烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法
【专利摘要】一种烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将烟草中的烟碱提取出来后进行液体进样，采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪（GC?IRMS）分析烟草中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，氢稳定同位素比值（δD）和氮稳定同位素比值δ15N，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C、δD和δ15N测定值，校准计算烟草中烟碱的δ12C、δD和δ15N值。本发明利用GC?IRMS技术，实现了烟草中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值的快速、准确测定，为烟草制品的溯源提供了技术方法。
【专利说明】
烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于稳定同位素分析技术领域，具体涉及一种烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同 位素比值的测定方法。
【背景技术】
[0002] 烟叶是我国卷烟生产的基础，烟叶内在品质的好坏直接影响卷烟产品的质量。受 产地环境，如经炜度、海拔、温湿度、降水量、土壤类型等因素的影响，不同种植区烟叶品质 差异很大，风格特征迥异。在卷烟叶组配方中充分利用各地烟叶的吸味特征，突出卷烟品牌 风格特征和风味品质，对于做大、做专、做强卷烟产品具有重要意义。但是，迄今为止，很难 做到对各地烟叶的吸味特征进行定量分析和描述，卷烟生产企业也很难对烟叶供应商提供 的烟叶原料进行产地判定和识别。因此，以次充好、以劣充优和混淆产地的烟叶时有出现， 造成卷烟企业产品质量的不稳定和直接的经济损失。因此，对烟叶产地的判别研究具有重 要意义，有必要研究一种能够对烟叶产地进行判别的方法。
[0003] 当前，国内外对烟叶产地判别的研究相对较少，主要有感官评价法，红外光谱法， 特征化学成分分析法等。其中，感官评价法主观性较强，红外光谱法和特征化学成分分析法 的研究相对较多，但其严谨性和准确性依然存在不足。在食品产地溯源的方法中，稳定同位 素技术是一项相对高效的分析手段。由于生物体内的同位素组成受气候，环境和生物代谢 类型等因素的影响，不同种类及不同地域来源的食品原料中同位素自然丰度存在差异，利 用这种差异可以区分不同种类的产品及其可能的来源地区。
[0004] 稳定同位素技术在烟草及烟叶原产地判别领域的研究相对较少。Jamin等利用稳 定同位素技术，成功对来自南美洲、欧洲、南亚地区及非洲的烟叶进行分区CeD 及^iro/3. 1997，洲〔5」： 589-599.)，但是，这种方法需要复杂的烟碱提取及提纯过程，且 仅对烟草中烟碱的碳和氮两种元素进行同位素比值测定。本专利提供了一种利用GC-IRMS 方法快速、高效测定烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的方法，为烟草及烟草制品的溯 源提供了技术支持和科学依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基于上述技术不足，建立了一种烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位 素比值的测定方法。本方法无需复杂的烟碱提取、纯化等样品前处理过程，且一次样品前处 理过程即可同时测定烟草中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值，具有操作简便、效率高、重复 性好的优点。
[0006] 以下对本方法进行详细描述。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位 素比值的测定方法，该方法采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将烟草中的烟碱提取出来后 进行液体进样，采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开， 利用气相色谱一同位素质谱仪(GC-IRMS)分析烟草中烟碱的碳稳定同位素比值S 13C，氢稳定 同位素比值(SD)和氮稳定同位素比值S15N，再根据烟碱同位素标准物质中的S12C、SD和S 15N 测定值，校准计算烟草中烟碱的s12c、sd和s15n值。
[0008]更具体而言，本发明方法包括以下步骤： (1)采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将烟草中的烟碱提取出来，具体方式为称取约1 g烟草样品，置于100 mL三角瓶中，分别加入20 mL氢氧化钠溶液(5 mol/L)和20 mL正己烷， 置于振荡器上振荡萃取60 min。静止后取上层有机层进行GC-IRMS分析。
[0009] (2)采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分 开； (3) 用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成C02,将烟碱中的N转化成N2,用同位素质谱仪 (IRMS)测定烟碱产生C0 2中的S13C和N2中的S15N值； (4) 将在线燃烧装置切换为热转化模式，用同位素质谱仪(IRMS)测定烟碱产生H2中的S D值(SPS 2H)。
[0010] (5)通过标准物质已标定的S13C，SD和S15N值，得到烟草中烟碱的S 13C，SD和S15N值。
[0011]所述方法的仪器分析条件为： (1) 气相色谱条件： 色谱柱：中等极性毛细管色谱柱（30 m X 0.32 mm X 0.25 mi);检测器温度：250 °(：;进样口温度:250 °(：;载气：氮气(纯度彡99.999%)，恒流流速:2.〇11117111111 ;进样量：111 L，分流比：10:1 (测定SD和S15N时采用不分流模式）；升温程序:初始温度80 °C，保持1 min， 以15 °C/min的速率至260 °C，保持6 min. (2) 在线燃烧装置条件： 测定S13c或S15N:使用氧化燃烧管，设置温度为1000°C。管内填装镍/氧化镍（Ni/NiO)， 氧化镍作弱氧化剂，将样品中的C氧化成C02，将样品中N氧化成Nx0y，同时，氧化镍转化为镍 单质，充入〇 2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将Nx0y转化为N2，样品最终反应 生成C〇2和N2。氧化燃烧管使用前应注入〇2 -个小时用于氧化管的再生。
[0012]测定s15N，需使用液氮冷讲冻结除去c〇2高凝固点气体，防止c〇 2进入离子源打出碎 片离子[C0+ ] m/z 28，29对[N2+ ]m/z 28，29造成干扰。
[0013] 测定卯:使用高温裂解管，设置温度为1450°C。高温裂解管使用前应注入CH4-个 小时用于反应管涂炭。
[0014] (3)质谱条件为： 离子源真空为1.8x 10-6mBar,电压3.04 kV，电流1.50 mA。
[0015] 本发明的方法无需复杂的烟碱提取、纯化等样品前处理过程，且一次样品前处理过程 即可同时测定烟草中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值，具有操作简便、效率高、重复性好的 优点，为烟草及烟草制品的溯源提供了技术支持和科学依据。
【附图说明】
[0016] 图1为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中S13c的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率 (Ratio)，下图纵坐标是强度（Intensity [mV]); 图2为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中S15N的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率 (Ratio)，下图纵坐标是强度（Intensity [mV]); 图3为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中SD的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率(Ratio)， 下图纵坐标是强度（Intensity [mV])。
【具体实施方式】
[0017]本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。
[0018] 实施例1: 1、仪器及试剂 同位素质谱仪(AS1310自动进样器，Trace GC Ultra气相色谱仪，GC IsoLink燃烧与热 转化装置(燃烧装置用来测定烟碱中的碳和氮，热转化装置用来测定烟碱中的氢），Delta V Advantage稳定同位素比质谱仪。美国Thermo Fisher公司）；AE163电子天平（感量:0? 0001 区，瑞士161:1:161'公司）；高纯氦气(99.999%，载气）；烟碱标准物质来自于美国印第安纳大学 同位素实验室，#2 (S13C =7 ? 72 ± 0 ? 02%。，S15N=-5 ? 94 ± 0 ? 15%。），#3( S13C =-30 ? 05 ± 0 ? 02%〇， S15N=-33.62±0.18%〇)，#4(S13C =-2.06±0.02%〇，S15N=-15.49±0.13%〇)，#5(S13C =-29.63 ±0 ? 01%。，S15N=-6 ? 03 ±0 ? 04%。，SD=-161 ? 30 ± 1 ? 7%。）；正己烷（色谱纯，美国TEDIA公司）； 氢氧化钠(分析纯，国药集团）;超纯水(Milli-Q Integral超纯水系统制），Y-8调速振荡器 (常州国华电器有限公司）。
[0019] 2、样品前处理 称取约1 g烟草样品，置于100 mL三角瓶中，分别加入20 mL氢氧化钠溶液(5 mol/L)和 20 mL正己烷，置于振荡器上振荡萃取60 min。静止后取上层有机层进行GC-IRMS分析。
[0020] 3、仪器分析条件 (1) 气相色谱条件： 色谱柱：中等极性毛细管色谱柱（30 m X 0.32 mm X 0.25 mi);检测器温度：250 °(：;进样口温度:250 °(：;载气：氮气(纯度彡99.999%)，恒流流速:2.〇11117111111 ;进样量：111 L，分流比：10:1 (测定SD和S15N时采用不分流模式）；升温程序:初始温度80 °C，保持1 min， 以15 °C/min的速率至260 °C，保持6 min. (2) 燃烧转化装置条件： 测定S13c或S15N:使用氧化燃烧管，设置温度为1000°C。管内填装镍/氧化镍（Ni/Ni0)， 氧化镍作弱氧化剂，将样品中的C氧化成C02，将样品中N氧化成Nx0y，同时，氧化镍转化为镍 单质，充入〇 2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将Nx0y转化为N2，样品最终反应 生成C〇2和N2。氧化燃烧管使用前应注入〇2 -个小时用于氧化管的再生。
[0021] 测定S15N，需使用液氮冷阱冻结除去C02高凝固点气体，防止C02进入离子源打出碎 片离子[C0+ ] m/z 28，29对[N2+ ]m/z 28，29造成干扰。
[0022] 测定SD:使用高温裂解管，设置温度为1450°C。高温裂解管使用前应注入CH4-个 小时用于反应管涂炭。
[0023] (3)质谱条件为： 离子源真空为1.8x 10-6mBar,电压3.04 kV，电流1.50 mA。
[0024] 4、精密度测定 将烟草样品稀释萃取后，通过本发明所述GC-IRMS技术重复测定烟草中烟碱的S13C，SD 和S15N值(n = 6)，测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为0.83%，0.42%和0.93%(表1)，测定 精度均能达到要求。
[0025] 表1.烟草中烟碱C、H、N三种元素稳定同位素比值的精密度测定
根据上述气相色谱测定方法，选择一种烟草样品A，测得其中烟碱的S13C，SD和S15N分别 为-31.4U-211.80 和-7.51。
[0026] 实施例2 根据实施例1所述的测定方法，选择一种烟草样品B，测得其中烟碱的S13C，SD和S15N分 别为-31.17、-211.44和-6.83〇
[0027] 实施例3 根据实施例1所述的测定方法，选择一种烟草样品C，测得其中烟碱的S13C，SD和s15N分 别为-32 ? 97、-229 ? 05 和-5 ? 51 〇
【主权项】
1. 一种烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于:采用正己烷/氢 氧化钠水溶液体系将烟草中的烟碱提取出来后进行液体进样，采用配有毛细管色谱柱的气 相色谱仪将烟碱和萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱一同位素质谱仪GC-IRMS分析 烟草中烟碱的碳稳定同位素比值δ 13(：，氢稳定同位素比值δ?和氮稳定同位素比值δ15Ν，再根 据烟碱同位素标准物质中的S 12C、SD和δ15Ν测定值，校准计算烟草中烟碱的δ12(：、δ?和δ 15Ν值。2. 根据权利要求1所述的烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在 于:具体步骤如下： (1) 采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将烟草中的烟碱提取出来； (2) 采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱和萃取液中的其他杂质分开； (3) 用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成C02,将烟碱中的Ν转化成Ν2,用同位素质谱仪 (IRMS)测定烟碱产生C0 2中的δ13(：和Ν2中的δ15Ν值； (4) 将在线燃烧装置切换为热转化模式，用同位素质谱仪IRMS测定烟碱产生Η2中的δ? 值； (5) 通过标准物质已标定的δ13(：，δ?和δ15Ν值，得到烟草中烟碱的δ13(：，δ?和δ 15Ν值。3. 根据权利要求2所述的烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在 于:步骤(2)中的气相色谱条件为： 色谱柱：中等极性毛细管色谱柱，规格30 m X 0.32 mm X 0.25 μπι;检测器温度:250 °C;进样口温度:250 °C;载气:氮气，恒流流速:2.0 mL/min;进样量:1 yL，分流比：10:1，测 定δ?和δ15Ν时采用不分流模式;升温程序:初始温度80 °C，保持1 min，以15 °C/min的速率 至260 °C，保持6 min。4. 根据权利要求2所述的烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在 于:步骤(3)、（4)所用的在线燃烧装置条件为： 测定S13C或δ15Ν:使用氧化燃烧管，设置温度为1000°C，管内填装镍/氧化镍（Ni/NiO)， 氧化镍作弱氧化剂，将样品中的C氧化成C02，将样品中N氧化成Nx0y，同时，氧化镍转化为镍 单质，充入〇 2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将Nx0y转化为N2，样品最终反应 生成C〇2和N2，氧化燃烧管使用前应注入〇2 -个小时用于氧化管的再生； 测定S15N，需使用液氮冷阱冻结除去C02高凝固点气体，防止C02进入离子源打出碎片离 子[C0+ ] m/z 28，29对[N2+ ]m/z 28，29造成干扰； 测定SD:使用高温裂解管，设置温度为1450Γ，高温裂解管使用前应注入CH4-个小时用 于反应管涂炭。5. 根据权利要求2所述的烟草中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在 于:步骤（1)中的提取方式具体为:称取约1 g烟草样品，置于100 mL三角瓶中，分别加入20 mL浓度为5 mol/L的氢氧化钠溶液和20 mL正己烧，置于振荡器上振荡萃取60 min;静止后 取上层有机层进行GC-IRMS分析。
【文档编号】G01N30/02GK106053659SQ201610518583
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】韩书磊, 陈欢, 马潇, 付亚宁, 刘彤, 侯宏卫, 胡清源
【申请人】国家烟草质量监督检验中心