一种用于电喷雾质谱的药物分析装置的制造方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种用于电喷雾质谱的药物分析装置，包括：两片玻璃基底，所述玻璃基底具有至少一个尖端；用于连接电压接口并夹住所述玻璃基底的导电夹；以及用于放置所述玻璃基底的腔室；其中，所述两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧面对面贴合。该装置制作简单，易于操作；所用材料生物兼容性好，透光性好，可以用荧光手段进行药效监测；可用于细胞共培养，模拟体内细胞共生微环境，通过细胞间的通讯进行药物分析；可与质谱联用，对细胞内吸收的药物进行定量检测。
【专利说明】
一种用于电喷雾质谱的药物分析装置
技术领域
[0001]本实用新型涉及细胞的药物分析领域，尤其涉及一种用于电喷雾质谱的基于细胞的药物分析装置。
【背景技术】
[0002]受高额的研发费用和动物实验种族差异性的影响，药物研发过程正变得越来越复杂。因此，发展低成本的基于细胞的药物分析势在必行。基于细胞的药物分析装置总是难以在体外模拟细胞在体内所处的复杂微环境。并且在传统的基于细胞的药物分析方法中，需要培养大量细胞，并且经过复杂的操作程序才能获得充分的数据。这些传统的分析方法往往存在试剂消耗量大、耗时和低通量的缺点。
[0003]质谱则是一种较为快速的分析方法，该方法可以提供高灵敏度、高通量和分子级别的化学信息。作为一种多功能的分析技术，质谱可与电泳、色谱等联用以分离和提取相关的药物成分，从而提高药物分析的灵敏度、精确度和针对性。文献I将电喷雾质谱与毛细管电泳联用，可自动分析单个红细胞中的血红素和血红蛋白中的α和β取代基。然而，用于质谱分析的样品往往需要先进行复杂的离线预处理，因此，只能进行脱离细胞微环境的离线药物分析，而有效的药物分析要求分析条件应尽可能接近于体内微环境，这导致样品前处理成为质谱用于药物分析的一大障碍。
[0004]为了克服上述困难，人们开始发展常态离子化质谱，以省略样品前处理步骤，实现在自然状态下分析和鉴定样品。文献2利用一根短的、锥形的毛细管作为纳升级的取样和喷雾工具，在质谱检测器前产生气态离子，可用于检测一系列复杂基质中的分子而无需样品前处理。文献3则利用穿刺针直接进行组织中的样品喷雾，可得到精确的分子信息。文献4和文献5则分别用医用棉签和牙签进行电喷雾，用于药物分析。在这其中，纸基电喷雾逐渐发展成为一种成熟的常态离子化方法，用于复杂样品的分析。电解质通过毛细作用运输到纸基的尖端，施加高电场后形成离子喷雾。纸喷雾质谱由于其简单的操作和易得的设备，常用于细胞培养基中的生物分子检测、生物流体分析和食品安全的监测。纤维素色谱纸和硝酸纤维素膜是常用的纸基。然而，这些纸基因其较差的生物相容性令细胞难以在其上附着，因其不透明性又无法实现对细胞的光学手段实时监测，从而限制了其在基于细胞的研究中的应用。因此，能够用于基于细胞的药物分析的常态离子化的装置和方法亟待发展。
[0005]相关技术文献
[0006]文南犬1:1ntegrated Microfluidic Device for Automated Single CellAnalysis Using Electrophoretic Separat1n and Electrospray 1nizat1n MassSpectrometry(MeI1rs J.S.；Jorabchi K.；Smith L.M.；Ramsey J.M.Anal.Chem.,2010,82，967-973)0
[0007]文南犬2:Capillary Act1n-Supported Contactless Atmospheric Pressure1nizat1n for the Combined Sampling and Mass Spectrometric Analysis ofB1molecules(Hsieh C.；Chang C.；Urban P.L.；Chen Y.Anal.Chem.,2011,83,2866-2869) ο
[0008]文献3:B1logical tissue diagnostics using needle b1psy and spray1nizat1n mass spectrometry(Liu J.；Cooks R.G.；Ouyang Z.Anal.Chem.,2011,83,9221-9225)o
[0009]文南犬4:Direct drug analysis from oral fluid using medical swab touchspray mass spectrometry (Pirro V.；Jarmusch A.K.;Vincenti M.；CooksR.G.Anal.Chim.Acta,2015,861,47-54)。
[0010]文南犬5:1nternal standard mass spectrum fingerprint:A novel strategyfor rapid assessing the quality of Shuang-Huang-Lian oral liquid usingwooden-tip electrospray 1nizat1n mass spectrometry(Yang Y.；DengJ.Anal.Chim.Acta,20I4,837,83-92)。
【实用新型内容】
[0011]鉴于上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于电喷雾质谱的药物分析装置，通过两片玻璃基底贴合，来模拟体内细胞共生的微环境，既可以用于监测共培养细胞的生理状态，也可以通过该装置与质谱联用，进行细胞内吸收的药物的定量分析。
[0012]本实用新型的一个实施方式在于提供一种用于电喷雾质谱的药物分析装置，包括:
[0013]两片玻璃基底，所述玻璃基底具有至少一个尖端；
[0014]用于连接电压接口并夹住所述玻璃基底的导电夹；以及
[0015]用于放置所述玻璃基底的腔室；
[0016]其中，所述两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧面对面贴合。
[0017]根据本实用新型，在两片玻璃基底上分别滴加不同的细胞悬液，待其贴壁后，将两片玻璃基底的有细胞贴壁的一侧面对面贴合。
[0018]本实用新型的发明人经研究发现，通过本实用新型的药物分析装置的玻璃基底，能够提供较高的生物相容性，从而易于实现细胞在其上的贴壁和生长，同时由于玻璃基底的透明性，也易于实现对细胞的实时监测。另一方面，通过将两片所述玻璃基底贴合，能够模拟体内细胞共生的微环境，以使贴壁在两片玻璃基底上的细胞相互作用，共同生长，从而能够实现细胞在共培养条件下经药物作用后的定性或定量检测。
[0019]在本实用新型的一个优选的实施方式中，所述玻璃基底为锐角三角形的盖玻片，优选为等腰锐角三角形的盖玻片。
[0020]根据本实用新型，所述等腰锐角三角形的盖玻片的顶角为20°-60°。
[0021]在本实用新型的另一个优选的实施方式中，所述玻璃基底的边长均小于lcm，厚度为 5-20μηι。
[0022]在本实用新型的另一个优选的实施方式中，上述装置还包括片状高聚物材料，所述腔室形成在所述片状高聚物材料上，并且所述腔室的形状与所述玻璃基底的形状相适应。
[0023]根据本实用新型，所述腔室的形状与所述玻璃基底的形状相适应，表示所述腔室与所述玻璃基底的形状相同或相似，所述腔室的面积略大于所述玻璃基底。
[0024]在本实用新型的一个更优选的实施方式中，所诉腔室通过在一片片状高聚物材料上设置一个与所述玻璃基底的形状相适应的空洞，并与另一片相同大小和形状的片状高聚物材料层叠而构成。
[0025]在本实用新型的另一个优选的实施方式中，所述片状高聚物材料为有机硅聚合物，优选为聚二甲基娃氧烧(PDMS)。
[0026]在本实用新型的另一个优选的实施方式中，所述片状高聚物材料的厚度为l-5mm。
[0027]根据本实用新型，利用上述装置进行细胞内药物吸收的质谱检测的方法，包括:
[0028]向两片玻璃基底分别滴加两种不同的细胞悬液，待细胞贴壁后，将两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧面对面贴合，置于所述腔室中培养过夜；
[0029]采用药物作用于培养过夜的待测细胞；
[0030]对于经药物作用的待测细胞吸收的药物通过质谱仪进行检测。
[0031]其中，采用药物作用于培养过夜的待测细胞的时间为24h。
[0032]其中，通过质谱仪进行检测包括:用导电夹夹住玻璃基底放置于质谱仪前，将玻璃基底的一个尖端正对质谱仪的进样口，通过导电夹施加高压电，对有待测细胞贴壁的玻璃基底滴加有机溶剂，产生电喷雾后进行检测。
[0033]根据本实用新型，利用上述装置进行细胞凋亡率和增殖率检测的方法，包括:
[0034]向两片玻璃基底分别滴加两种不同的细胞悬液，待细胞贴壁后，将两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧面对面贴合，置于所述腔室中培养过夜；
[0035]采用药物作用于培养过夜的待测细胞；
[0036]用荧光探针对经药物作用的待测细胞进行染色，并分析细胞凋亡和增殖的情况。
[0037]根据本实用新型所提供的用于电质谱的药物分析装置，制作简单，易于操作;所用材料生物兼容性好，透光性好，可以用荧光手段进行药效监测；可用于细胞共培养，模拟体内细胞共生微环境，通过细胞间的通讯进行药物分析;可与质谱联用，对细胞内吸收的药物进行定性和定量检测。
【附图说明】
[0038]图1显示的是使用本实用新型的药物分析装置进行细胞共培养的示意图。
[0039]图2显示的是根据本实用新型的实施例2进行HepG2和MCF-7细胞共培养1-3天的细胞存活率分析图，图中显示的是三组平行实验的结果。
[0040]图3显示的是根据本实用新型的实施例3第一组实验的细胞凋亡分析图，图中显示的是三组平行实验的结果，图中*表示有显著差别。
[0041]图4显示的是根据本实用新型的实施例3第二组实验的细胞凋亡分析图，图中显示的是三组平行实验的结果，图中*表示有显著差别。
[0042]图5显示的是根据本实用新型的实施例3第三组实验的细胞增殖分析图，图中显示的是三组平行实验的结果，图中*表示有显著差别。
[0043]图6显示的是根据本实用新型的药物分析装置与质谱联用的示意图，在图6中，1-导电夹;2-玻璃基底;3-片状高聚物材料;4-腔室;5-有机溶剂;6-电喷雾;7-质谱仪进样口。
[0044]图7显示的是根据本实用新型的实施例4以同位素CPA-d4为内标所做的质谱定量检测标准曲线。
[0045]图8显示的是根据本实用新型的实施例4的第一组和第二组实验中细胞CPA吸收量，图中显示的是三组平行实验的结果，图中*表示有显著差别。
【具体实施方式】
[0046]以下通过实施例对本实用新型进行详细说明，但本实用新型的保护范围并不限于下述说明。若无特殊说明，所用实验方法为常规实验方法;所使用的试剂和材料等均可通过商业途径获得。
[0047]实施例1药物分析装置的制作及其结构
[0048]将PDMS预聚物与引发剂以质量比10:1混合后倒在硅片上，硅片周围事先用宽胶带封好，防止PDMS预聚物漏出。将PDMS预聚物除气泡后在75°C下放置2h，进行聚合反应。将聚合后的PDMS片小心揭下，切割成2cm X 2cm X 3mm的PDMS片。按同样方法再制作一块同样大小的PDMS片，并在其上挖出一个等腰三角形空洞(该等腰三角形空洞的腰长为1.2cm，顶角为30°)。将挖有等腰三角形空洞的TOMS片和没有空洞的TOMS片层叠在一起，形成了可以容纳上述玻璃基底的PDMS腔室。
[0049]将厚度为25μπι的盖玻片用玻璃刀切成两个腰长为0.8cm，顶角为30°的等腰三角形，洗净、烘干，置于上述腔室中，备用。
[0050]准备可导电的金属夹作为导电夹，备用。
[0051 ]实施例2细胞的共培养
[0052]I)如图1所示，将60mm培养皿中长满的人肝肿瘤细胞HepG2和人乳腺癌细胞MCF-7分别消化，并分别用培养基稀释为106mL—1的细胞悬液。取HepG2细胞的细胞悬液I OOyL滴加到一片玻璃基底上，取MCF-7细胞的细胞悬液10yL滴加到另一片玻璃基底上，将两片玻璃基底分别放置在培养皿中。1-2小时后，放在显微镜下观察细胞是否贴壁。当两种细胞贴壁后，将两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧面对面贴合，置于PDMS腔室中。将置于PDMS腔室中的玻璃基底放入细胞培养箱，培养过夜，备用。
[0053]2)取出MCF-7细胞贴壁的玻璃基底，玻璃基底的尖端被细胞完全覆盖，可以保证后期用于检测的样品容量。
[0054]3)用Ce 11 TrackerTM Green CMFDA和Ce 11 TrackerTM Deep Red的荧光染料分别对两片玻璃基底上的HepG2和MCF-7细胞进行染色，然后将两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧再次面对面贴合，置于激光共聚焦显微镜下进行观察。两种细胞能够很好地共存。
[0055]4)按照与步骤I)相同的方式将HepG2和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)细胞以及HepG2和MCF-7细胞培养过夜，每天更换培养基，备用。用死活剂盒(Calcein-AM/EthD_l)每日检测细胞存活率。结果如图2所示，细胞在培养的前三天活性都保持正常，在第三天细胞存活率仍达到85%以上。
[0056]实施例3药效分析
[0057]环磷酰胺(CPA)作为一种抗癌药，会引起细胞凋亡，染料木素作为一种雌激素类药物，会引起乳腺癌细胞的增殖。将CPA和染料木素作为模型药物作用于共培养和单培养的细胞上，进行药效分析。
[0058]第一组实验:HepG2/MCF_7和MCF-7的凋亡药效分析
[0059]以MCF-7为目标细胞，对其在单培养状态下和与HepG2共培养状态下的凋亡药效进行分析。具体地:
[0060]将CPA储备液(100mmol/L，即10mM)用细胞培养基逐级稀释到系列浓度(O，5,10,20和40mol/L)。按照与实施例2的步骤I)相同的方式共培养HepG2和MCF-7细胞，培养过夜后，将置于PDMS腔室中的MCF-7细胞贴壁的玻璃基底从培养箱中取出，分别滴加10yL不同浓度的CPA溶液，然后重新与HepG2贴壁的玻璃基底面对面贴合，放回培养箱中，培养24小时。
[0061]在两片玻璃基底上均培养MCF-7细胞，面对面贴合，其培养方式和药物作用方式与上述共培养的MCF-7细胞相同，以此单培养的MCF-7细胞作为对照试样。
[0062]24小时后，从培养箱中取出MCF-7细胞贴壁的玻璃基底，用荧光探针Hoechst33342对细胞染色，用荧光显微镜(Leica DMI 4000 B)拍照，并用软件Image-Pro Plus 6.0分析细胞凋亡情况，结果如图3所示。
[0063]第二组实验:NIH_3T3/HepG2和HepG2的凋亡药效分析
[0064]以HepG2为目标细胞，对其在单培养状态下和与NIH-3T3共培养状态下的凋亡药效进行分析。除使用的目标细胞和共培养的细胞不同外，其余操作与本实施例的第一组实验相同。结果如图4所示。
[0065]由图3和4可以看出，随着CPA浓度增大，细胞凋亡率明显升高，CPA的药物毒性表现出明显的浓度依赖性。在同一浓度下，是否处在共生条件下的细胞表现出不同的凋亡率。单培养的HepG2细胞比与NIH-3T3细胞共培养的HepG2细胞表现出更高的细胞凋亡率，而与HepG2细胞共培养的MCF-7细胞比单培养的MCF-7细胞表现出更高的细胞凋亡率。这是由于NIH-3T3细胞是一种成纤维细胞，这种细胞的存在对HepG2细胞起到屏障作用，使得实际作用于HepG2细胞的CPA浓度变小。而CPA作为一种前体药物，在肝脏中代谢后会引起乳腺癌细胞的凋亡，所以与HepG2细胞共培养的MCF-7细胞表现出更高的细胞凋亡率。而当CPA浓度高于40mmol/L时，细胞凋亡率之间的差别就几乎消失，可能是由于高浓度的CPA有效导致了细胞凋亡，NIH-3T3细胞的屏障作用也因此被削弱。
[0066]第三组实验:HepG2/MCF_7和MCF-7的增殖药效分析
[0067]以MCF-7为目标细胞，对其在单培养状态下和与HepG2共培养状态下的增殖药效进行分析。具体地:
[0068]将染料木素储备液(100mg/mL)分别用细胞培养基逐级稀释到系列浓度(0，5，10，20和40yg/mL)。按照与实施例2的步骤I)相同的方式共培养HepG2和MCF-7细胞，培养过夜后，将置于PDMS腔室中的MCF-7细胞贴壁的玻璃基底从培养箱中取出，用死活剂盒(Calcein-AM/EthD-Ι)对细胞染色，用荧光显微镜(Leica DMI 4000 B)的10倍物镜以固定大小的观察面积对荧光染色的细胞进行拍照，计算出药物作用前该面积内的细胞密度。然后分别滴加10yL不同浓度的染料木素溶液，然后重新与HepG2贴壁的玻璃基底面对面贴合，放回培养箱中，培养24小时。
[0069]在两片玻璃基底上均培养MCF-7细胞，面对面贴合，其培养方式和药物作用方式与上述共培养的MCF-7细胞相同，以此单培养的MCF-7细胞作为对照试样。
[0070]24小时后，从培养箱中取出MCF-7细胞贴壁的玻璃基底，再次用荧光显微镜(LeicaDMI 4000 B)的10倍物镜观察同样面积内的荧光染色的细胞，并将染料木素作用24h后的细胞密度与作用之前的细胞密度比较，从而得出细胞增殖率。结果如图5所示。
[0071]如图5所示，在染料木素浓度小于20yg/mL时，细胞增殖率同样表现出浓度依赖性，随染料木素浓度增大，细胞增殖率升高。而在染料木素浓度为^yg/mL时，细胞增殖率反而下降，这可能是由于高浓度的染料木素使得细胞在最初阶段快速增殖，而高密度的细胞阻碍了后续细胞的增殖。是否有HepG2细胞共存条件下的MCF-7细胞同样表现出不同的增殖率。在同一浓度时，单培养的MCF-7细胞比共培养的MCF-7细胞表现出更高的增殖率，这是由于染料木素同样会在肝脏细胞中代谢，从而使得实际作用于MCF-7细胞的染料木素浓度下降。
[0072]实施例4与质谱联用定量检测细胞内药物吸收量
[0073]以CPA的稳定同位素CPA-d4为内标，采用同位素内标法进行质谱定量分析。具体地，将5yL 0?4-(14的培养基溶液(1011111101/1)加入1(^系列浓度的0?4的培养基溶液(5，10，20，40和60mmol/L)中，并分别滴加到五片玻璃基底上。如图6所示，待其挥发干后，将玻璃基底夹起，用蒸馏水冲洗三次以除去残留在玻片表面的复杂基质。待玻璃基底自然晾干后，用导电夹夹好放置于岛津LCMS-2010A质谱仪前，使玻璃基底的尖端(30°角处)正对质谱仪进样口，通过导电夹对玻璃基底施加高压电(?4.5kV)，同时向玻璃基底滴加异丙醇，随即产生电喷雾，用质谱仪收集喷雾离子并进行扫描分析。扫描的质荷比(m/z)范围为100至500，以正离子模式进行检测。以[CPA+Na]+峰强度与[CPA-d4+Na]+峰强度之比为相对峰强度，以相对质谱峰强度为纵坐标，以CPA浓度为横坐标制作标准曲线。如图7所示，标准曲线表现出很好的线性(R2 = 0.9987)，线性方程为y = 0.18376+0.09671x<XPA及其同位素之间的类似的结构有效地削弱了复杂基质的影响。
[0074]第一组实验:HepG2/MCF_7和MCF-7的药物吸收情况
[0075]以MCF-7为目标细胞，对其在单培养状态下和与HepG2共培养状态下的药物吸收情况通过电喷雾质谱进行分析。具体地:
[0076]按照与实施例2的步骤I)相同的方式共培养HepG2和MCF-7细胞，培养过夜后，将置于PDMS腔室中的MCF-7细胞贴壁的玻璃基底从培养箱中取出，滴加CPA溶液(浓度为1mmol/L，用量为lOOyL)，然后重新与HepG2贴壁的玻璃基底面对面贴合，放回培养箱中，培养24小时。
[0077]在两片玻璃基底上均培养MCF-7细胞，面对面贴合，其培养方式和药物作用方式与上述共培养的MCF-7细胞相同，以此单培养的MCF-7细胞作为对照试样。
[0078]从培养箱中取出PDMS腔室和其中的两片玻璃基底，将MCF-7细胞贴壁的玻璃基底夹起，用蒸馏水冲洗三次以除去残留在玻片表面的复杂基质。待玻璃基底自然晾干后，按照与实施例3相同的方式进行质谱扫描。所得数据如图8所示。
[0079]第二组实验:NIH_3T3/HepG2和HepG2的药物吸收情况
[0080]以HepG2为目标细胞，对其在单培养状态下和与NIH-3T3共培养状态下的药物吸收情况通过电喷雾质谱进行分析。除使用的目标细胞和共培养的细胞不同外，其余操作与本实施例的第一组实验相同。结果如图8所示。
[0081]如图8所示，在是否有其他细胞共生两种条件下，细胞内吸收的CPA的量有所不同，其顺序为:HepG2>NIH-3T3/HepG2，H 印 G2/MCF_7>MCF_7。单培养的 HepG2 和共培养的 MCF-7 对CPA的吸收量偏大。在单培养的HepG2细胞内，CPA的平均吸收量为4.18mmol/L而在共培养的HepG2细胞内仅为0.91mmol/L。在共培养和单培养的MCF-7细胞内CPA的平均吸收量分别为5.49mmol/L和UTmmol/UCPA的吸收量越大引起的细胞凋亡率会越高，因此，由质谱检测的细胞内CPA的平均吸收量很好地解释了在是否有其他细胞共生时，同样浓度的药物所表现出的不同的药效。
[0082]应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的任何限制。通过参照典型实施例对本实用新型进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本实用新型权利要求的范围内对本实用新型作出修改，以及在不背离本实用新型的范围和精神内对本实用新型进行修订。尽管其中描述的本实用新型涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本实用新型限于其中公开的特定例，相反，本实用新型可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
【主权项】
1.一种用于电喷雾质谱的药物分析装置，其特征在于，包括: 两片玻璃基底，所述玻璃基底具有至少一个尖端； 用于连接电压接口并夹住所述玻璃基底的导电夹；以及 用于放置所述玻璃基底的腔室； 其中，所述两片玻璃基底以有细胞贴壁的一侧面对面贴合。2.根据权利要求1所述的药物分析装置，其特征在于，所述玻璃基底为锐角三角形的盖玻片。3.根据权利要求1所述的药物分析装置，其特征在于，所述玻璃基底为等腰锐角三角形的盖玻片。4.根据权利要求3所述的药物分析装置，其特征在于，所述玻璃基底的顶角为20°-60°。5.根据权利要求2-4中任一项所述的药物分析装置，其特征在于，所述玻璃基底的边长均小于1011，厚度为5-2(^1]1。6.根据权利要求1所述的药物分析装置，其特征在于，其还包括片状高聚物材料，所述腔室形成在所述片状高聚物材料上，并且所述腔室的形状与所述玻璃基底的形状相适应。7.根据权利要求6所述的药物分析装置，其特征在于，所诉腔室通过在一片片状高聚物材料上设置一个与所述玻璃基底的形状相适应的空洞，并与另一片相同大小和形状的片状高聚物材料层叠而构成。8.根据权利要求6所述的药物分析装置，其特征在于，所述片状高聚物材料为有机硅聚合物。9.根据权利要求8所述的药物分析装置，其特征在于，所述片状高聚物材料为聚二甲基硅氧烷。10.根据权利要求6-9中任一项所述的药物分析装置，其特征在于，所述片状高聚物材料的厚度为l_5mm。
【文档编号】G01N27/62GK205593965SQ201620114843
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年2月4日
【发明人】吴静, 林金明
【申请人】中国地质大学（北京）, 清华大学