一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法
【专利摘要】本发明提供了一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，该方法包括如下工艺步骤：（1）样品采集；（2）样品溶液的制备；（3）脱镁叶绿酸a含量测定；（4）芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量测定；（5）总黄酮含量测定；（6）确定鹅耳枥叶最佳采收期。本发明的优点：本发明的方法操作简单、快捷、明了，为测定欧洲鹅耳枥中的活性物质提供了方便，能有效确定欧洲鹅耳枥叶的最佳采收时期，为欧洲鹅耳枥活性物质研究提供了技术支持。
【专利说明】
一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，属植物栽培技术与天然药 物化学交叉领域。
【背景技术】
[0002] 欧洲鹳耳枥（Ca_rpi/3US Aeit/Jus)，桦木科落叶乔木。树形清秀、质地细腻、秋色叶 金黄，曾获得过英国皇家园艺学会奖杯，可用作行道树、庭院树、绿蓠及盆景，是重要的园林 绿化树种，在许多国家和地区得以广泛应用。
[0003] 目前，欧美国家对欧洲鹅耳枥的研究处于领先的水平，尤其是在系统分类、形态解 剖、地理分布研究等方面都已取得众多成果。而国内对欧洲鹅耳枥的研究较少，内容仅限于 其群落生态学、种质资源、起源与演化、栽培繁殖技术等方面，而对欧洲鹅耳枥的活性物质 含量研究尚未报道。本发明以探索欧洲鹅耳枥活性物质含量的季节性变化综合测定，以期 通过试验确定欧洲鹅耳枥活性物质含量最高的季节，对欧洲鹅耳枥叶的质量进行评价，确 定一种欧洲鹅耳枥叶的最佳采收季节的方法，为欧洲鹅耳枥生物活性物质研究提供技术支 持。
【发明内容】
[0004] 本发明是一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其目的是提供一种确定欧洲鹅耳 枥叶最佳采收期的方法，该方法利用高效液相色谱法测定了欧洲鹅耳枥从3月份到10月份 的脱镁叶绿酸a、芦丁、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量，并利用紫外-可见分光度法测定 了欧洲鹅耳枥叶中总黄酮的含量，确定出欧洲鹅耳枥叶的最佳采收季节，为欧洲鹅耳枥生 物活性物质研究提供技术支持。
[0005] 本发明的技术解决方案：一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，该方法包括如下 工艺步骤： (1) 样品米集； (2) 样品溶液的制备； (3) 脱镁叶绿酸a含量测定； (4) 芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量测定； (5) 总黄酮含量测定； (6) 确定鹳耳枥叶最佳采收期。
[0006] 本发明的优点:方法操作简单快捷，为测定欧洲鹅耳枥中的活性物质提供了方便， 能有效确定欧洲鹅耳枥叶的最佳采收时期，为欧洲鹅耳枥活性物质研究提供了技术支持。
【附图说明】
[0007] 附图1是脱镁叶绿酸a标准品HPLC图谱。
[0008] 附图2是总黄酮标准曲线图。
[0009] 附图3是芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素标准品HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0010] -种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，该方法包括如下工艺步骤： (1) 样品米集； (2) 样品溶液的制备； (3) 脱镁叶绿酸a含量测定； (4) 芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量测定； (5) 总黄酮含量测定； (6) 确定鹳耳枥叶最佳采收期。
[0011] 所述步骤⑴样品采集:在欧洲鹅耳枥种植4年后，从3月到10月份，每月中旬，于晴 朗无风、光照良好的上午，采集四年生欧洲鹅耳枥叶片5 g作为待测样品。
[0012] 所述步骤(2)中的样品溶液分A样品溶液和B样品溶液，制备方法分别如下： A样品溶液的制备:采集样品在40°C烘箱中烘干，经粉碎后过80目筛，取1 g样品，100 ml乙酸乙酯浸渍，置于25°C750 r/ min摇床上震荡1 h，加热回流2 h，过滤，滤液在50°C减 压下旋干，用1 ml甲醇溶解，摇匀，得A样品溶液，于-20°C保存，以备脱镁叶绿酸a含量测定； B样品溶液的制备:采集样品在40°C烘箱中烘干，经粉碎后过80目筛，取3 g样品，置于 圆底烧瓶中，加入100 ml石油醚，70°C回流1 h，过滤后弃去滤液，加入20 ml石油醚，振荡静 置分层，弃去石油醚溶解物得萃取后的固相，萃取4次，除去脂溶性杂质，保留剩余固体，加 入100 ml甲醇，70°C回流6 h，过滤至锥形瓶中，经超声处理(功率150 W;温度70°C;时间10 min)后;将滤液倒入清洗干净的圆底烧瓶中，减压回收提取液中的溶剂甲醇，得浸膏，使用 10 ml HPLC级甲醇稀释溶剂，摇匀，得B样品溶液，于-20°C保存备用，以备四种黄酮类成分 及总黄酮含量测定。
[0013] 所述步骤(3)脱镁叶绿酸a含量测定，由以下步骤组成： ① 确定高效液相色谱测试条件:操作波长是408 nm，Ci8色谱柱:250 mmX 4.6 mm，5 μ m;柱温:50°C ;流动相：由0.1%(V/V)甲酸的乙腈和0.1%(V/V)甲酸的水，二者梯度变化:0.1% (V/V)甲酸的乙腈分别为0分钟80%，5分钟90%，22分钟90%，22.1分钟80%(V/V);流速：0.6 ml/min，注入量:10 μL，洗脱时间：35 min; ② 称取在100 °C减压干燥至恒重的脱镁叶绿酸a对照品0.2 mg于1 ml试管中，加少许 甲醇置40°C水浴中加热溶解，冷却，用甲醇定容至1 ml刻度，即为0.2 mg/ml的脱镁叶绿酸 a对照品溶液，摇匀； ③吸取脱镁叶绿酸a对照品溶液0.05, 0.1，0.2，0.4, 0.8 μL于1 ml试管中，分别 加1 ml甲醇摇匀，即浓度分别为0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6 μg/ml;A样品溶液与脱镁叶绿 酸a对照品各浓度溶液分别取10 μL进样，重复进样3次，在最大吸收波长408 nm处测定样 品峰面积，以脱镁叶绿酸a对照品各点化合物峰面积均值为纵坐标，各点化合物溶液质量浓 度为横坐标，绘制标准曲线，求算回归方程，再根据A样品溶液测定的峰面积计算出在欧洲 鹅耳枥叶片中相应的含量。
[0014] 所述步骤(4)芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量测定，由以下步骤组成： ①确定高效液相色谱测试条件:操作波长是368 nm;Ci8色谱柱：250 mmX 4.6 mm，5 μ m;柱温:40°C ;流动相：乙腈和0.1%(V/V)甲酸的水，二者梯度变化：乙腈分别为0分钟10%， 15分钟40%，40分钟60%，41分钟60%(V/V)，48分钟60%，流速是0.8 ml / min，注入量是10 μ 1，洗脱时间:48分钟;通过标准溶液的峰面积测量值记录定量值； ②分别称取9.7 mg芦丁，9.6 mg槲皮素，0.5 mg山奈酸，异鼠李素 0.4 mg于50 ml试管 中，加入40 ml甲醇进行溶解，摇匀，配成标准对照品溶液，于-20°C保存，以备四种黄酮类成 分的含量测定； 所述步骤（5)总黄酮含量测定：精密称取在120°C减压干燥至恒质量的芦丁对照品30 mg于100 ml容量瓶中，加 80% (V/V)的乙醇置水浴中加热溶解，冷却，用80% (V/V)的乙 醇定容至刻度，即为0.3 mg/ml的芦丁对照品溶液，摇匀。准确吸取该芦丁对照品溶液0， 0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6, 3.2 ml分别置于25 ml容量瓶中，分别加 30% (V/V)乙醇溶液 至 5 ml;加 5% (m/V) NaN02 溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min;再加 10% (m/V) A1(N03)3 溶液 0.3 ml，摇匀，放置6 min;加 4% (m/V) NaOH溶液4 ml，用蒸馏水定容至10 ml，摇匀，浓度 分别为〇，3, 6，12，24，48，96 μg/ml放置15-20 min。各取200 μL至酶标仪板后，在最 大吸收波长510 nm处测定吸光度，以吸光度(Α)为纵坐标、芦丁标准品溶液质量浓度(C)为 横坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程。然后根据B样品溶液的吸光度和芦丁对照品的标 准曲线，测定B样品溶液中总黄酮的含量，根据B样品溶液的质量与原样品质量的比例，通 过计算得到欧洲鹅耳枥叶中总黄酮的含量，完成一种欧洲鹅耳枥叶的质量检测方法。
[0015] 所述步骤(6)确定欧洲鹅耳枥叶最佳采收期：综合所测3-10月份的脱镁叶绿酸a、 总黄酮、芦丁、槲皮素、山奈酚和异鼠李素含量，评价欧洲鹅耳枥叶的质量，筛选活性物质含 量最高对应的季节，完成一种确定欧洲鹅耳枥叶最佳采收期的方法。
[0016] 本发明考虑到欧洲鹅耳枥叶中含有具有光动力特性的脱镁叶绿酸a化合物，利用 高效液相色谱法测定欧洲鹅耳枥脱镁叶绿酸a从3月份到10月份的含量;考虑到欧洲鹅耳枥 叶中含有多种黄酮类成分，主要以芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素为主，因此本发明以这四 种成分作为标准对照品，通过高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积， 利用外标法测定样品中芦丁、槲皮素、山奈酚和异鼠李素从3月份到10月份的含量;还考虑 到欧洲鹅耳枥中其他黄酮类成分，因此本发明利用紫外-可见分光光度法，采用芦丁作为标 准对照品，硝酸铝与黄酮类化合物形成配合物的显色原理进行测定，完成一种欧洲鹅耳枥 叶的质量检测方法，筛选出最佳采收期。
[0017] 根据所选月份的不同，测定不同月份欧洲鹅耳枥叶中脱镁叶绿酸a、四种黄酮类成 分及总黄酮的含量，具体如下表：
从上表中可以看出，4月份的脱镁叶绿酸a含量最高达0.564 mg/g，7月份采集的欧洲鹅 耳枥叶片中芦丁、槲皮素、山奈酚含量最高分别为19.05,19.05，0.077mg/g，5月份的异鼠李 素含量最高为0.89 mg/g, 6月份采集的欧洲鹳耳枥总黄酮含量最高为98.68 mg/g，由于欧 洲鹅耳枥叶内总黄酮除芦丁、槲皮素、山奈酚和异鼠李素外还含有其他黄酮类化合物，而6 月份采集的欧洲鹅耳枥叶总黄酮含量最高，且6月份欧洲鹅耳枥叶内脱镁叶绿酸a含量为 0.393 mg/g，相比最高含量0.564 mg/g差距不大，，欧洲鹅耳枥叶的活性物质含量主要集中 在7月份，因此，欧洲鹅耳枥叶最佳采收期为7月。
[0018]前述具体示例性实施方案的描述时为了说明和例证的目的，这些描述并非想将 本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化， 对示例性实施方案进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而 本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的 选择和改变，本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤： (1) 样品米集； (2) 样品溶液的制备； (3) 脱镁叶绿酸a含量测定； (4) 芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量测定； (5) 总黄酮含量测定； (6) 确定欧洲鹅耳枥叶最佳采收期。2. 根据权利要求1所述的一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于所述步骤 (1)样品采集:从3月到10月份，每月中旬，采集四年生欧洲鹅耳枥叶片5 g作为待测样品。3. 根据权利要求1所述的一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于所述步骤 (2 )样品溶液的制备;所述的样品溶液分A样品溶液和B样品溶液，各自的制备方法分述如 下： A样品溶液的制备：采集样品在40°C烘箱中烘干，经粉碎后过80目筛，取1 g样品，100 ml乙酸乙酯浸渍，置于25°C750 r/ min摇床上震荡1 h，加热回流2 h，过滤，滤液在50°C减 压下旋干，用1 ml甲醇溶解，摇匀，得A样品溶液于-20°C保存备用，以备脱镁叶绿酸a含量测 定； B样品溶液的制备:采集样品在40°C烘箱中烘干，经粉碎后过80目筛，取3 g样品，置于 圆底烧瓶中，加入100 ml石油醚，70°C回流1 h，过滤后弃去滤液，加入20 ml石油醚，振荡静 置分层，弃去石油醚溶解物得萃取后的固相，萃取4次，除去脂溶性杂质，保留剩余固体，加 入100 ml甲醇，70°C回流6 h，过滤至锥形瓶中，在功率150 W、温度70°C条件下超声处理时 间10 min，将滤液倒入清洗干净的圆底烧瓶中，减压回收提取液中的溶剂甲醇，得浸膏，使 用10 ml HPLC级甲醇稀释溶剂，摇匀，得B样品溶液，于-20°C保存，以备四种黄酮类成分及 总黄酮含量测定。4. 根据权利要求1所述的一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于所述步骤 (3)脱镁叶绿酸a含量测定，由以下步骤组成： ① 确定高效液相色谱测试条件:操作波长是408 nm，Ci8色谱柱:250 mmX4.6 mm，5 μπι; 柱温:50°C ;流动相：由含0.1%(V/V)甲酸的乙腈和含0.1%(V/V)甲酸的水组成，二者梯度变 化:含0.1%(V/V)甲酸的乙腈分别为0分钟80%，5分钟90%，22分钟90%，22.1分钟80%;流速： 0.6 ml/min，注入量:10 μL，洗脱时间：35 min; ② 称取在100 °C减压干燥至恒重的脱镁叶绿酸a对照品0.2 mg，放于1 ml试管中，加 甲醇置40°C水浴中加热溶解，冷却，用甲醇定容至1 ml刻度，即为0.2 mg/ml的脱镁叶绿酸 a对照品溶液，摇匀； ③ 吸取脱镁叶绿酸a对照品溶液0.05，0.1，0.2, 0.4，0.8 μL对应于1 ml试管中，分 别加1 ml甲醇摇匀，即浓度分别为0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6 μg/ml;A样品溶液与脱镁叶 绿酸a对照品各浓度溶液分别取10 μL进样，重复进样3次，在最大吸收波长408 nm处测定 样品峰面积，以脱镁叶绿酸a对照品各点化合物峰面积均值为纵坐标，各点化合物溶液质量 浓度为横坐标，绘制标准曲线，求算回归方程，再根据A样品溶液测定的峰面积计算出在欧 洲鹅耳枥叶片中相应的含量。5. 根据权利要求1所述的一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于所述步骤 (4) 芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量测定，由以下步骤组成： ① 确定高效液相色谱测试条件:操作波长:368 nm;Ci8色谱柱:250 mmX4.6 mm，5 μπι; 柱温:40°C ;流动相：乙腈和含0.1%(V/V)甲酸的水，二者梯度变化：乙腈分别为0分钟10%， 15分钟40%，40分钟60%，41分钟60%，48分钟60%，流速是0.8 ml / min，注入量是10 μL，洗 脱时间:48分钟;通过标准溶液的峰面积测量值记录定量值； ② 分别称取9.7 mg芦丁，9.6 mg槲皮素，0.5 mg山奈酸，异鼠李素 0.4 mg于50 ml试管 中，加入40 ml甲醇进行溶解，摇匀，配成标准对照品溶液，于-20°C保存，以备四种黄酮类成 分的含量测定。6. 根据权利要求1所述的一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于所述步骤 (5) 总黄酮含量测定:精密称取在120°C减压干燥至恒质量的芦丁对照品30 mg于100 ml容 量瓶中，加80% (V/V)的乙醇置水浴中加热溶解，冷却，用80% (V/V)的乙醇定容至刻度， 即为0.3 mg/ml的芦丁对照品溶液，摇匀； 准确吸取该芦丁对照品溶液〇, 0.1，0.2, 0.4, 0.8，1.6, 3.2 ml分别置于25 ml容 量瓶中，分别加 30% (V/V)乙醇溶液至5 ml;加 5% (m/V) NaN02溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min;再加 10% (m/V) Α1(Ν〇3)3溶液0.3 ml，摇勾，放置6 min;加4% (m/V) NaOH 溶液4 ml， 用蒸馏水定容至10 ml，摇匀，浓度分别为0，3，6，12，24，48，96 μg/ml放置15-20 min； 各取200 μL至酶标仪板后，在最大吸收波长510 nm处测定吸光度，以吸光度(A)为纵 坐标、芦丁标准品溶液质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程； 然后根据B样品溶液的吸光度和芦丁对照品的标准曲线，测定B样品溶液中总黄酮的含 量，根据B样品溶液的质量与原样品质量的比例，通过计算得到欧洲鹅耳枥叶中总黄酮的 含量，完成一种欧洲鹅耳枥叶的质量检测方法。7. 根据权利要求1所述的一种确定欧洲鹅耳枥叶采收期的方法，其特征在于所述步骤 (6) 确定欧洲鹅耳枥叶最佳采收期:综合所测3-10月份的脱镁叶绿酸a、总黄酮、芦丁、槲皮 素、山奈酚和异鼠李素含量，评价欧洲鹅耳枥叶质量，筛选活性物质含量最高对应的季节， 完成一种确定欧洲鹅耳枥叶最佳采收期的方法。
【文档编号】G01N21/31GK106093249SQ201610716119
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月25日
【发明人】祝遵崚, 圣倩倩
【申请人】南京林业大学