专利名称：与电喷雾质谱联用的在线膜萃取器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与电喷雾质谱联用的在线膜萃取器，属于仪器分析领域，更具体的说，是将液—质联用的应用范围进行拓展的一组套件。
膜萃取技术是膜分离技术与萃取技术相结合的一种新型分离技术，它有很多独特的优点。自K.Ksirakar和B.M.Kim提出膜萃取概念后的十多年来，一直以其大比表面、高萃取率而在众多的工业领域得到广范应用。如在萃取金属离子方面，Alam，Mohammed S.等应用中空纤维膜作相承载界面萃取稀土元素钯；在智利用中空纤维膜回收铜矿废水中的铜等一些金属离子，使其达到环保要求。与此同时许多膜萃取方面的新探索也正日益广范的在个个方面展开，如在电场作用下膜萃取器在液液萃取中的应用；在中空纤维膜上实现离子交换来提取稀土元素。此外，膜萃取技术在有机物处理方面也有着广泛的应用，有报道用膜萃取器处理工业废水中的VOCs(是指易挥发的有机物，包括一些卤代烃，卤代烯烃等)和苯酚。此外，膜萃取技术业已在生化方面得到应用。但在分析领域的应用还是比较少见的，主要是应用于GC分析中的样品富集和提取。这主要是由于工业界一直追求将的膜萃取器的规格越变越大，从而提高其处理量。而分析中所须的规格都较小，而将膜萃取器的尺寸变小有可能造成萃取效果的下降，而且由于分析仪器检测限的关系，有可能使得萃取产物无法检出。而近年来大量的高灵敏分析仪器的问世，使得中空纤维膜大量进入分析领域成为可能。
液—质联用是近二十年来仪器分析领域中最为活跃的分支，随着软电离技术的问世，使得各种色谱技术均有可能与质谱进行联用。而质谱拥有比各种常用的色谱检测器仪器更低的检测限，因此通过液—质联用使得众多色谱技术可获得更高的检测灵敏度。但由于软电离技术本身的技术要求，使得很多十分成熟的色谱条件无法实现与质谱相联，使得液—质联用的应用范围受到了很大的局限。
本发明的目的是设计一种与电喷雾质谱联用的在线膜萃取器，在力图不改变电喷雾质谱的结构和工作环境的前提下，将工业中的高效、快速的液液膜萃取技术微型化后，应用于液质联用中，以将电喷雾质谱的应用范围进一步扩展。
本发明设计的与电喷雾质谱联用的在线膜萃取器，包括本体、液管和萃取膜。所述的本体为十字形，液管置于十字形的四个臂上，并通过中空螺栓固定。所述的萃取膜处于本体中心，其两端各伸进固定于本体上的两个相对的液管中。
将在线膜萃取器串接于正相色谱与电喷雾质谱之间，可实现正相色谱与电喷雾质谱联用，本发明在此基础上建立了一个新的快速测定润滑油中的磷酸三苯酯的方法，以在线的形式解决了以往需要24小时以上的萃取和定量工作，使得每个样品的分析时间只需几分钟。该方法的检出限为0.1μg/ml，在0.4-10μg/ml的范围内拥有良好的线性(r＝0.993)。且由于采用了MRM的检测方式，使得该方法具有良好的选择性。
采用二级膜萃取器串联与离子对色谱与电喷雾质谱之间，则可实现离子对色谱与电喷雾质谱的联用，完成色谱的在线脱盐。本发明在此基础上初步建立了一种快速检测丹参酮IIa的方法，该方法可以实现对丹参酮IIa的定性和定量。
图1是本发明的在线膜萃取器的结构示意图。
图2是本发明用于正相色谱与质谱联用的流路示意图。
图3所示为采用正己烷为流动相分析液压油中磷酸三苯酯的正相色谱图。
图4为磷酸三苯酯萃取与否的标准曲线5是本发明用于离子对色谱与质谱联用的流路示意图。
图6为采用本发明检测丹参酮IIa的LC/MS谱7为采用本发明检测丹参酮IIa的LC/MS/MS谱图下面将结合附图，详细介绍本发明的内容。
图1中，1是本体，2是液管，3是萃取膜，4是密封胶端，5是螺纹端口，6是萃取腔室。图2中，7是油相体系，8是正相色谱，9是水相体系，10是流路截止阀，11是废液，12是电喷雾质谱。图5中，13是加盐体系，14是离子对色谱，15是油相体系，16是流路截止阀，17是废液，18是电喷雾质谱，19是流路截止阀，20是废液，21是水相体系。
如图1所示，在线膜萃取器的本体1为由不锈钢(或PEEK)制成的一个十字形四通，该四通拥有四个10-32的螺纹端口5，通过10-32螺纹的管接头可与任何材质的外径1/16″管路相连，而1/16″外径的管件是色谱和质谱中最为常用的管件。这种四通具有0.02″(或0.015″)的萃取腔室6，使其拥有很小的死体积，保证了将其接在柱后不会引起太大的峰扩散。在本体1中将一根外径400μm×壁厚30μm(或外径240μm×壁厚20μm)的萃取膜3横穿过本体的中心，萃取膜3上的微孔尺寸为0.1×0.4μm，空隙率＞0.30。该萃取膜3的两侧套在外径1/16″×内径0.5mm(或外径1/16″×内径0.25mm)的不锈钢(或PEEK)液管2中，在管的前端用抗腐耐压性能很好的环氧树脂粘和密封成两个密封胶端4，保证了油相体系和水相体系在膜界面上进行接触时不会在套管的前端发生泄漏，造成在油相出口处(或水相出口处)总有水相(或油相)检出。本装置的所有材质均有很好的抗腐耐压性能，完全能适用于各种液相色谱条件，并最少能耐5000psi的压力。
图2～4所示为本发明的一个实施例，正相色谱8由于其流动相为非极性的油相体系7，将其流动相作为与电喷雾质谱12联用时的基质很难形成质子化(在质谱中无法检测到分子离子峰)。而通过在电喷雾质谱与正相柱之间串联一个在线膜萃取器1，进行单级的在线膜萃取就可成将油相体系基质转换成适合于电喷雾质谱的水相体系基质9。此外，须在通向废液11的管路上加装一个流路截止阀10用以调节管路中的压力，以保证油相体系和水相体系只在膜界面上进行萃取，以获取更高的萃取率。由于采用了膜萃取作为基质转化的方式，因此要求样品在所选择的油相体系和水相体系中均有一定的分配能力，且油相体系和水相体系要求能够较好的分相。通过此连接方式可将样品中易在电喷雾质谱中检测到的物质以正相色谱—电喷雾质谱联用方式进行检测。
在本实施例中，采用图2所示的流路串接方式对液压油中的磷酸三苯酯的含量进行了测定。磷酸三苯酯是液压油中的一种添加剂，一般采用GC/MS对其进行定量。
磷酸三苯酯的分析和定量是有相当困难的1、GC/MS无疑是分析油性样品的不可或缺的工具，但GC对于众多的高极性、热不稳定性、高分子量和低挥发度的有机化合物却力所不及。如磷酸三苯酯的沸点较高，在GC/MS中出峰时间长，而且可能在进样口不能完全气化，对这样的化合物，利用HPLC进行分离效果更好。从上图中可以看出磷酸三苯酯在软电离很容易获得一个H质子，以M/Z＝+327的分子离子峰在API3000型质谱中出峰。因此，完全可以采用质谱对其进行检测。
2、HPLC分析油性样品一般采用正相柱，而正相柱的一些常用的流动相体系如正己烷等，由于进入质谱后会严重影响ESI源的离子化效率，使得定量工作无法直接进行。在这种情况下，一般须采用萃取后再作LC/MS/MS进行定量。但该方法十分费时，且为了进行更为准确的定量，通常须进行24小时振摇以使得单次萃取率接近理论萃取平衡值。然后再采用反相色谱进行定量。这样每进行一次定量就需二、三十个小时。但采用本发明后，每一样品的测定时间只有几分钟，且不需要进行十分繁琐的样品预处理。
但由于油性样品中有很多物质在反相柱上有一定的保留，一般采用甲醇或乙腈无法很好地将柱子冲洗干净，对柱子的损伤较大。因此，在采用本发明后，可以直接利用正相柱对油性样品进行分离，且不存在预处理中样品损失的问题。
图3所示为分析磷酸三苯酯的正相色谱图，该色谱图的色谱条件为流动相正己烷0.5ml/min检测波长220nm样品润滑油1mg/ml(正己烷)正相柱150mm×4.6mm EXSIL 5μm的氨基柱预柱5μm的氨基预柱进样量20μl从该色谱图中可以明显发现由于磷酸三苯酯的含量较低，且油峰影响很大。所以无法进行十分准确地定量。但采用了本发明后，可将样品的基质从正己烷变成甲醇，使得磷酸三苯酯很容易在质谱出峰。同时为了增加检测的灵敏度，决定采用多离子监测(MRM)的方式进行监测。通过优化各项质谱参数以获得最强的分子离子峰和碎片离子的丰度，得到如下MRM的质谱条件正离子MRM条件NEB 2 CUR 10 CAD 4 IS 4800TEM 0 OR 51 RNG 220Q0-10IQ1 -10.5ST 20 RO1-10.5 IQ2 -20RO2 -50 ST3-70 RO3-52 DF 200CEM 2000并选择了最强的子离子m/z＝152+与母离子m/z＝327-作为MRM监测的子母离子对。此外，在采用了MRM方式进行检测时，并不需对样品进行完全的基线分离，因而如图3的色谱条件，在经过在线膜萃取器转化基质后，完全可以用于定量。
从0.4～10μg/ml共用正己烷配制了9个浓度的标准溶液，每个浓度作3针平行，采用上述方法获得了磷酸三苯酯的标准曲线如图4中下部由黑方块所构成的一条标准曲线所示。峰面积与浓度的回归方程如下所示A＝2.27×106C+189(A峰面积，C浓度(mg/ml))该曲线的回归率r＝0.994，而磷酸三苯酯的浓度C＝1.56μg/ml(RSD＝8.73％)。该方程的回收率如后所示96.03％，100％，103.97％，101.59％和97.62％。考虑到液压油样品是用正己烷稀释1000倍制得。所以，在油样中的添加剂磷酸三苯酯的实际含量应为1.56mg/g，该测量值与文献值十分吻合，这说明该方法的测量是准确的。
为了与文献进行对照，萃取相的流速为0.5ml/min，从而保证了相比为1∶1。为测定该膜器的萃取率，用甲醇配制了7份磷酸三苯酯的标准溶液，采用流动注射的方式，采用相同的MRM条件检测磷酸三苯酯的在质谱中的响应。可获得在图4中上部由黑三角所构成的一条标准曲线。该曲线的回归方程如下所示A＝2.19×107C+835(A峰面积，C浓度(mg/ml))该曲线的回归率r＝0.998，通过对比这两条标准曲线的截距可算出该膜器的萃取率为10.49％，仅略低于该萃取体系的平衡萃取率16.7％。说明该萃取器具有很高的萃取率。当然萃取率不仅跟膜器的性能有着直接的关系，还跟所选择的萃取体系有关。
图5～7所示为本发明的另一个实施例，由于离子对色谱的14流动相经常会使用加盐体系，而非挥发性盐常常会由于结块会将电喷雾质谱的喷针堵死，且像磷酸盐等盐类具有很强的抢夺电子能力，会掩蔽一些弱电离能力的物质在质谱中的出峰。此时利用二个在线膜萃取器串联组合的方式就可将盐除去。离子对色谱14的加盐流动相体系13在经过第一个在线膜萃取器1后，样品的基质完全转化为油相体系15，而盐类物质由于在油相体系15中的分配很小，因此可将大量的盐除去。此后样品通过第二个在线膜萃取器1，将基质转化成适合于电喷雾质谱18的水相体系21。与上一实施例相同，同样要求样品在所选择的加盐体系13、油相体系15和水相体系21中均有一定的分配能力，且加盐体系与油相体系以及油相体系与水相体系均要求能够较好的分相。在本例中，二个流路截止阀16和19的用途与上一例相同，皆用以调节管路中的压力。此模块组合方式组成的除盐装置与其它除盐技术(如离子交换膜技术)不同，其除盐过程完全是在流路稳定平衡的情况下进行的，因此完全没有盐堆积效应，可以更为准确地进行定量。
在该实施例中，尝试利用串联的二级膜萃取器进行离子对色谱与ESI质谱的联用。因此选定了一种常见的中药成分丹参酮IIa，丹参酮IIa是丹参提取液中的一种脂溶物质，易溶与正己烷、甲醇等非极性溶剂中。一般情况下，对丹参酮IIa进行定性定量需采用二噁烷和正己烷作流动相的正相色谱条件，或在醇水比很高的流动相条件下利用反相色谱进行分析。为了实现离子对色谱与ESI质谱联用，首先确定了离子对色谱所选用的离子对试剂四丁基溴化铵(C16H36BrN，322.37)。四丁基溴化铵是一种常用的离子对试剂，经实验确认其在正己烷中的溶解度很小，因而在经过二级萃取后，在进入ESI质谱的基质中将基本上不存在了，不会影响到ESI质谱的检测。
为了争取获得更佳的色谱条件，因此进行了离子对色谱条件的探索和优化，获得如下色谱条件流动相甲醇(色谱纯)+0.1mg/ml四丁基溴化铵0.5ml/min检测波长254nm样品丹参酮IIa 0.1mg/ml(甲醇)正相柱150mm×4.6mm YWG 10μm的C18反相柱预柱5μm的C18反相预柱进样量20μl在此基础上，对电喷雾质谱的条件进行了探索和优化，获得如下质谱条件正离子MRM条件NEB 4 CUR 12 CAD 4 IS 3500TEM 200OR 96 RNG 260 Q0 -10IQ1 -11 ST -15 RO1-11IQ2-20RO2 -36 ST3 -86 RO3-38DF -200CEM 2000丹参酮IIa在ESI源中将会比较容易获得一个质子，以正离子方式出峰。从丹参酮IIa的二级质谱图中可以发现m/z＝+277.1是最强的碎片峰，因而在采用MRM方式进行检测时选用m/z＝+277.1和m/z＝+295.1作为一对子母离子，以增强丹参酮IIa检测的选择性。
在此条件下，为了获得更佳的出峰效果，在电喷雾端引入了一股200℃ 4000ml/min的辅助气，以加强雾化的效果。在离子对色谱实现与电喷雾质谱联用后，可获得丹参酮IIa经离子对色谱分离，再经过二级萃取除盐后的质谱图，如图6、7所示。其中，一级萃取为利用正己烷将样品从离子对色谱分离结束后流动相中萃取出来，第二级萃取则是用甲醇将样品从正己烷中反萃出来，进入电喷雾质谱。从图6中可以看到，丹参酮IIa经LC分离，再经过萃取后的一级质谱图中，是具有相当高的纯度的，且无法发现分子量为322.37的四丁基溴化铵的分子离子峰。这说明在萃取的过程中无明显的泄漏发生，而四丁基溴化铵本身很难溶解在正己烷中，这充分保证了在线除盐的彻底性。
通过一级质谱的监测，发现样品的分离还是比较纯的，因此决定采用MRM的方式进行进一步的监测，获得了如图15所示的LC/MS/MS谱图，信噪比和峰形都得到了改善。因此通过进一步的优化，该方法完全可以应用于丹参酮IIa的定性和定量分析工作中。虽然，由于二次萃取的原因，会使得离子对色谱与电喷雾质谱联用后，实际检测限有相当的损失，但如果离子对色谱对某些复杂样品的分离效果明显优于反相色谱时，将离子对色谱通过该方式与电喷雾质谱联用，对于未知样品的定性会提供更多的信息。
权利要求
1.一种与电喷雾质谱联用的在线膜萃取器，其特征在于，该萃取器包括本体、液管和萃取膜；所述的本体为十字形，液管置于十字形的四个臂上，并通过中空螺栓固定；所述的萃取膜处于本体中心，其两端各伸进固定于本体上的两个相对的液管中。
全文摘要
本发明涉及一种与电喷雾质谱联用的在线膜萃取器,包括本体、液管和萃取膜。本体为十字形,液管置于十字形的四个臂上,并通过中空螺栓固定。萃取膜处于本体中心,其两端各伸进固定于本体上的两个相对的液管中。将本发明的在线膜萃取器串接于正相色谱与电喷雾质谱之间,可实现正相色谱与电喷雾质谱联用,完成色谱的在线脱盐。
文档编号B01D11/04GK1276254SQ0010962
公开日2000年12月13日 申请日期2000年6月16日 优先权日2000年6月16日
发明者罗国安, 王振宇, 曹进 申请人:清华大学