染的控制势在必行，而针对 中药，尤其是中成药建立高灵敏度的黄曲霉素测定方法有着迫切的需求。
[0005] 基于磁性材料的分离技术是近年来国内外研究的一个热点领域，该技术在细胞分 离、药物转运、酶的固定化、催化、吸附-分离、材料科学、环境等诸多领域中都展示了应用前 景。磁性纳米材料可作为磁性固相萃取(MSPE)的吸附剂。与常规的固相萃取(SPE)柱填料相 比，纳米粒子的比表面积大、扩散距离短，只需使用少量的吸附剂和较短的平衡时间就能实 现萃取分离，因此具有较高的萃取能力和萃取效率。经功能化修饰，磁性吸附剂有望实现对 分析物的选择性萃取。另外，磁性吸附剂经适当的清洗后可以循环使用。MSPE仅通过施加一 个外部磁场即可实现相分离，因此操作简单、省时快速、无需离心过滤等繁琐操作，避免了 传统SPE吸附剂需装柱和样品上样等耗时问题，而且在处理生物、环境样品时不会存在SPE 中遇到的柱堵塞的问题。MSPE技术在痕量污染物萃取分离领域已得到了应用，为痕量分析 物的预富集打开了一扇新窗。但目前使用的功能化的磁性纳米微粒在中药中样品前处理的 应用研究较少，主要集中在对生物样品中代谢产物或金属离子的富集中。尚未有应用该技 术用于中药中的黄曲霉素测定的报道。
[0006] 综上，针对中成药黄曲霉素分析中迫切需要解决的样品前处理难题，本发明拟选 取一味代表中成药一一生脉饮(党参方)为研究对象，将新型的功能性磁性纳米材料用于其 黄曲霉素的检测研究中。通过寻找选择性强的功能化磁性纳米颗粒，对磁性固相萃取的条 件进行优化，建立高灵敏度的磁性固相萃取-高效液相色谱-荧光检测的方法用于生脉饮 (党参方）中的黄曲霉素含量测定，为中药黄曲霉素的控制及限量标准的制定提供技术支 持，为开发一种低成本、高选择性的黄曲霉素样品预处理材料提供依据。 (三)
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种快速、灵敏、低成本的方法将磁性纳米颗粒用于中药中黄 曲霉素Bi的含量测定。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种中药中黄曲霉素仏含量测定的方法，所述方法为:将待测中药溶 液调节pH值至2~5(优选3.5)，加入磁性纳米颗粒，搅拌混勾，混合液在外加磁场作用下分 层，除去上层清液，下层沉淀加入体积比2:1的二氯甲烷和丙酮混合液，搅拌解吸附，在磁场 作用下分层，收集上层清液，自然挥干后用无水甲醇复溶，过〇.22wii滤膜，滤液采用高效液 相色谱进行黄曲霉素也测定;所述磁性纳米颗粒为2-氨基-5-巯基_1，3,4_噻二唑3-三甲基 硅烷-1-丙硫醇修饰四氧化三铁磁性纳米颗粒，即AMT-TMSPT-MNPs，简称MMNPs，AMT为2-氨 基-5-巯基_1，3，4_噻二唑，TMSPT为3-三甲基硅烷-1-丙硫醇，MNPs为四氧化三铁磁性纳米 颗粒。
[0010] 进一步，所述磁性纳米颗粒加入量以待测中药溶液体积计为10_20g/L，优选15g/ L〇
[0011] 进一步，所述二氯甲烷和丙酮混合液与待测中药溶液体积比为0.3-1.2:1，优选 0.9:1 〇
[0012] 进一步，所述吸附时间（g卩搅拌混勾时间）为5~15min，优选lOmin。
[0013] 进一步，所述解吸时间（即搅拌解吸附时间）为2~lOmin，优选8min。
[0014] 进一步，所述高效液相色谱检测条件为:色谱柱:Ci8柱，4 ? 6mm X 250mm，< 5wii;流动 相：乙腈、甲醇、体积浓度0.1 %甲酸水溶液，体积比10-25:10-25: 50-80;流速:0.8-1.2mL/ min;柱温:20-30°C;荧光检测器。理论板数按黄曲霉素也峰计算应不低于3000。
[0015] 进一步，所述外加磁场是指以磁铁作为外加磁场源。
[0016] 进一步，所述C18柱所用碳十八烷基硅烷键合硅胶粒径为5mi或3.5M1。
[0017] 进一步，所述流动相：乙腈、甲醇、体积浓度0.1 %甲酸水溶液，体积比20:20:60。 [0018] 进一步，所述柱温:25 °C。
[0019]进一步，所述焚光检测器激发波长:360nm，发射波长:440nm〇
[0020] 进一步，所述磁性纳米颗粒按如下方法制备：
[0021] (1)将FeCl3 ? 6H20和FeCl2 ? 4H20与去离子水混合，在氮气保护的条件下85°C水浴 加热并搅拌30min，缓慢注入质量浓度25-28 %的氨水，加入氨水结束后，继续加热反应 30min，离心，取沉淀用去离子水洗涤2次，再用0.02mol/L氯化钠水溶液洗涤1次，沉淀于40 ~60°C下干燥，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒;所述FeCl 3 ? 6H20和FeCl2 ? 4H20质量比为2 ~3:1，所述去离子水体积用量以FeCl3 ? 6H20和FeCl2 ? 4H20总质量计为12~13mL/g，所述 氨水体积用量以FeCl3 ? 6H20和FeCh ? 4H20总质量计为1.4~1.8mL/g;
[0022] (2)将步骤（1)四氧化三铁磁性纳米颗粒用去离子水配制成40g/L的储备液，将储 备液在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀加入质量浓度1〇%3_三甲基硅烷-1-丙硫醇水溶液，搅拌均匀，再加入甘油，在氮气保护下于90°C水浴中加热并剧烈搅拌2h，冷 却至室温后，在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀依次用去离子水洗涤3次，无 水甲醇洗涤3次，去离子水洗涤5次，沉淀颗粒于40~60°C下干燥，得到3-三甲基硅烷-1-丙 硫醇磁性纳米颗粒修饰物;所述3-三甲基硅烷-1-丙硫醇水溶液与储备液体积比为4~5:1， 所述甘油与储备液体积比为3~4:1;
[0023] (3)将步骤（2)3-三甲基硅烷-1-丙硫醇磁性纳米颗粒修饰物用去离子水配制成 40g/L储备液，用甲醇洗涤2次，加入质量浓度1 % 2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑水溶液，在 超声波功率为600W的条件下超声2h，得到颗粒沉淀用去离子水洗涤3次，再用无水甲醇洗涤 2次，于40~60°C下干燥12h，即得到2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑3-三甲基硅烷-1-丙硫醇 磁性纳米颗粒修饰物，即为磁性纳米颗粒(MMNPs);所述2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑水溶 液与储备液体积比为5~8:1，优选6:1。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0025] (1)针对中药具有复杂的物质体系，且黄曲霉素含量极低这一特点，建立高灵敏度 的磁性纳米颗粒-高效液相色谱荧光法对黄曲霉毒素也进行含量测定研究，具有成本低、选 择性尚等优点。
[0026] (2)目前功能化磁性纳米颗粒主要集中使用在生物样品和食品中的代谢产物或金 属离子的富集中，本发明是首次将磁性固相萃取技术用于中药中黄曲霉毒素的含量测定， 具有操作简便、成本低、准确度高等优点。 (四）
【附图说明】
[0027]图1:不同因素对黄曲霉素也回收率影响曲线图，（a)样品溶液pH、（b)磁性纳米颗 粒加入量、（c)富集时间、（d)洗脱液体积、（e)洗脱时间。
[0028]图2:黄曲霉素出标准品的液相色谱图。
[0029] 图3:实施例4供试品溶液的液相色谱图。
[0030] 图4:不同流动相系统下生脉饮(党参方)的液相色谱图。
[0031] 图5:不同柱温条件下生脉饮(党参方)的液相色谱图。
[0032] 图6:不同企业生脉饮(党参方）的液相色谱图，A为A企业生脉饮(党参方），B为B企 业生脉饮(党参方），C为C企业生脉饮(党参方），D为D企业生脉饮(党参方），E为E企业生脉饮 (党参方）。 (五)
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0034]本发明实施例2-3所用生脉饮(党参方)购自江西汇仁药业有限公司。
[0035]本发明实施例所述外加磁场均以150*100*25mm的磁铁块贴近圆底烧瓶作为外加 磁场源。
[0036]实施例1磁性纳米颗粒的制备
[0037] (1)称取11.68g的FeCl3 ? 6H20和4.30g的FeCl2 ? 4H20置于三口烧瓶中，加入200mL 去离子水，充入氮气后密封，在氮气保护的条件下85°C水浴加热并搅拌30min，缓慢注入质 量浓度25-28%的氨水23mL，使溶液颜色发生变化。加入氨水结束后，继续加热，85°C反应 30min，离心，所得到的沉淀用去离子水洗涤2次，再用0.02mol/L氯化钠水溶液洗涤1次，得 到的颗粒沉淀于45°C下干燥36h，即得到四氧化三铁磁性纳米颗粒(MNPs)1.5g，将其以40g/ L的浓度贮存于去离子水中，制成MNPs储备液，备用。
[0038] (2)取20mL MNPs储备液倒入圆底烧瓶中，用外加磁场使其快速分层，除去上层清 液，下层沉淀先加入80mL质量浓度10 % 3-三甲基硅烷-1-丙硫醇(TMSPT)水溶液，搅拌均匀， 再加入60mL甘油，充入氮气后密封，在氮气保护下于90 °C水浴中加热并剧烈搅拌2h，冷却至 室温后，在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀依次用去离子水洗涤3次，无水甲 醇洗涤3次，去离子水洗涤5次，沉淀于45 °C下干燥12h，得到3-三甲基硅烷-1 -丙硫醇磁性纳 米颗粒修饰物(TMSPT-MNPs)约1.0g，将其以40g/L的浓度贮存在去离子水中，制成TMSPT-MNPs储备液，备用。
[0039] (3)取上述TMSPT-MNPs储备液25mL用无水甲醇洗涤2次，均匀加入150mL质量浓度 1%2_氨基-5-巯基-1，3,4_噻二唑(AMT)的水溶液中，所得溶液转移到烧杯中，在超声波功 率为600W的条件下超声2h，得到的溶液，用外加磁场使其快速分层，除去上清液，得到颗粒 沉淀用去离子水洗涤3次，再用无水甲醇洗涤2次，于45°C下干燥12h，即得到2-氨基-5-巯 基-1，3，4-噻二唑3-三甲基硅烷-1-丙硫醇磁性纳米颗粒修饰物AMT-TMSPT-MNPs (MMNPs) 0.8g，供样品前处理使用。
[0040]实施例2色谱条件的优化
[00411 1、样品前处理:取生脉饮(党参方）10mL，加入150mg实施例1方法制备的MMNPs，室 温下搅拌1 0m i n，用外加磁场将MMNP s与上清液分离，倾出上清液，沉淀加入9mL CH2C12: Me2C0(2:1，v/v)，搅拌解吸附8min，在磁场作用下分层，收集上层清液，自然挥干后用300此 无水甲醇复溶，过0. 22mi滤膜，取滤液，制得样品溶液。
[0042] 2、流动相选择
[0043]采用高效液相色谱荧光法对样品溶液进行黄曲霉素出含量测定。
[0044] (1)仪器与试药：
[0045] Agilent Technologies 1290infinity超高效液相色谱系统（包括四元梯度栗 (G4204A，1290Quat Pump)、在线脱气机、自动进样器（G4226A，1290ALS)、柱温箱（G1330B， 1290TCC)、荧光检测器(G1321B，1260FLD)、色谱数据工作站；奥豪斯AR224w(万分之一电子 天平）；十万分之一电子天平（METTLER XS205);黄曲霉素B1对照品购自美国Sigma Chemical公司，经高效液相检测，纯度均在98%以上；甲酸(色谱纯，美国TEDIA公司），乙腈 (色谱纯，美国TEDIA公司），水为纯净水。
[0046] (2)色谱条件的选择
[0047]色谱柱:Agilent SB_Ci8柱（4.6mmX250mm，5iim);
[0048]流动相：A为乙腈，B为质量浓度0.1 %甲酸水溶液，C为无水甲醇，按乙腈-甲醇_ 0 ? 1 %甲酸水(20:20:60，v/v/v)进行等度洗脱；
[0049] 流速：1 .OmL/min;
[0050] 柱温：25°C;
[0051]检测器:荧光检测器；
[0052] 检测波长:激发波长:360nm，发射波长:440nm;
[0053]进样量：20yL。
[0054] 流动相分别为：乙腈-甲醇-0.1 %甲酸水（10 :10:80，v/v/v)，乙腈-甲醇-0.1 %甲 酸水（15:15:70，v/v/v)，乙腈-甲醇-〇? 1 % 甲酸水(20:20:60，v/v/v)。
[0055]结果表明（见图4)用乙腈-甲醇-0.1%甲酸水(20:20:60^八八)为流动相等度洗 脱效果较优，而且各色谱峰分离度好，峰形尖锐。
[0056] 3、柱温的影响
[0057] 参照流动相的选择，柱温分别为:20°C、25°C、30°C ;流动相为：乙腈-甲醇-0.1 %甲 酸水(20:20:60，v/v/v)。
[0058] 结果表明（见图5)，试验中考察了不同柱温(20°(：、25°(：、30°(：)下色谱峰的分离情 况类似，温度对色谱峰的分离影响不大。
[0059 ]实施例3磁性纳米颗粒萃取条件的优化
[0060] 1、样品溶液pH:取生脉饮（党参方）各1 OmL，将其pH分别调成2.0,3.0,3.5,4.0， 5.0，向样品溶液中均匀加入lOOmg实施例1方法制备的MMNPs，搅拌lOmin，用外加磁场将 MMNPs与上清液分离，倾出上层清液，下层沉淀用9mL CH2C12:Me2C0(2:1，v/v)，搅拌解吸附 lOmin，在磁场作用下分层，收集上层清液，自然挥干后用300此无水甲醇复溶，过0.22wii滤 膜，取滤液，制得样品溶液，采用实施例2方法进行高效液相色谱仪检测(柱温:25 °C，乙腈-甲醇-0.1 %甲酸水(20:20:60，v/v/v)为流动相），结果表明（见图1中a)pH=3.5的溶液条件 黄曲霉素也的吸附效果较优。
[0061 ] 2、磁性纳米颗粒用量:取生脉饮(党参方)各10mL，调节pH= 3.5，分别加入实施例1 方法制备的MMNPs lOOmg，120mg，150mg，170mg，200mg，揽摔lOmin，用外加磁场将MMNPs与上 清液分离，倾出上层清液，下层沉淀用9mL CH2Ch:Me2C0(2:1，v/v)，搅拌解吸附lOmin，在外 加磁场作用下分层，收集上层清液，自然挥干后用300yL无水甲醇复溶，过0.22mi滤膜，取滤 液制得样品溶液，采用实施例2方法高效液相色谱仪检测(柱温:25°C，乙腈-甲醇-0.1%甲 酸水（20 : 20 : 60，v/v/v)为流动相，结果表明（见图1中b)当待测样用量为1 OmL，颗粒用量 150mg时，已可使黄曲霉毒素Bi吸附完全。
[0062] 3、磁性纳米颗粒吸附时间：取生脉饮(党参方)各10mL，调节pH = 3.5,各加入150mg 实施例1方法制备的MMNPs，分别搅拌5min，8min，lOmin，12min，15min，用外加磁场将MMNPs 与上清液分离，倾出上层清液，下层沉淀用9mL CH2CI2: Me2C0(2:1，v/v)，搅拌解吸附1 Omin， 在外加磁场作用下分层，收集上层清液，自然挥干后用300此无水甲醇复溶，过0.22wii滤膜， 制得样品溶液，采用实施例2方法高效液相色谱仪检测(柱温:25°C，乙腈-甲醇-0.1%甲酸 水(20:20:60，v/v/v)为流动相），结果表明（见图1中c)吸附时间为1 Omin较优。
[0063] 4、洗脱液体积:取生脉饮(党参方)各1 OmL，调节pH = 3 ? 5，各加入150mg实施例1方 法制备的丽NPs，搅拌lOmin，用外加磁场将丽NPs与上清液分离，倾出上清液，沉淀分别用 3mL、6mL、9mL、12mL的CH2CI2:Me2⑶(2:1，v/v)，搅拌解吸附lOmin，在外加磁场作用下分层， 收集上层清液，自然挥干后用300此无水甲醇复溶，过0.22wii滤膜，取滤液，制得样品溶液， 采用实施例2方法高效液相色谱仪检测(柱温:25°C，乙腈-甲醇-0.1 %甲酸水(20:20:60，v/ v/v)为流动相），结果表明（见图1中d)洗脱液体积为9mL较优。
[0064] 5、解吸附时间：取生脉饮(党参方)各1 OmL，调节pH = 3 ? 5，各加入150mg实施例1方 法制备的MMNPs，搅拌lOmin，用外加磁场将MMNPs与上清液分离，倾出上层清液，下层沉淀用 9mL的CH2CI2:Me2C0(2:1，v/v)，搅拌解吸附2min，4min，6min，8min，lOmin，在外加磁场作用 下分层，收集上层清液，自然挥干后用300此无水甲醇复溶，过0.22wii滤膜，取滤液，制得样 品溶液，采用实施例2方法高效液相色谱仪检测(柱温:25°C，乙腈-甲醇-0.1%甲酸水(20: 20:60，v/v/v)为流动相），结果表明（见图1中e)解吸附时间为8min较优。
[0065] 实施例4中药中黄曲霉素出的含量测定
[0066](一)色谱条件与系统适应性试验 [0067] (1)仪器与试药同实施例2。
[0068](二)色谱条件的选择
[0069] 通过对仪器、流动相、检测波长、柱温等色谱条件进行优化考察的基础上，获得了 能适用于黄曲霉素也含量测定的色谱条件：
[0070] 色谱柱:Agilent SB_Ci8柱（4.6mmX250mm，5iim);
[0071]流动相:A为乙腈，B为质量浓度0.1 %甲酸水溶液，C为无水甲醇，按乙腈-甲醇_ 0 ? 1 %甲酸水(20:20:60，v/v/v)进行等度洗脱；
[0072] 流速：1 .OmL/min;
[0073] 柱温：25。(：；
[0074]检测器:荧光检测器；
[0075] 检测波长:激发波长:360nm，发射波长:440nm;
[0076]进样量：20yL。
[0077](三)标准品溶液的制备：
[0078]精密称取黄曲霉素B1标准品适量，用甲醇配制成浓度为10ng/mL标准品溶液，高效 液相色谱图见图2。
[0079](四）供试品溶液的制备：
[0080]精密量取生脉饮(党参方）10mL，均匀加入150mg实施例1方法制备的丽NPs，搅拌 lOmin，用外加磁场将MMNPs与上清液分离，倾出上层清液，下层沉淀用9mL CH2Cl2:Me2CO(2: l，v/V)洗脱，搅拌解吸8min，在磁场作用下分层，收集洗脱液，挥干，残渣用300此甲醇复溶， 过0.22mi滤膜，制得供试品溶液，进液相检测的色谱图如图3。
[00811 (五)标准曲线的绘制
[0082] 分别精密吸取标准品溶液lyL、2yL、5yL、1 OyL、20yL注入高效液相色谱仪，测得峰 面积。以进样量(X，ng/mL)为横坐标，峰面积(Y，mAU)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回 归，得到回归方程见表1。
[0083] 表1黄曲霉素Bi标准曲线
[0085](六)精密度试验
[0086]在上述色谱条件下，精密吸取标准品溶液同一天内重复进样6次。结果计算黄曲霉 素仏峰面积的RSD为1.2%。在上述色谱条件下，精密吸取标准品溶液，连续3天每天进样1 次。结果计算黄曲霉素也峰面积的RSD为1.2%。以上结果表明仪器精密度良好。
[0087](七)稳定性试验
[0088] 精密吸取同一供试品溶液，分别于2、4、8、16、2处测定峰面积，结果在测定的24小 时内，计算黄曲霉素也峰面积RSD值为1.1 %。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0089](八)重复性试验
[0090] 取同一生脉饮(党参方)样品6份，照步骤（四）供试品溶液的方法制备，测定结果计 算黄曲霉素 Bi峰面积的RSD为1.2%，表明样品的重复性良好。
[0091] (九）回收率试验
[0092] 采用加样回收实验，取同一批生脉饮(党参方)样品6份，分别加入等量的黄曲霉素 Bi标准品溶液，按步骤（四）供试品溶液的方法制备，测定，计算回收率，加样回收率为97.67 ± 2.1 %，表明该方法准确性良好。
[0093](十)样品含量测定
[0094]对来源于5个厂家的生脉饮(党参方)的样品进行黄曲霉素也测定，结果见表2。5个 厂家生脉饮(党参方)的色谱图见图6。
[0095]表2不同企业生脉饮(党参方)黄曲霉素出含量测定样品测定结果(ng/mL)
[0097]注：表示峰面积低于定量限。
【主权项】
1. 一种中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述方法为:将待测中药溶液调 节pH值至2~5,加入磁性纳米颗粒，搅拌混匀，混合液在外加磁场作用下分层，除去上层清 液，下层沉淀加入体积比2:1的二氯甲烷和丙酮混合液，搅拌解吸附，在外加磁场作用下分 层，收集上层清液，自然挥干后用无水甲醇复溶，过0.22μπι滤膜，滤液采用高效液相色谱进 行黄曲霉素也测定;所述磁性纳米颗粒为2-氨基-5-巯基-1，3,4-噻二唑3-三甲基硅烷-1-丙硫醇修饰四氧化三铁磁性纳米颗粒。2. 如权利要求1所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述磁性纳米颗粒 加入量以待测中药溶液体积计为10_20g/L。3. 如权利要求1所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述二氯甲烷和丙 酮混合液与待测中药溶液体积比为0.3-1.2:1。4. 如权利要求1所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述搅拌混匀时间 为5~15min，搅拌解吸附时间为2~lOmin。5. 如权利要求1所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述外加磁场是指 以磁铁作为外加磁场源。6. 如权利要求1所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述高效液相色谱 检测条件为:色谱柱:C18柱，4.6mm X 250mm，<5μπι;流动相：乙腈、甲醇、体积浓度0.1 %甲酸 水溶液，体积比10-25:10-25:50-80;流速:0.8-1.2mL/min;柱温:20-30 °C ;荧光检测器。7. 如权利要求6所述中药中黄曲霉素 Br#量测定的方法，其特征在于所述C18柱所用碳 十八烷基硅烷键合硅胶粒径为5μπι或3.5μπι。8. 如权利要求6所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述流动相：乙腈、 甲醇、体积浓度〇. 1 %甲酸水溶液，体积比20:20:60。9. 如权利要求5所述中药中黄曲霉素出含量测定的方法，其特征在于所述荧光检测器激 发波长：360nm，发射波长:440nm〇10. 如权利要求1所述中药中黄曲霉素 Br#量测定的方法，其特征在于所述磁性纳米颗 粒按如下方法制备： (1) 将FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20与去离子水混合，在氮气保护的条件下85°C水浴加热 并搅拌30min，缓慢注入质量浓度25-28 %的氨水，加入氨水结束后，继续加热反应30min，离 心，取沉淀用去离子水洗涤2次，再用0.02mol/L氯化钠水溶液洗涤1次，沉淀于40~60°C下 干燥，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒;所述FeCl 3 · 6H20和FeCl2 · 4H20质量比为2~3:1，所 述去离子水体积用量以FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20总质量计为12~13mL/g，所述氨水体积 用量以FeCl3 · 6H20和FeCh · 4H20总质量计为1.4~1.8mL/g; (2) 将步骤（1)四氧化三铁磁性纳米颗粒用去离子水配制成40g/L的储备液，将储备液 在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀加入质量浓度10 % 3-三甲基硅烷-1-丙硫 醇水溶液，搅拌均匀，再加入甘油，在氮气保护下于90°C水浴中加热并剧烈搅拌2h，冷却至 室温后，在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀依次用去离子水洗涤3次，无水甲 醇洗涤3次，去离子水洗涤5次，沉淀颗粒于40~60°C下干燥，得到3-三甲基硅烷-1-丙硫醇 磁性纳米颗粒修饰物;所述3-三甲基硅烷-1-丙硫醇水溶液与储备液体积比为4~5:1，所述 甘油与储备液体积比为3~4:1; (3) 将步骤（2)3-三甲基硅烷-1-丙硫醇磁性纳米颗粒修饰物用去离子水配制成40g/L 储备液，用甲醇洗涤2次，加入质量浓度1 % 2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑水溶液，在超声波 功率为600W的条件下超声2h，得到颗粒沉淀用去离子水洗涤3次，再用无水甲醇洗涤2次，于 40~60°C下干燥2h，即得到2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑3-三甲基硅烷-1-丙硫醇磁性纳 米颗粒修饰物，即为磁性纳米颗粒;所述2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑水溶液与储备液体 积比为5~8:1。
【文档编号】G01N30/02GK106053662SQ201610528482
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】楚楚, 李清, 覃丽霞, 魏蒙蒙, 颜继忠
【申请人】浙江工业大学