一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，色谱条件为：选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长220nm，柱温35℃，流速1.0ml/min；采用反相高效液相色谱法按梯度进行洗脱，流动相为磷酸盐缓冲溶液与极性有机溶剂，磷酸盐缓冲溶液为A相，极性有机溶剂为B相，流动相中B相的有机溶剂为乙腈。本发明采用了反相高效液相色谱法，通过制备供试液和对照液，并且分别量取供试液及对照溶液20μl，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即完成了安立生坦含量的测定，本发明填补了目前安立生坦含量测试分析方法尚无的空缺，本发明可以满足研发和生产的需求，能够有效的对安立生坦含量进行更为严格有效的控制。
【专利说明】
一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及国家3.1类新药安立生坦原料药的质量控制方法，具 体涉及一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法。
【背景技术】
[0002] 内皮素-1 ( ET-1)是一种有效的自分泌和旁分泌肽。两种受体亚型(ETA和ETB)共 同调节ET-1在血管平滑肌和内皮细胞中的作用。ETA的主要作用是血管收缩和细胞增殖，而 ETB的主要作用是血管舒张、抑制增殖、以及清除ET-1。
[0003] 在患有肺动脉高压的患者中，血浆ET-1的浓度增高了 10倍，并且与右心房平均压 力的增加和疾病的严重程度相关。肺动脉高压患者肺组织中ET-1和ET-lmRNA浓度增加 9倍， 主要集中在肺动脉内皮细胞。这些发现提示了 ET-1可能在肺动脉高压的发病和进展中起了 重要的作用。
[0004] 安立生坦是一种与ETA高度结合的受体拮抗剂，与ETB相比对ETA有高选择性，有关 对ETA高选择性的临床影响还是未知。
[0005] 安立生坦由Myogen公司研制，后期由吉利德公司开发，葛兰素史克公司获得本品 在美国以外的市场许可权，商品名"LETAIRIS?"，于2007年6月15日获FDA批准，获批剂型为 口服片剂，制剂规格有5mg和1 Omg片剂。临床上用于治疗WHO心功能I-III级PAH，以提高活动 能力和延缓临床恶化。
[0006] 该原料药的含量分析方法尚无文献报道，目前上市的安立生坦剂型为片剂，规格 5mg。为了保证安立生坦制剂研发和生产的质量，需要对原料药的含量进行控制。因此我们 通过大量实验，摸索了一套检测方法，并严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，满足了 研发和生产的需求。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种高效液相色 谱法测定安立生坦含量的方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种高效液相色谱法测定安立生坦含量 的方法，其创新点在于：所述色谱条件为：选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长 250mm，检测波长220nm，柱温35°C，流速1.0ml/min;采用的检测器为紫外检测器;采用反相 高效液相色谱法按梯度进行洗脱，所述流动相为磷酸盐缓冲溶液与极性有机溶剂，所述磷 酸盐缓冲溶液为A相，所述极性有机溶剂为B相，所述流动相中B相的有机溶剂为乙腈。
[0009] 进一步的，所述A相磷酸盐缓冲溶液中的磷酸盐的加入量为10~60mmol/L;所述磷 酸盐的PH值为2~4。
[0010] 进一步的，所述B相与A相混合体积比例为40~60:40~60。
[0011]进一步的，所述测定安立生坦含量的具体操作步骤为： (1)取20-150mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为供试品溶液； (2) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (3) 取20-150mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为对照品溶液； (4) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (5) 按照外标法以峰面积计算得到安立生坦含量。
[0012] 进一步的，所述稀释液为水和乙腈的混合液，所述水和乙腈的混合体积比为25: 75〇
[0013] 本发明的有益效果如下：本发明采用了反相高效液相色谱法，通过制备供试液和 对照液，并且分别量取供试液及对照溶液20μ1，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面 积计算并折干，即完成了安立生坦含量的测定，本发明填补了目前安立生坦含量测试分析 方法尚无的空缺，本发明可以满足研发和生产的需求，能够有效的对安立生坦含量进行更 为严格有效的控制。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明的安立生坦系统适应性图； 图2为本发明的安立生坦原料药线性图。
【具体实施方式】
[0015] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明 书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
[0016] -种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，色谱条件为：选用以十八烷基硅 烷键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长220nm，柱温35°C，流速1.0ml/min;采用的检测 器为紫外检测器;采用反相高效液相色谱法按梯度进行洗脱，流动相为磷酸盐缓冲溶液与 极性有机溶剂，磷酸盐缓冲溶液为A相，极性有机溶剂为B相，流动相中B相的有机溶剂为乙 臆。
[0017] 实施例！ A相磷酸盐缓冲溶液中的磷酸盐的加入量为10mmol/L;磷酸盐的PH值为2，B相与A相混 合体积比例为40:60。
[0018]测定安立生坦含量的具体操作步骤为： (1) 取20mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为供试品溶液，稀释液为水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合体积比为25:75; (2) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (3) 取20mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为对照品溶液，稀释液为水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合体积比为25:75; (4) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (5) 按照外标法以峰面积计算得到安立生坦含量。
[0019] 实施例2 A相磷酸盐缓冲溶液中的磷酸盐的加入量为60mmol/L;磷酸盐的PH值为4，B相与A相混 合体积比例为60:40。
[0020] 测定安立生坦含量的具体操作步骤为： (1) 取150mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为供试品溶液，稀释液为水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合体积比为25:75; (2) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (3) 取150mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为对照品溶液，稀释液为水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合体积比为25:75; (4) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (5) 按照外标法以峰面积计算得到安立生坦含量。
[0021] 实施例3 Α相磷酸盐缓冲溶液中的磷酸盐的加入量为35mmol/L;磷酸盐的ΡΗ值为3，Β相与Α相混 合体积比例为45:55。
[0022] 测定安立生坦含量的具体操作步骤为： (1) 取85mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为供试品溶液，稀释液为水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合体积比为25:75; (2) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (3) 取85mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释成每 lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为对照品溶液，稀释液为水和乙腈的混合液，水和乙 腈的混合体积比为25:75; (4) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (5) 按照外标法以峰面积计算得到安立生坦含量。
[0023]对安立生坦含量测定方法的以下项目进行了验证： 1、系统适应性 用安立生坦来分析此色谱条件是否符合要求。由图1可见此条件下各个杂质与主峰以 及杂质之间分离度符合要求，峰纯度和单点阈值均符合要求。
[0024] 2、标准曲线 配制各浓度梯度的供试液，分别精密量取2〇μ1，注入色谱仪，记录色谱图，以浓度(yg/ ml)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制回归曲线，计算回归系数。
[0025] 由上表可见，本品的含量测定于安立生坦浓度4.032-40.32μg/ml的浓度范围内有 良好线性。
[0026] 3、重复性 取样品6份，分别精密称定，按高效液相色谱法含量测定方法进行测定，考察测定方法 的重复性，具体如下表：
由上表可知，本品含量测定高效液相色谱法的重复性良好。
[0027] 4、回收率 取本品10mg共九份于50ml容量瓶中，标示为低、中、高三个浓度梯度，分别加入8mg、 1 Omg、12mg的对照品各三份，精密量取lmL至20mL容量瓶，照含量测定的高效液相色谱法测 定，计算测得量和回收率，结果如下表所示：
由上表可见，本高效液相色谱法含量测定的回收率良好。
[0028] 5、溶液稳定性 取本品含量测定的供试液，分别于〇、2、4、6、8小时进样，考察本品含量测定液相法的溶 液稳定性。
[0029] 由上表可见，本品含量测定的高效液相色谱法溶液于8小时内稳定。
[0030] 6、中间精密度 以重复性结果为中间精密度数据组1，另行实验结果为中间精密度数据组2和数据组3， 考察本品含量测定高效液相色谱法的中间精密度。
[0031] 由上表可知，本品含量测定高效液相色谱法的中间精密度良好。
[0032] 本发明采用了反相高效液相色谱法，通过制备供试液和对照液，并且分别量取供 试液及对照溶液20μ1，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算并折干，即完成了 安立生坦含量的测定，本发明填补了目前安立生坦含量测试分析方法尚无的空缺，本发明 可以满足研发和生产的需求，能够有效的对安立生坦含量进行更为严格有效的控制。
[0033] 上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是 不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利 的权利保护范围内。
【主权项】
1. 一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，其特征在于:所述色谱条件为:选用 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长250mm，检测波长220nm，柱温35 °C，流速1.0ml/ min;采用的检测器为紫外检测器;采用反相高效液相色谱法按梯度进行洗脱，所述流动相 为磷酸盐缓冲溶液与极性有机溶剂，所述磷酸盐缓冲溶液为A相，所述极性有机溶剂为B相， 所述流动相中B相的有机溶剂为乙腈。2. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述A相磷酸盐缓冲溶液中的磷酸盐的加入量为10~60mmol/L;所述磷酸盐的PH值为2~4。3. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述B相与A相混合体积比例为40~60:40~60。4. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述测定安立生坦含量的具体操作步骤为： (1) 取20-150mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为供试品溶液； (2) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (3) 取20-150mg安立生坦片剂，精密称重，放置于量瓶中，加入稀释液进行溶解并稀释 成每lmL中含有0.05mg安立生坦的溶液，作为对照品溶液； (4) 精密量取供试品溶液20μ1，注入液相色谱仪，记录色谱图； (5 )按照外标法以峰面积计算得到安立生坦含量。5. 根据权利要求4所述的一种高效液相色谱法测定安立生坦含量的方法，其特征在于： 所述稀释液为水和乙腈的混合液，所述水和乙腈的混合体积比为25:75。
【文档编号】G01N30/02GK106093250SQ201610742015
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月27日
【发明人】黄乐群, 周磊
【申请人】江苏嘉逸医药有限公司