一种三疣梭子蟹放流效果评估方法与流程

本发明属于海水动物放流领域，具体地涉及一种三疣梭子蟹放流效果评估方法。

背景技术：

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是中国沿海的重要经济蟹类。2013年，我国三疣梭子蟹的养殖产量已达到10.96万吨，养殖面积超过2.93万公顷。因其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。近年来，随着沿海各地人工养殖规模的扩展、捕捞强度的加大、人工放流以及生态环境变化等因素的影响，三疣梭子蟹野生种质资源受到较大影响。为保护、恢复三疣梭子蟹种群和渔业资源，我国开始在特定海区进行三疣梭子蟹增殖放流，经过连续多年的大规模种苗放流，三疣梭子蟹资源量得到了一定的恢复。不过由于无法准确区分回捕群体中放流个体和野生个体及数量，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平，分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是三疣梭子蟹放流迫切需要解决的重大问题。衡量和评估放流效果的重要指标之一是放流回捕率估算，这是制定科学的放流规划、有效促进野生三疣梭子蟹种群资源恢复的重要指标。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种三疣梭子蟹放流效果评估方法，该方法可实现精确追溯放流，精确评估放流回捕率。其是通过以下技术方案实现的：一种三疣梭子蟹放流效果评估方法，包括如下步骤：

A，每年放流前夕，收集海捕野生三疣梭子蟹，经过升温培育后，挑选抱卵亲蟹，排幼后，收集母本大鳌肌肉样品，保存于-80℃冰箱；

B，幼体培育至Ⅱ期幼蟹进行放流；

C，秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕后通过三组荧光标记微卫星多重PCR个体识别技术检测放流个体及其数量，最终确定三疣梭子蟹的放流效果。

优选的，所述三组荧光标记微卫星多重PCR个体识别技术检测放流个体及其数量的具体步骤为：

亲本及回捕样品进行三组荧光标记微卫星多重PCR；

对三组多重PCR产物进行基因型分析，得到亲本和回捕样品数据；

将第一组多重PCR检测的亲本及样品数据输入软件，进行亲代和子代的个体识别，将样品中与亲本等位基因不符合的放流个体排除掉；

将与亲本等位基因相符的回捕样品利用第二组多重PCR得到的检测数据进行亲代和子代的识别，得到可疑的内标个体；

将与可疑的内标个体再利用第三组多重PCR的检测数据进行验证；确认回捕内标个体的准确性，以此推断检测样品的放流个体和数量。

优选的，所述三组荧光标记微卫星多重PCR个体识别技术包括第一组荧光标记微卫星四重PCR检测，第二组荧光标记微卫星四重PCR检测以及第三组荧光标记微卫星六重PCR检测；

第一组多重PCR引物组合为Pot07，Pot14，Pot17以及Pot42；

其中，Pot07-F及Pot07-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示；

Pot14-F及Pot14-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示；

Pot17-F及Pot17-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示；

Pot42-F及Pot42-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示；

第二组多重PCR引物组合为Pot08，Pot09，Pot18以及Pot25；

其中，Pot08-F及Pot08-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10所示；

Pot09-F及Pot09-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12所示；

Pot18-F及Pot18-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14所示；

Pot25-F及Pot25-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16所示；

第三组多重PCR引物组合为Pot34，Pot42，Pot44，Pot57，Ptr33a，Ptr95；

其中，Pot34-F及Pot34-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18所示；

Pot42-F及Pot42-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示；

Pot44-F及Pot44-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示；

Pot57-F及Pot57-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22所示；

Ptr33a-F及Ptr33a-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24所示；

Ptr95-F及Ptr95-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26所示。

优选的，第一组PCR引物Pot07，Pot14，Pot17以及Pot42荧光标记分别为6-FAM，HEX，TET，TAMRA；第二组PCR引物Pot08，Pot09，Pot18以及Pot25的荧光标记分别为6-FAM，HEX，TET，TAMRA；第三组PCR引物Pot34，Pot42，Pot44，Pot57，Ptr33a，Ptr95的荧光标记为6-FAM，TET，HEX，TAMRA，FAM，TET。

优选的，所述第一组四重PCR的反应体系为15μL，其中包括：10×PCR缓冲液1.5μL；Pot07正反引物每条各0.4μL，Pot14正反引物每条各0.5μL，Pot17正反引物每条各0.4μL，Pot42正反引物每条各0.3μL，引物浓度均为10pmol/μL；基因组DNA 50ng、250mmol/L dNTPs 0.375μL，2.0mmol/L Mg2+1.2μL，1UTaq DNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

优选的，所述第一组四重PCR的扩增程序为：94℃预变性10min后进行循环1，所述循环1的反应条件：94℃变性40s，62℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次；随后进行循环2：94℃变性40s，62℃退火1min，退火温度每个循环降低0.5℃，72℃延伸1min，循环进行12次；再进行循环3：94℃变性40s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次；最后72℃延伸10min，4℃保存并结束程序。

优选的，所述的第二组四重PCR的反应体系为15μL，其中包括：10×PCR缓冲液1.5μL；Pot08正反引物每条各0.4μL，Pot09正反引物每条各0.5μL、Pot18正反引物每条各0.4μL，Pot25正反引物每条各0.3μL，引物浓度均为10pmol/μL；基因组DNA50ng、250mmol/L dNTPs 2.5μL，2.0mmol/L Mg2+2.0μL，I U TaqDNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

优选的，所述第二组四重PCR的扩增程序为94℃预变性10min，94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存并结束程序。

优选的，所述的第三组六重PCR的反应体系为15μL，其中包括10×PCR缓冲液1.5μL；Pot34正反引物每条各0.4μL，Pot42正反引物每条各0.5μL，Pot44正反引物每条各0.4μL，Pot57正反引物每条各0.3μL，Ptr33a正反引物每条各0.2μL，Ptr95正反引物每条各0.1μL，引物浓度均为10pmol/μL；基因组DNA50ng，250mmol/L dNTPs 2.5μL，2.0mmol/L Mg2+2.0μL，I U Taq DNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

优选的，所述第三组六重PCR扩增程序为：94℃变性10min后进行循环1；所述循环1的条件为：94℃变性40s，52℃退火1min，72min延伸1min，共循环10次；随后进行循环2：94℃变性40S，51℃退火1min，退火温度每个循环降低0.5℃，72℃延伸1min，共循环4次；再进行循环3：94℃变性40S，49℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

本发明进行个体准确追溯的原理是利用三疣梭子蟹同一家系内个体具备相同分子指纹图谱，在单一母本已知的情况下，同一家系个体可被精确识别的特点，结合三疣梭子蟹大规模多家系育苗，生产放流群体。秋汛回捕时，利用精确高效分子指纹图谱分析识别，从回捕样品中识别放流个体，计算放流个体数量和野生个体数量，从而达到精确评估放流回捕率。

本发明相对于现有技术所具备的有益效果在于：

1.本发明实现对一个地域所有放流群体母本精确选择，为放流后回捕个体的精确追溯奠定了基础。与现有技术相比的优势主要在于简化了放流群体的制备，即本发明仅需对生产放流苗种的三疣梭子蟹母本进行样本采集，并利用三组荧光标记微卫星多重PCR(两组四重，一组六重)对采集的放流样本进行亲子溯源分析，即可实现对放流三疣梭子蟹的跟踪识别。

2.本发明用于回捕个体的检测方法是通过三组三疣梭子蟹荧光标记微卫星多重PCR个体识别技术，利用分子指纹图谱分析，从回捕样品中识别放流个体，该标记为个体遗传物质，对于放流的任意规格三疣梭子蟹个体都能起到标识作用，且可以维系一生，不会对标记个体造成任何内在或物理损伤。并且在整个放流过程中，放流个体具备与其它个体相同的生活生态习性、相同的洄游路线，不会比其它个体具备更明显的生存/死亡优势；放流个体通过微卫星多重PCR技术可被迅速鉴别并与其它个体区分开来，可以用来对回捕样品中放流、野生群体数量及回捕率进行精确计算；且标识个体放流不会破坏或影响野生三疣梭子蟹群体资源结构。因此本发明的方法可以准确评估三疣梭子蟹的放流效果。

3.本发明在已知单一亲本的情况下，可以对回捕的三疣梭子蟹进行精确鉴定，省去了亲本培育的过程，节省了大量的人力、物力和财力。同时能够精确评估三疣梭子蟹放流效果评估，精确评估放流回捕率，推算野生群体资源量，制定科学的放流规划、有效促进野生三疣梭子蟹种群资源恢复。

4.本发明中的各个组的PCR引物扩增出的片段多态性高，且各组引物组合不会相互影响，不会产生引物二聚体及发卡结构，从而保证了每一组微卫星多重PCR的检测效果，使得检测结果更加的准确。

5.本发明依次通过三组多重PCR检测技术进行对放流个体进行精确的分子标记溯源分析，使得溯源结果更加准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为第一组四重PCR扩增结果的电泳图。

注：1-6对个体1的PCR扩增结果，其中1为pot09扩增结果，2为pot18的扩增结果，3为pot25的扩增结果；4为pot 9，pot18，pot25三重引物的扩增结果，6为pot 8的扩增结果，5为pot 8，pot09，pot18，pot25四重引物的组合；7-12为对个体2的扩增结果，其中7为pot09扩增结果，8为pot18的扩增结果，9为pot25的扩增结果；10为pot09，pot18，pot25三重引物的扩增结果,12为pot08的扩增结果，11为pot08,pot09,pot18,pot25四重引物组合。M为DNA Maker II。

图2为六重PCR扩增结果的电泳图。

注：1-4为4个个体的六重PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M为MarkerMD206--pBR322DNA/MspI(天根生化有限公司)；

图3为第二组四重PCR扩增结果的电泳图；

注：1-4为4个个体的四重PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M为Marker。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1：标记放流种群及方法的确立

一、具有特定分子指纹图谱三疣梭子蟹家系个体的追溯

每对父母繁育的后代都有一致的DNA分子指纹，该分子指纹为个体/家系特有而区别于其它家系和个体且维系一生。利用这种特异性的分子指纹图谱，参照亲本基因型，即可从混合群体中准确识别出特定的个体/家系。

三疣梭子蟹微卫星在基因组中分布广泛，遗传变异水平丰富，具有遗传选择中性特点。微卫星分子标记不同基因型组合而形成的分子指纹图谱是进行个体/家系识别的理想工具。以实验室自主开发的三疣梭子蟹微卫星位点为例，大多数位点的等位基因数量在6-12个不等。在单一亲本已知的情况下，利用14对互不连锁的微卫星分子标记，每个位点的平均等位基因数目为8个，则理论上此四个微卫星组成的分子指纹图谱识别体系可以达到家系/个体排除率99.9999％的水平。也就是说，同一家系内的个体间其分子指纹图谱是一致的，而区别于其它个体的分子指纹图谱。

二、多家系放流种群的获得

每年春季放流苗种生产季节，海捕三疣梭子蟹经过暂养后，挑选已抱卵的三疣梭子蟹进行苗种培育，当幼体全部变态为Ⅱ期幼蟹时进行三疣梭子蟹苗种放流。

三、回捕、以及放流效果评估

秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞。每个样品取三疣梭子蟹大鳌肌肉采用常规酚/氯仿抽提方法进行DNA提取。然后样品回捕后通过三组三疣梭子蟹荧光标记微卫星多重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定三疣梭子蟹的放流效果。

三组三疣梭子蟹荧光标记微卫星多重PCR个体识别技术，分别为第一组四重PCR，第二组为四重PCR及第三组位六重PCR，第三组微卫星引物组合如表1所示。

其中，所述第一组四重PCR的反应体系为15μL，其中包括：10×PCR缓冲液1.5μL；Pot07正反引物每条各0.4μL，Pot14正反引物每条各0.5μL，Pot17正反引物每条各0.4μL，Pot42正反引物每条各0.3μL，引物浓度均为10pmol/μL；基因组DNA 50ng、250mmol/L dNTPs 0.375μL，2.0mmol/L Mg²⁺1.2μL，1U TaqDNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

第一组微卫星四重PCR引物的PCR扩增程序为：94℃预变性10min后进行循环1：94℃变性40s，62℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次；随后进行循环2：94℃变性40s，62℃退火1min，退火温度每个循环降低0.5℃，72℃延伸1min，循环进行12次；再进行循环3：94℃变性40s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次。最后72℃延伸10min，4℃保存并结束程序。

第二组四重PCR的反应体系为15μL，其中包括：10×PCR缓冲液1.5μL；Pot08正反引物每条各0.4μL，Pot09正反引物每条各0.5μL、Pot18正反引物每条各0.4μL，Pot25正反引物每条各0.3μL，引物浓度均为10pmol/μL；基因组DNA50ng、250mmol/L dNTPs 2.5μL，2.0mmol/L Mg²⁺2.0μL，I U Taq DNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

第二组微卫星四重PCR引物的PCR扩增程序为94℃预变性10min，94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存并结束程序。

第三组六重PCR的反应体系为15μL，其中包括10×PCR缓冲液1.5μL；Pot34正反引物每条各0.4μL，Pot42正反引物每条各0.5μL，Pot44正反引物每条各0.4μL，Pot57正反引物每条各0.3μL，Ptr33a正反引物每条各0.2μL，Ptr95正反引物每条各0.1μL，引物浓度均为10pmol/μL；基因组DNA50ng，250mmol/LdNTPs 2.5μL，2.0mmol/L Mg²⁺2.0μL，I U Taq DNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

第三组微卫星六重PCR引物的PCR扩增程序为：94℃变性10min后进行循环1：94℃变性40s，65℃退火1min，72min延伸1min，共循环10次；随后进行循环2：94℃变性40S，60℃退火1min，每个循环退火温度降低0.5℃，72℃延伸1min，共循环4次；再进行循环3：94℃变性40S，58℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

利用三组多重PCR个体识别技术的具体步骤为：三组PCR产物检测在ABI3730测序仪(Applied Biosystems,ABI,美国应用生物系统公司)上进行,利用其中的Genescan功能及Gene Maper软件进行基因型分析。将家系亲本及样品数据分别输入Cervus 3.0软件中进行亲本及子代个体识别，将第一组荧光标记检测中放流个体与亲本等位基因不相符的个体排除掉，与亲本等位基因相符的个体利用第二组荧光标记微卫星四重PCR体系再检测一次，其数据与母本数据分别输入Cervus 3.0软件中进行母本及子代个体识别，将可疑“内标个体”(即与母本等位基因相符的个体)再用第三组荧光标记进行验证，得到可疑“内标个体”等位基因信息，确认回捕“内标个体”的准确性。以此推断检测样品中放流个体及其数量。放流回捕率＝放流个体数量/样品总量(％)。

表1.三疣梭子蟹个体/家系识别所用微卫星引物组合及序列

实施例2：小规模的检测

2014年，在山东省潍坊市昌邑海丰水产养殖有限责任公司利用本发明方法进行放流的模拟实验。具体实施方式为：2014年8月，课题组采用三疣梭子蟹野生个体，构建全同胞家系6个，分别命名为家系A至家系F；2015年4月，亲蟹越冬排幼后，收集6个家系母本肌肉样品，保存-80℃冰箱；培育至Ⅱ期幼蟹，每个家系随机选取200个个体，与海丰公司培育的同规格6个家系，每个家系200个个体进行混养；至收获时，所有个体取大螯肌肉组织，提取DNA；采用表1所述三疣梭子蟹SSR引物组成三疣梭子蟹荧光标记微卫星多重PCR反应体系，PCR反应体系组成及扩增程序同实施例1。应用该微卫星多重PCR技术，结合家系亲本基因型数据，对6个混养家系个体进行了分子标记溯源分析。结果表明，经个体荧光标记验证，所有家系个体均可利用该微卫星多重PCR反应体系得到溯源。

技术指标：

三疣梭子蟹标记微卫星多重PCR技术的个体/家系识别率在99.9995％(母本本已知)以上；该技术可对每年1000个三疣梭子蟹全同胞家系亲本及其子代进行溯源追踪，也就是可以满足对我国每年10亿尾三疣梭子蟹放流群体进行跟踪之需及用于进行回捕率的精确估算；该技术不仅可以在单个放流地点进行放流跟踪，还可以在多地点同时进行放流个体跟踪和回捕率计算。

应用范围：

该技术主要应用于三疣梭子蟹放流实践中放流个体与野生个体的精确区分，进而实现对放流效果的精确评估。

此外，通过图1、图2和图3可以看出，多重PCR的引物所扩增出来的条带多态性高，且对个体可进行很好的区分，更有利于子代的溯源。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种三疣梭子蟹放流效果评估方法

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