C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法
【专利摘要】本发明涉及一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法，该方法包括以下步骤：(1)样品溶液的配制：精确称取天然丰度脂肪酸标准品溶于有机溶剂中配制成浓度为0.001～10mg/ml的脂肪酸标准溶液；相同的方法配制浓度为0.001～20mg/mL的13C标记脂肪酸溶液；(2)检测：利用气相色谱-质谱联用仪分别测试测定脂肪酸标准溶液和13C标记脂肪酸溶液，选择谱图中包含标记位点的碎片离子进行同位素丰度值的计算，利用同位素峰簇的比值计算出标记试剂的同位素丰度值。与现有技术相比，本发明具有测量准确、快速、高效等优点。
【专利说明】测定13c标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及同位素丰度检测方法，尤其是涉及一种针对13c标记脂肪酸类试剂的 同位素丰度测定方法。
【背景技术】
[0002] 稳定同位素标记有机化合物是一类重要的试剂，由于其具备特有的示踪特性，广 泛应用于生物、医学、农业和环境领域。近年来，稳定同位素13co2呼气试验由于其非创伤性， 无放射性、稳定性佳及检测灵敏度高等特性，越来越广泛地应用于临床与科研。 13c标记的月旨 肪酸呼气试验，可通过人体对脂肪酸代谢出的13co2用于预测或检查心脏疾病或心肌不良功 能，也可用于测定胃的排空速率，以及诊断脂肪吸收不良等疾病。在医学领域有大量的关于 13c-脂肪酸的代谢研究，其中13c标记试剂的同位素丰度和化学纯度则直接影响了其代谢出 13co2测定结果的准确性。因此，在稳定同位素13c标记的医用诊断试剂的研制中，其同位素 丰度和化学纯度是两个最为重要的指标，其中同位素丰度的测定是检测方法的难点所在。 目前，有关稳定同位素标记13c-脂肪酸丰度测定的文献鲜有报道。传统的13c标记化合物 同位素丰度的测定方法是将样本中的C原子通过转化反应生成仪器能够检测的气态co2形 态，使用气体同位素质谱仪测定气态co2的丰度值，有文献通过上述方法成功测定了13c-尿 素的同位素丰度。有报道使用电喷雾质谱法测定了13c部分标记的美沙西汀-甲氧基-13c 的同位素丰度，但上述方法均不适用于13c-脂肪酸同位素丰度的测定。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种准确、快速、高 效的测定 13c标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法。
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种测定13c标记直链脂肪酸同位 素丰度和化学纯度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
[0005] (1)样品溶液的配制
[0006] 精确称取天然丰度脂肪酸标准品荣誉有机溶剂中配制成浓度为0. 001?10mg/ml 的脂肪酸标准溶液；相同的方法配制浓度为〇. 001?20mg/mL的13C标记脂肪酸溶液； [0007] (2)检测
[0008] 利用气相色谱-质谱联用仪分别测试测定脂肪酸标准溶液和13C标记脂肪酸溶液， 选择谱图中包含标记位点的碎片离子进行同位素丰度值的计算，利用同位素峰簇的比值计 算出标记试剂的同位素丰度值。
[0009] 步骤⑴用于配制溶液的有机溶剂为甲醇、丙酮或正己烷。
[0010] 所述的气相色谱-质谱联用仪的进样方式为顶空进样或液体直接进样，液体直接 进样量为0.luL?luL。
[0011] 所述的气相色谱-质谱联用仪中：
[0012] 气相色谱条件如下：色谱柱为HP-5、HP-1或DB-1MS毛细管柱；载气为高纯氦，流 速为0. 1?2.OmL/min;进样量0. 1?l.OilL，分流比为（5?100) : 1;进样口温度为 120?280°C;柱升温程序从60?80°C以25?40°C/min升至200?230°C;
[0013] 质谱分析条件为：电子轰击离子源（EI);扫描范围（m/z)为10?500;离子源温度 为150?280°C，四级杆温度为150?300°C，接口温度为200?280°C;电离能量为50? 100eV〇
[0014] 所述的13C标记直链脂肪酸的标记位点为羧基位或a位含有yH的短链或中链脂 肪酸，13C标记个数可为一个或多个位点。
[0015] 所述的气相色谱-质谱联用仪测定的天然丰度脂肪酸的质谱图中，用于计算同位 素丰度值的碎片离子包括：质荷比（m/z)为60、73、87或115的碎片离子，每种离子同位素 峰簇分布分别为m/z60?62、73?75、87?89或115?117;
[0016] 在13C标记脂肪酸的质谱图对应m/z为61、74、88或116的碎片离子，同位素峰簇 分布分别为m/z61?63、74?76、88?90或116?118。
[0017] 所述的天然丰度脂肪酸和13c标记脂肪酸的碎片离子均具有各自独立的天然同位 素分布比值，在待测13c标记脂肪酸的实测谱图中同时存在标记和天然丰度的两类碎片离 子，实测谱图的丰度值为两类碎片离子的叠加，实际计算时选取一组碎片离子，定义标记的 碎片离子的摩尔分数为\，天然丰度的碎片离子的摩尔分数为X。，定义Ac/和A/分别为X。 和Xi在m/z=i时的峰强，
[0018]A〇60 ：A〇61 ：A〇62 =A,61 ：A/2 ：A/3 =a：b：c(1)
[0019]其中，设a:b:c为未标记的天然丰度脂肪酸实测质谱图上m/z分别为60,61 和62处的峰强比值，归一化，a+b+c= 1 ;
[0020] 定义AJ为13C标记样品实测质谱图在m/z=i时的峰强，
[0021] Afflix60 = X0 ?A060 = a ?X0 (2)
[0022] Amix61 = X0 ?C+Xi ? A/1 =b?X0+a ? X! (3)
[0023]Amix62 = X〇 ?Ao^+Xi ? A/2 =c?X〇+b ? X: (4)
[0024] Amix63 = X: ?Ai63 = c ?X: (5)
[0025] 其中Amix6°?Amix63和a、b、c均为实测值，联立上述方程组，即可求得\和\，其中 &即为脂肪酸-i-13c的同位素丰度分子百分比；稳定同位素13C标记有机化合物的同位素 标记丰度为原子百分比13Catom% =E(n*XnV(n*Exn)，利用该公式及获得数据计算得 到同位素丰度。
[0026] 通过气相色谱-质谱联用仪离子流图的峰面积测得试剂的化学纯度，实现同位素 丰度值和化学纯度的同时测定。
[0027] 同位素丰度的具体通过以下方法计算：
[0028]130)2呼气试验中使用 13C_脂肪酸的同位素标记位点多为羧基位，各脂肪酸在EI离 子源作用下的碎片离子情况如表1所示。具有Y氢的脂肪酸均会发生麦氏重排（如下式 所示），氢重排形成质荷比为60的奇电子碎片离子。
[0029]
【权利要求】
1. 一种测定13c标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法，其特征在于，该方法包 括以下步骤： (1) 样品溶液的配制： 精确称取天然丰度脂肪酸标准品溶于有机溶剂中配制成浓度为0. 001?l〇mg/ml的脂 肪酸标准溶液；相同的方法配制浓度为〇. 001?20mg/mL的13C标记脂肪酸溶液； (2) 检测 利用气相色谱-质谱联用仪分别测试测定脂肪酸标准溶液和13C标记脂肪酸溶液，选择 谱图中包含标记位点的碎片离子进行同位素丰度值的计算，利用同位素峰簇的比值计算出 标记试剂的同位素丰度值。
2. 根据权利要求1所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，步骤（1)用于配制溶液的有机溶剂为甲醇、丙酮或正己烷。
3. 根据权利要求1所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，所述的气相色谱-质谱联用仪的进样方式为顶空进样或液体直接进样，液体 直接进样量为〇. luL?luL。
4. 根据权利要求1所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，所述的气相色谱-质谱联用仪中： 气相色谱条件如下：色谱柱为HP-5、HP-1或DB-1 MS毛细管柱；载气为高纯氦，流速为 0.1?2.0mL/min;进样量0.1?l.OiiL，分流比为（5?100) : 1;进样口温度为120? 280°C ;柱升温程序从60?80°C以25?40°C /min升至200?230°C ; 质谱分析条件为：电子轰击离子源（EI);扫描范围（m/z)为10?500 ;离子源温度 为150?280°C，四级杆温度为150?300°C，接口温度为200?280°C ;电离能量为50? 100eV〇
5. 根据权利要求1所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，所述的13C标记直链脂肪酸的标记位点为羧基位或a位含有的短链或中 链脂肪酸，13c标记个数可为一个或多个位点。
6. 根据权利要求1所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，所述的气相色谱-质谱联用仪测定的天然丰度脂肪酸的质谱图中，用于计算 同位素丰度值的碎片离子包括：质荷比（m/z)为60、73、87或115的碎片离子，每种离子同 位素峰簇分布分别为m/z 60?62、73?75、87?89或115?117 ; 在13C标记脂肪酸的质谱图对应m/z为61、74、88或116的碎片离子，同位素峰簇分布 分别为m/z 61?63、74?76、88?90或116?118。
7. 根据权利要求6所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，所述的天然丰度脂肪酸和13C标记脂肪酸的碎片离子均具有各自独立的天然 同位素分布比值，在待测13C标记脂肪酸的实测谱图中同时存在标记和天然丰度的两类碎 片离子，实测谱图的丰度值为两类碎片离子的叠加，实际计算时选取一组碎片离子，定义标 记的碎片离子的摩尔分数为Xi，天然丰度的碎片离子的摩尔分数为X。，定义Ac/和A/分别为 X。和Xi在m/z = i时的峰强， A〇60 ：A〇61 ：A〇62 = Ai61 -.A,62 ：A^ = a ：b ：c (1) 其中，设a :b:c为未标记的天然丰度脂肪酸实测质谱图上m/z分别为60,61和62处的 峰强比值，归一化，a+b+c = 1 ; 定义AJ为13C标记样品实测质谱图在m/z = i时的峰强， Amix6〇 = X0 ? A060 = a ? X0 (2) Amix61 = X0 ? ? A， 1 = b ? X 0+a ? & (3) Amix62 = X〇 ? C+X! ? V2 = c ? X〇+b ? & (4) Amix63 = ? A/3 = c ? X: (5) 其中Amix6°?Amix63和a、b、c均为实测值，联立上述方程组，即可求得\和\，其中&即 为脂肪酸-i-13c的同位素丰度分子百分比；稳定同位素13C标记有机化合物的同位素标记 丰度为原子百分比13C atom% = E (n*xnV(n*Exn)，利用该公式及获得数据计算得到同 位素丰度。
8.根据权利要求1所述的一种测定13C标记直链脂肪酸同位素丰度和化学纯度的方法， 其特征在于，通过气相色谱-质谱联用仪离子流图的峰面积测得试剂的化学纯度，实现同 位素丰度值和化学纯度的同时测定。
【文档编号】G01N30/06GK104330515SQ201410663830
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】雷雯, 杜晓宁, 张维冰 申请人:上海化工研究院