原子治疗指标的制作方法

本发明涉及通过对样品的三维区域的体素中的锰进行量化来产生测试样品的原子治疗指标(ati)，其中通过坐标x'×y'×z以分区绘图的方式定义三维区域。ati被用于评估癌症(即，肿瘤/赘生物(neoplasm赘生物，肿瘤))的放射应答性(即，对放射治疗的敏感性或抗性)。在优选的实施方式中，本发明涉及产生ati的方法，基于ati以评估肿瘤/赘生物的放射应答性，并且基于该评估对肿瘤进行放射治疗或不进行治疗。

本发明还涉及确定癌症是否可能在放射治疗后复发的方法，该方法包括量化癌症测试样品的三维区域的体素中的锰含量，并且确定癌症中的高金属含量区域(hmr，highmetallomicregion)的频率，其中高频率的hmr指示癌症可能会复发，并且低频率的hmr指示癌症不太可能复发；和相关的治疗方法。

本发明进一步涉及确定黑素瘤的放射应答性的方法，该方法包括测定黑素瘤测试样品中的黑色素含量，其中黑色素含量越低，黑素瘤对放射越敏感，并且黑色素含量越高，黑素瘤对放射越具有抗性；和相关的治疗方法。

背景技术：

贯穿整个说明书对现有技术的任何讨论决不应该被认为是承认该现有技术是广泛已知的或者构成本领域公知常识的一部分。

美国有超过60％的患者在患病期间会接受放射治疗，并且这些60万名左右的个体将进行超过2亿次就诊进行放射治疗，每位患者将平均接受30次的出于治愈目的的体外放射治疗。在所有接受放射治疗的患者中，乳腺癌、肺癌和前列腺癌患者占50％以上(美国放射肿瘤协会，astro，2012)。

目前通过放射来治疗“癌症患者”或避免使用这种治疗方式的临床决策是基于对通常属于医疗“技术(art)”范畴的主观性、经验性和历史性经验的综合。治疗和管理决策最初涉及患者对以下各项情况的适应性：决定性手术、其年龄、心肺储备程度、确定的副发病变、肿瘤的病理级别和由各种成像方法(如mri、fmri、ct、超声、x射线、pet及其组合)确定的疾病阶段。根据病理学家解释的肿瘤细胞与正常细胞的形态偏差“看起来”是如何的，即肿瘤结构与正常组织的明显不同以及在微观领域内细胞分裂程度的不同，对肿瘤本身性质进行量化的度量数据很少。

更具体地，目前评估个体是否疑似患有需要进行治疗的肿瘤或癌症取决于对组织、器官样品或血液样品的病理性检查。仅基于病理结果即确定其后的治疗方案，是目前医学领域的一般做法。在美利坚合众国(美国)，超过60％的癌症患者接受某种形式的放射治疗，通常与涉及选定药物的手术和全身治疗结合，最近还与免疫治疗结合。关于患者是否应该或不应该接受放射的关键决策首要地依据于病理学家作出的报告(davidson和rimm；jama；313；1109-1110；2015.elmore等人,jama；313；1122-1132.2015)。这份报告是目前确定患者管理的基础，其通常是在放射肿瘤学家、医学肿瘤学家和外科医生参与的多学科环境中作出的。然而，如此关键重要的决策目前依赖于主要基于上述主观分析的病理学诊断，该病理学诊断涉及经过福尔马林固定的、石蜡包埋的和苏木精-伊红(h&e)染色的组织切片的细胞形态学和组织结构(例如，参见图1)。

病理学家之间关于诊断性解释的一致性是可变的，并且取决于所研究的肿瘤类型。对于非典型乳房增生的病例，一致性仅为48％(elmore等人，jama,313；1122-1132.2015)。例如，就甲状腺肿瘤而言，除了非常晚期的肿瘤之外，很难区分正常组织和“癌”组织。这种病理解释的主观性导致从放射治疗中获益甚微的那些患者被过度治疗，因而承受众所周知的危害，并导致那些本可以受益于放射疗法却没有得到治疗的患者治疗不足。为了避免法律问题，医生因谨慎而犯错，并且在没有任何有益的量化证据的情况下对许多患者进行放射，例如，相信在手术后，放射将使遗留在被切除肿瘤周围的边缘处的任何残留癌症细胞的影响最小化。由于即使一些放射敏感性细胞被杀死，而存活下来的肿瘤和基质细胞群被选定为具有甚至更强的放射抗性，因此，对于肿瘤和相关基质小生境具有一定程度放射抗性的那些患者来说，放射治疗是徒劳的。

医师通常依赖以证据为基础的临床决策支持性资源，如http://www.uptodate.com。该资源提供了多层次地控制癌症的放射治疗技术的临床总结，包括多种放射类型，如体外放射治疗、近距离放射治疗、术中放射治疗和靶向放射性核素治疗。

根据与卫生健康研究与质量机构(rhq)(美国，马里兰州，罗克维尔市)的合同(合同#290200710055i)，医疗保险和医疗补助服务中心(美国卫生和公众服务部的联邦机构)的覆盖和分析小组(coverageandanalysisgroup)要求了由塔夫茨循证实践中心的ip等人(2010)提供的针对前列腺癌的评估报告。该报告提出了针对患有局限性前列腺癌患者(t1和t2期)的不同放射治疗(如立体定向体部放射治疗、分次体外放射治疗和近距离放射治疗)的临床和生化结果的证据。体外放射治疗(ebrt)包括调强放射治疗、适形放射治疗、立体定向体部放射治疗、射波刀(cyberknife)和质子束放射治疗，近距离放射治疗包括放射性同位素“种子”及临时高剂量放射性种子的永久植入。

无论放射是基于光子还是质子的，且无论放射是经由直线加速器、伽马射线(来自钴-60源)或是经由放射性种子递送的，还评估了递送至患者的放射类型，该放射性种子包括用于低剂量率近距离放射治疗(ldrbt)的¹²⁵碘、¹³¹铯或¹⁰³钯；或¹⁹²铱(用于高剂量率近距离放射治疗(hdrbt))。评估还包括影响患者结果的参数，该参数包括放射性剂量、不良事件、治疗计划算法和分次递送的次数。

在任何试验中出现的证据力度方面，ip等人使用的用于评估各种临床试验的评级系统是主观的三级：高，中，低。

就不同放射治疗的益处与危害而言，结果如下所述。

就放射治疗的益处与危害与不进行放射治疗的益处与危害相比而言，经发现证据力度属于第3类-低。

在低剂量率近距离放射治疗与体外放射治疗相比时，经发现患者存活的证据力度为低。

在近距离放射治疗与体外放射治疗相比时，并且在高剂量率近距离放射治疗与低剂量率近距离放射治疗相比时，经发现生化控制的证据力度为低。

在低剂量率近距离放射治疗与体外放射治疗相比时，经发现泌尿生殖器毒性和胃肠毒性的证据力度为低。

经发现，多种组合疗法(ldrbt加ebrt)的证据力度为低。

对于立体定向体部放射治疗(sbrt)和ebrt伞的不同研究(即，膀胱和直肠毒性、免于生化紊乱和泌尿生殖器毒性或胃肠毒性)，经发现证据力度为低。

就放射性种子(¹²⁵碘和¹⁰³钯)比较而言，经发现低剂量率近距离放射治疗的证据力度为低。

经发现作为放射治疗结果促进因素的年龄、种族、民族、副发病变、与治疗有关的副作用和疾病进展对于患者基线风险的作用的证据力度为低。

ip等人(2010)的详细报告所得出的结论为，在两种研究最广泛的肿瘤类型(局限性前列腺和局限性乳房)之一中，对于t1或t2前列腺“癌症”的男性，与不进行治疗相比，放射治疗所带来益处的证据并没有揭示出对患者进行放射治疗的量化指标。此外，在研究内部和研究之间存在显著的多样性，这一大型评估的许多发现并不一致。

ip等人的报告指出，疾病进展到转移性状态的潜在风险在患者之间差异很大。无法客观确定进展风险意味着被认为处于“低”风险的患者被建议接受近距离放射治疗，而那些被认为处于“中等”风险的患者倾向于被给予体外放射治疗。

因此，迫切需要鉴别出具有有利于一种治疗方式(与其它治疗方式相比)的生物学参数的患者，例如有利于放射治疗的肿瘤特征，即与所患有的肿瘤更具有放射抗性的那些患者相比而言的患有对放射敏感的肿瘤的那些患者，因而应该放弃可能是无效且有害的放射治疗。

还需要鉴定生物学参数，该生物学参数可以有利于区分异常肿瘤细胞本身的特征、以及包埋这类异常细胞的基质和三维(3d)分布的特征。例如，异常细胞在基质组分中均匀分散的肿瘤与异常细胞与基质细胞极大分离的肿瘤大不相同。在前列腺癌的情况下，这两种情况都发生在腺体本身内异常细胞的不同病灶处，也发生在骨内的转移灶处。目前还没有外部成像方法(mri、ct或¹⁸fdg成像方法)可以可靠地识别这些不同的区域或其不同的特征。

迄今为止，还没有适合于对特定患者的给定肿瘤进行放射治疗的可用数据：目前数据没有坚实的量化基础。

仍然需要提供量化指标的测定法，该量化指标能够在对患者治疗(如是否对“癌症患者”进行放射治疗，或避免进行放射)进行适当决策时鉴定出样品中的生物学参数，例如放射敏感性或放射不敏感性/放射抗性。

本发明的目的是克服或改善现有技术治疗中的至少一个缺点或/和提供有用的替代方案。

技术实现要素：

本发明的发明人已经令人惊讶地发现，癌症中的锰含量可以被用作癌症放射应答性的指标。具体地，癌症中的锰含量越高，癌症对放射越具有抗性；并且癌症中的锰含量越低，癌症对放射越敏感。可以利用三维和二维分析的组合来最佳地确定癌症放射应答性。因此，在一方面，本发明提供了产生生物测试样品的原子治疗指标(ati)的方法，包括量化测试样品的三维区域的体素中的锰含量，其中该方法包括：

(a)选择所述测试样品的二维区域，其中由x':y'坐标系以分区绘图的方式定义二维区域，其中x'是二维区域的长度而y'是二维区域的宽度，其中三维区域对应于所述二维区域并具有由z表示的选定高度，其中三维区域被划分成预定义体积的体素，每个体素的体积由x×y×z定义，其中x是体素的长度，y是体素的宽度而z是体素的高度；

(b)量化每个体素中的锰含量；和

(c)计算选定体素中锰的集中趋势含量；

其中由选定体素中锰的集中趋势含量定义ati。

在另一方面，本发明提供了确定癌症放射应答性的方法，该方法包括产生根据本发明的测试样品的ati，其中ati越低，癌症对放射越敏感，而ati越高，癌症对放射越具有抗性。

在一个实施方式中，将ati与预先确定的ati阈值进行比较，其中通过评估ati是高于ati阈值还是低于ati阈值来确定癌症放射应答性，和

其中如果ati低于ati阈值，则癌症被确定为对放射敏感；和

其中如果ati高于ati阈值，则癌症被确定为对放射具有抗性。

在另一个实施方式中，将ati与预先确定的两个ati阈值进行比较，其中通过评估ati是高于两个阈值还是低于两个阈值来确定癌症放射应答性，和

其中如果ati低于较低的ati阈值，则癌症被确定为对放射敏感；

其中如果ati高于第二ati阈值，则癌症被确定为对放射具有抗性；和

其中如果ati在两个ati阈值之间，则癌症被确定为对放射部分敏感。

优选地，利用参考标准来对测试样品的体素中量化的锰含量进行校准，其中参考标准包括一个或多个参考体素，并且其中每个参考体素包含已知量的锰。

除了已知量的锰之外，参考标准可以包含允许将参考标准中锰的量与测试样品中锰的量(amount)或含量(或水平，level)进行比较的任何其它材料。优选地，参考标准是包含已知量的内源性锰或外源性锰的生物样品。生物样品可以包含人类或动物组织。

优选地，参考标准包含向其中添加了已知量的锰的动物组织(包括，例如哺乳动物或禽类物种)。本领域技术人员将会理解，具有精确限量化的锰的基质匹配的参考标准可用于计算校正因数-校准计数/秒以减轻日常信号可变性。在一个实施方式中，参考标准组织来源于鸡胸。

在一个实施方式中，在对测试样品进行量化时，或者与测试样品并行地量化时，同时地或以任何顺序依次地对一个或多个对照样品的三维区域中量化的锰含量进行量化。

在一个实施方式中，将对照样品添加到测试样品中用于分析。

优选地，集中趋势含量是中位数、算术平均数或众数。

本领域技术人员将会理解，测试样品可以是被染色的或未被染色的。优选地，选定体素是其中检测到癌细胞的体素。更优选地，通过目视检查测试样品的二维区域来检测癌细胞，该测试样品是被将癌细胞与其它细胞区分开的染色剂染色的。在通过目视检查测试样品(被将癌细胞与其它细胞区分开的染色剂染色的)的二维区域来检测癌细胞时，优选该染色剂是苏木精和曙红(h&e)。在一个实施方式中，通过将抗体、优选金属标记的抗体与癌细胞结合来检测癌细胞。

在本发明的上下文中，体素的长度x是在任何可测定的范围内，优选在约1微米至约200微米的范围内。在一些实施方式中，x选自约10至约50微米以及其间的任何值，并且优选x为约35微米。

在本发明的上下文中，体素的宽度y是在任何可测定的范围内，优选在约1微米至约200微米的范围内。在一些实施方式中，y选自约10至约50微米以及其间的任何值，并且优选y为约35微米。

在本发明的上下文中，z是在任何可测定的范围内，优选在约1微米至约20微米的范围内。优选地，z选自约1至约20微米以及其间的任何值，优选z为约1微米、或约2微米、或约3微米、或约4微米、或约5微米。

在优选的实施方式中，x、y和z分别选自约1至200微米、1至200微米和1至20微米的范围内以及在各范围之间的任何值。优选地，x、y和z分别为35微米、35微米和5微米。

在本发明的一个实施方式中，每个体素的预定义体积是在约1立方微米至约8×10⁵立方微米、或约1立方微米至约10,000立方微米、或约2000立方微米至约8,000立方微米的范围内。在优选的实施方式中，预定义体积为约6,125立方微米。

可以利用任何元素分析技术来确定体素中的锰含量。优选地，元素分析技术是激光烧蚀-电感耦合等离子体-质谱(la-icp-ms)、激光烧蚀-飞行时间质谱(la-tof-ms)、电感耦合等离子体-发射光谱(icp-oes)、微波等离子体-原子发射光谱(mp-aes)、激光诱导击穿光谱(libs)、二次离子质谱(sims)或x射线吸收近边结构(xanes)、原子吸收光谱(aa)或x射线荧光(xrf)。

可以使用计算机辅助筛选技术来分析所获得的数据。例如，可以通过使激光横向光栅式扫描整个载玻片来对5微米的截面进行激光烧蚀，每次从顶部到底部光栅式扫描一个烧蚀轨道。可替换地，可以通过使激光从顶部到底部光栅式扫描整个载玻片来对5微米的截面进行激光烧蚀，每次横向光栅式扫描一个烧蚀轨道。例如，可以通过对整个测试样品和/或一个或多个对照的至少一个轨道进行激光烧蚀来产生根据本发明的ati，其中烧蚀轨道包括至少一个体素。在另一实例中，本发明的方法包括多于一个的烧蚀轨道和多个体素。

优选地，测试样品选自细胞、细胞群、一种或多种单细胞生物体、组织样品或其部分、器官样品或其部分、一种或多种获得/来源于原核生物或真核生物的细胞、细胞群及其相关的非细胞基质组分、赘生细胞或赘生细胞群、来自受试者的任何器官或组织的组织样品、肿瘤、固体肿块或“液体”细胞群，造血系统的任何癌症细胞(包括白血病细胞)、实体肿瘤的循环细胞衍生物，和已经发生转移的细胞或细胞群。

在另一方面，本发明提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包括对来自受试者的测试样品进行本发明的方法，并且如果癌症被确定为对放射敏感，则包括在治疗受试者体内的所述癌症时进行放射疗法。

在另一方面，本发明提供了治疗受试者体内癌症的方法，其包括对来自受试者的测试样品进行本发明的方法，并且如果癌症被确定为对放射具有抗性，则包括在治疗受试者体内的所述癌症时不进行放射疗法。

优选地，受试者包括正常人类或哺乳动物受试者、需要治疗或预防的正常人类或哺乳动物受试者、诊断为患有癌症的受试者、疑似具有癌症/赘生物的肿瘤/赘生物、因任何异常(包括任何癌症)而正在接受治疗和/或预防的受试者、已经接受了指示潜在病症的测试或扫描的无症状受试者、已经接受了指示潜在病症的测试或扫描的有症状受试者、正在接受临床治疗(包括癌症治疗)或以药物、化学疗法、免疫疗法、手术、放射或治疗装置的形式的临床干预的受试者、或尚未经受任何临床治疗的受试者。

优选地，对照样品包含或来源于细胞、细胞群、一种或多种单细胞生物、组织样品或其部分、器官样品或其部分、一种或多种获自/来源于原核生物或真核生物的细胞、细胞群及其相关的非细胞基质组分、赘生细胞或赘生细胞群、来自受试者的任何器官或组织的组织样品、肿瘤(其中例如，肿瘤是固体肿块或“液体”细胞群，包括白血病细胞在内的造血系统的任何癌症、实体肿瘤的循环细胞衍生物或已经发生转移的细胞或细胞群)。

在一个实施方式中，测试样品和/或对照样品包含或来源于乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌(包括精原细胞瘤)、淋巴瘤(包括b细胞淋巴瘤)、小细胞肺癌、脑癌(包括多形性成胶质细胞瘤)、间皮瘤、或黑素瘤的肿瘤/赘生物的细胞、细胞群或组织样品。

在另一方面，本发明提供了确定放射治疗后癌症复发的可能性的方法，包括：

(a)通过选择所述测试样品的二维区域来量化癌症测试样品的三维区域中的锰含量，其中由x':y'坐标系以分区绘图的方式定义二维区域，其中x'是二维区域的长度而y'是二维区域的宽度，其中三维区域对应于所述二维区域并具有由z表示的选定高度，其中三维区域被划分成预定义体积的三个或更多个体素，每个体素的体积由x×y×z定义，其中x是体素的长度，y是体素的宽度而z是体素的高度，并且量化每个体素中的锰含量；

(b)确定对应于体素的x和y坐标的二维区域中的高金属含量区域(hmr)，该高金属含量区域是锰含量比周围区域中的锰含量高的区域，由为数倍集中趋势或整数之间的任何近似值的统计学阈值实现；

其中hmr的频率越高，癌症复发的可能性越高，hmr的频率越低，癌症复发的可能性越低。

优选地，还确定被将癌细胞与基质组分区分开的染色剂染色的测试样品的二维区域中的hmr，并且优选地，染色剂是苏木精和曙红(h&e)染色剂。

在本发明的上下文中，放射应答性是放射治疗的敏感性/抗性的量度。

在一个实例中，如果测试样品的ati低于用对照样品(已知为对放射敏感的样品)获得的预先确定的阈值，则测试样品被确定为对放射治疗敏感。在另一实例中，如果测试样品的ati高于用对照样品(已知为对放射具有抗性的样品)获得的预先确定的阈值，则测试样品被确定为对放射治疗具有抗性。

在本发明的一个实施方式中，将ati等于或低于阈值下限的测试样品确定为对放射治疗敏感，并且将ati等于或高于阈值上限的测试样品确定为对放射具有抗性。

包含参考标准或对照样品的体素的体积可以与测试样品的体素的体积相同或不同。

在本文中，本发明进一步提供了根据本发明的方法，其中通过量化测试样品的多于一个三维区域中的锰含量来产生ati，并且计算所有三维区域中锰的集中趋势含量，从而产生进一步的ati。

在本文中，本发明进一步提供了根据本发明的方法，其中通过量化多于一个测试样品中的锰含量来产生ati，计算所有测试样品中锰的集中趋势含量，从而产生进一步的ati。

在本文中，本发明进一步提供了根据本发明的方法，其中在测试样品被量化时、或者与所述测试样品并行地量化时，同时地或以任何顺序依次地对对照样品的三维区域中量化的锰含量进行量化。

还可以设想，可以将对照样品添加到测试样品中用于分析。

原子治疗指标(ati)可以以任何单位表示。例如，可以将其表示为校准计数/秒(cc/s)或等同的比例浓度单位，如微克/克、毫克/千克、百万分之一、微克/体素、毫克/体素、摩尔或摩尔/体素。

在本发明之前，没有人意识到可以将对放射敏感的样品(例如，细胞/组织、赘生细胞/肿瘤)的ati与对放射具有抗性的样品(例如，细胞/组织、赘生细胞/肿瘤)的ati区分开。这种量化区分使得能够确定给定的经过选择细胞、组织样品或其部分、赘生细胞或肿瘤样品或其部分的放射应答性(即，确定放射敏感性和/或放射抗性)。对本领域技术人员明显地是，术语“细胞”包括赘生细胞，并且术语“组织样品或其部分”包括肿瘤样品或其部分。如在本文中所使用的，术语“赘生/赘生的”包括导致激发细胞异常生长(无论是癌前期还是癌性的)的潜能的细胞内的任何变化。

如在本文中使用的，术语“肿瘤”包括但不限于在该小生境中的一种或多种赘生细胞和/或其相关的基质组分的集合。例如，在前列腺癌转移至骨的情况下，在本发明之前所使用的一种放射治疗是使用²²³镭，其优选靶标为羟磷灰石(ca5(po4)3oh)，一种主要的骨组分。²²³镭高效地“归巢(home)”至骨。在前列腺、乳房或任何其它的癌细胞转移到骨时，癌细胞会与羟磷灰石混合。短程α-粒子的释放破坏成骨细胞，但不直接影响癌细胞本身。因此，在这种情况下，由基质(成骨细胞)所产生的抑制因子(通常允许前列腺癌细胞在该小生境中生长)被破坏，因而癌细胞也不能生长，患者的存活率增加。因此，本领域技术人员将会理解，不同的基质小生境以不同程度支持癌细胞，并且这些小生境本身也可以具有不同的金属含量，从极高到极低，且还可以是对射线敏感的或对射线具有抗性的。因此，在对“肿瘤”施加放射时，存在四种边界情况-类型的可能性。如果基质和癌细胞都具有放射抗性，则放射对“肿瘤”是无效的，肿瘤还可以进一步生长。如果基质和癌细胞都是对放射敏感的，那么肿瘤就会停止生长。如果基质细胞是对放射敏感的，并且癌细胞具有放射抗性，则放射会有效地杀死基质细胞，肿瘤细胞也会停止生长(由于现在它们得不到来自其基质的代谢/因子的支持，因而肿瘤不会生长)。如果基质细胞具有放射抗性，并且癌细胞是放射敏感的，则肿瘤停止生长。因此，本领域技术人员将理解，术语“肿瘤或其部分”包括其完全多样性(血管、浸润和驻留的免疫细胞、成纤维细胞、周细胞和浸润的外来体)的肿瘤细胞和/或相关的基质细胞。

根据本文描述的任何方面、实施方式或实例，确定所选定三维区域中的锰含量包括但不限于直接测定测试样品、参考标准和/或对照样品(例如，细胞、组织样品或其部分、赘生细胞、肿瘤样品或其部分)。在一个实例中，可以在其自然环境中直接处理测试样品和/或对照样品，例如根据已知的方法，直接扫描并量化测试样品和/或对照样品的选定三维区域中的锰含量。在另一实例中，包含或来源于例如细胞、组织样品或其部分、赘生细胞、肿瘤样品或其部分的测试样品和/或对照样品被制备用于显微镜检查或根据已知方法通过机器扫描进行自动分析。可以将细胞、组织样品或其部分、赘生细胞、肿瘤样品或其部分快速冷冻、或经过福尔马林固定并石蜡包埋，或者将一个或多个细胞以单层或近单层沉积在显微镜载玻片上，例如，通过surepath类系统。还可以处理组织/肿瘤样品或其部分，由此从其获得细胞或细胞群，并且例如通过surepath样系统，将其以单层或近单层沉积在显微镜载玻片上。然后根据已知方法处理细胞、组织样品或其部分、赘生细胞、肿瘤样品或其部分的切片，以制备用于显微镜检查或通过机器扫描进行自动分析的切片。任选地，用h&e染色剂和/或特异性抗体对一个或多个切片进行染色以使得感兴趣的形态学方面可视化。在一个实例中，将一个或多个按顺序的切片固定，并不进行染色而直接用于测定根据本发明的锰含量。在另一实例中，按顺序地制备一个或多个切片(例如，匹配的)，并且用h&e染色剂和/或特异性抗体将至少一个切片进行染色以使得感兴趣的形态学方面可视化，并且同时制备染色的切片和非染色的切片，例如，制备按顺序的切片，其中可以将至少一个切片按照本文所述的进行染色，并且至少一个切片是未染色的。可以首先将染色的切片可视化，然后直接用于测定根据本发明的锰含量，或者根据本领域的标准方法制备染色的切片，并由病理学家进行可视化以确定形态学方面，并且选择匹配的未染色的切片(例如，按顺序的切片)并且用于测定根据本发明的锰含量。

通过本领域已知的任何方法测定根据本发明的锰含量，使得能够通过x':y':z坐标系以分区绘图的方式定义所选择的三维区域并将其划分成预先确定体积的体素。例如，测定预定义体积的体素中的锰含量，并且对于参考标准或对照样品可以使用相同或不同的预定义体积。

本领域技术人员将理解，可以获得包括多于一个体素的多个烧蚀轨道的ati。例如，烧蚀轨道的数量可以是能够被处理的任何数量，并且包括但不限于约1至100个烧蚀轨道。在一个实例中，烧蚀轨道的数量至少为3。烧蚀轨道的长度也可以变化，并且包括根据本发明的任何数量的体素。

本领域技术人员将理解，体素的数量将基于体素大小而变化。例如，轨道长度可以是所使用的仪器允许的任何长度。在一个实例中，轨道长度可以在0.5至1.0cm之间。在另一实例中，轨道长度为约5.0cm，或者为约5.35cm。例如，其中每个体素为约35微米(长)×35微米(宽)×5微米(高)(体积为6,125立方微米)的单个轨道基于5.35cm的轨道长度将产生用于分析的约1,500个体素。还预期根据本发明，根据本文的任一方面、实施方式或实例，一个或多个样品区域被烧蚀以产生ati。例如，本领域技术人员将理解，病理学家通常使用1mm×1mm的面积来测定载玻片上的有丝分裂速率，并且根据本发明也可以烧蚀该区域。在这个实例中，该区域对应于约30个体素×30个体素的面积，其中每个体素是约35微米(长度)×35微米(宽度)×5微米(高度)，体积为6,125立方微米。还进一步设想了，定义用于分析的最小面积将取决于检测方法的灵敏度。例如，面积的大小可以从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个等连续的体素变化到一个整数，该整数是选择用于分析该特定肿瘤的样品大小的。本领域技术人员将理解，根据本发明的面积大小是在使用现有技术可测定的任何范围内。

还应该理解，可以对根据本发明确定的锰含量进行背景校正。例如，在激光烧蚀质谱法的情况下，可以将不含测试样品和/或对照样品的区域用于背景校正。例如，可以直接地激光烧蚀载玻片上的测试样品和/或对照样品，并将载玻片上不含测试样品和/或对照的区域背景用于背景校正。

在一个或多个实施方式中，将背景校正设定为允许特别高的金属含量的区域显示出来的水平。这些区域被称为高金属含量区域(hmr)。

本领域技术人员将理解，根据本发明的测试样品、参考标准和/或对照样品的体素是在使用相关技术可测定的任何范围内。例如，x是在可测定的任何范围内，并且如上所述，优选地在约1微米至约200微米的范围内以及两者之间的任何值。在一个实例中，x选自约10微米至约50微米以及两者之间的任何值。优选地，x为约35微米。例如，y是在可测定的任何范围内，并且优选在约1微米至约200微米的范围内以及两者之间的任何值。在一个实例中，y选自约10微米至约50微米以及两者之间的任何值。优选地，x为约35微米。例如，z是在可测定的任何范围内，并且优选在约1微米至约200微米的范围内以及两者之间的任何值。在一个实例中，z选自约1微米至约20微米以及两者之间的任何值。优选地，z为约1微米、或约2微米、或约3微米、或约4微米、或约5微米、或约6微米、或约7微米、或约8微米、或约9微米、或约10微米。本领域技术人员将理解，x'和y'坐标定义了测试样品的选定的二维区域，并且z代表了测试样品的厚度。因此，如上所述，根据本发明的体素，例如，x×y×z，包括但不限于，选自约1至200:1至200:1至20立方微米以及其间任何值的范围。例如，x值约为1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、21微米、22微米、23微米、24微米、25微米、26微米、27微米、28微米、29微米、30微米、31微米、32微米、33微米、34微米、35微米、36微米、37微米、38微米、39微米、40微米、41微米、42微米、43微米、44微米、45微米、46微米、47微米、48微米、49微米、50微米、51微米、52微米、53微米、54微米、55微米、56微米、57微米、58微米、59微米、60微米、61微米、62微米、63微米、64微米、65微米、66微米、67微米、68微米、69微米、70微米、71微米、72微米、73微米、74微米、75微米、76微米、77微米、78微米、79微米、80微米、81微米、82微米、83微米、84微米、85微米、86微米、87微米、88微米、89微米、90微米、91微米、92微米、93微米、94微米、95微米、96微米、97微米、98微米、99微米、100微米、101微米、102微米、103微米、104微米、105微米、106微米、107微米、108微米、109微米、110微米、111微米、112微米、113微米、114微米、115微米、116微米、117微米、118微米、119微米、120微米、121微米、122微米、123微米、124微米、125微米、126微米、127微米、128微米、129微米、130微米、131微米、132微米、133微米、134微米、135微米、136微米、137微米、138微米、139微米、140微米、141微米、142微米、143微米、144微米、145微米、146微米、147微米、148微米、149微米、150微米、151微米、152微米、153微米、154微米、155微米、156微米、157微米、158微米、159微米、160微米、161微米、162微米、163微米、164微米、165微米、166微米、167微米、168微米、169微米、170微米、171微米、172微米、173微米、174微米、175微米、176微米、177微米、178微米、179微米、180微米、181微米、182微米、183微米、184微米、185微米、186微米、187微米、188微米、189微米、190微米、191微米、192微米、193微米、194微米、195微米、196微米、197微米、198微米、199微米、或200微米或整数之间的任何近似值。例如，y值约为1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、21微米、22微米、23微米、24微米、25微米、26微米、27微米、28微米、29微米、30微米、31微米、32微米、33微米、34微米、35微米、36微米、37微米、38微米、39微米、40微米、41微米、42微米、43微米、44微米、45微米、46微米、47微米、48微米、49微米、50微米、51微米、52微米、53微米、54微米、55微米、56微米、57微米、58微米、59微米、60微米、61微米、62微米、63微米、64微米、65微米、66微米、67微米、68微米、69微米、70微米、71微米、72微米、73微米、74微米、75微米、76微米、77微米、78微米、79微米、80微米、81微米、82微米、83微米、84微米、85微米、86微米、87微米、88微米、89微米、90微米、91微米、92微米、93微米、94微米、95微米、96微米、97微米、98微米、99微米、100微米、101微米、102微米、103微米、104微米、105微米、106微米、107微米、108微米、109微米、110微米、111微米、112微米、113微米、114微米、115微米、116微米、117微米、118微米、119微米、120微米、121微米、122微米、123微米、124微米、125微米、126微米、127微米、128微米、129微米、130微米、131微米、132微米、133微米、134微米、135微米、136微米、137微米、138微米、139微米、140微米、141微米、142微米、143微米、144微米、145微米、146微米、147微米、148微米、149微米、150微米、151微米、152微米、153微米、154微米、155微米、156微米、157微米、158微米、159微米、160微米、161微米、162微米、163微米、164微米、165微米、166微米、167微米、168微米、169微米、170微米、171微米、172微米、173微米、174微米、175微米、176微米、177微米、178微米、179微米、180微米、181微米、182微米、183微米、184微米、185微米、186微米、187微米、188微米、189微米、190微米、191微米、192微米、193微米、194微米、195微米、196微米、197微米、198微米、199微米、或200微米或整数之间的任何近似值。例如，z值约为1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、或20微米或整数之间的任何近似值。因此，所示每个x值中的任何一个可以与所示每个y值中的任何一个组合，然后该组合可以再与所示每个z值中的任何一个组合。还将理解的是，x、y和z的长度可以不相等。可替换地，x、y和z的长度可以相等。在另一实例中，x和y的长度相等，而z的长度与x和y不相等。在另一实例中，x和z的长度相等，而y的长度与x和z不相等。优选地，x和y的长度相等。例如，体素为约1×1×1立方微米、或约5×5×1立方微米、或约10×10×1立方微米、或约15×15×1立方微米、或约20×20×1立方微米、或约25×25×1立方微米、或约30×30××1立方微米、或约35×35×1立方微米、或约40×40×1立方微米、或约45×45×1立方微米、或约50×50×1立方微米、或约55×55×1立方微米、或约60×60×1立方微米、或约65×65×1立方微米、或约70×70×1立方微米、或约1×1×2立方微米、或约5×5×2立方微米、或约10×10×2立方微米、或约15×15×2立方微米、或约20×20×2立方微米、或约25×25×2立方微米、或约30×30×2立方微米、或约35×35×2立方微米、或约40×40×2立方微米、或约45×45×2立方微米、或约50×50×2立方微米、或约55×55×2立方微米、或约60×60×2立方微米、或约65×65×2立方微米、或约70×70×2立方微米、或约1×1×3立方微米、或约5×5×3立方微米、或约10×10×3立方微米、或约15×15×3立方微米、或约20×20×3立方微米、或约25×25×3立方微米、或约30×30×3立方微米、或约35×35×3立方微米、或约40×40×3立方微米、或约45×45×3立方微米、或约50×50×3立方微米、或约55×55×3立方微米、或约60×60×3立方微米、或约65×65×3立方微米、或约70×70×3立方微米、或约1×1×4立方微米、或约5×5×4立方微米、或约10×10×4立方微米、或约15×15×4立方微米、或约20×20×4立方微米、或约25×25×4立方微米、或约30×30×4立方微米、或约35×35×4立方微米、或约40×40×4立方微米、或约45×45×4立方微米、或约50×50×4立方微米、或约55×55×4立方微米、或约60×60×4立方微米、或约65×65×4立方微米、或约70×70×4立方微米、或约1×1×5立方微米、或约5×5×5立方微米、或约10×10×5立方微米、或约15×15×5立方微米、或约20×20×5立方微米、或约25×25×5立方微米、或约30×30×5立方微米、或约35×35×5立方微米、或约40×40×5立方微米、或约45×45×5立方微米、或约50×50×5立方微米、或约55×55×5立方微米、或约60×60×5立方微米、或约65×65×5立方微米、或约70×70×5立方微米、或约1×1×6立方微米、或约5×5×6立方微米、或约10×10×6立方微米、或约15×15×6立方微米、或约20×20×6立方微米、或约25×25×6立方微米、或约30×30×6立方微米、或约35×35×6立方微米、或约40×40×6立方微米、或约45×45×6立方微米、或约50×50×6立方微米、或约55×55×6立方微米、或约60×60×6立方微米、或约65×65×6立方微米、或约70×70×6立方微米、或约1×1×7立方微米、或约5×5×7立方微米、或约10×10×7立方微米、或约15×15×7立方微米、或约20×20×7立方微米、或约25×25×7立方微米、或约30×30×7立方微米、或约35×35×7立方微米、或约40×40×7立方微米、或约45×45×7立方微米、或约50×50×7立方微米、或约55×55×7立方微米、或约60×60×7立方微米、或约65×65×7立方微米、或约70×70×7立方微米、或约1×1×8立方微米、或约5×5×8立方微米、或约10×10×8立方微米、或约15×15×8立方微米、或约20×20×8立方微米、或约25×25×8立方微米、或约30×30×8立方微米、或约35×35×8立方微米、或约40×40×8立方微米、或约45×45×8立方微米、或约50×50×8立方微米、或约55×55×8立方微米、或约60×60×8立方微米、或约65×65×8立方微米、或约70×70×8立方微米、或约1×1×9立方微米、或约5×5×9立方微米、或约10×10×9立方微米、或约15×15×9立方微米、或约20×20×9立方微米、或约25×25×9立方微米、或约30×30×9立方微米、或约35×35×9立方微米、或约40×40×9立方微米、或约45×45×9立方微米、或约50×50×9立方微米、或约55×55×9立方微米、或约60×60×9立方微米、或约65×65×9立方微米、或约70×70×9立方微米、或约1×1×10立方微米、或约5×5×10立方微米、或约10×10×10立方微米、或约15×15×10立方微米、或约20×20×10立方微米、或约25×25×10立方微米、或约30×30×10立方微米、或约35×35×10立方微米、或约40×40×10立方微米、或约45×45×10立方微米、或约50×50×10立方微米、或约55×55×10立方微米、或约60×60×10立方微米、或约65×65×10立方微米、或约70×70×10立方微米。优选地，体素是35×35×5立方微米。

本领域技术人员还将理解，参考标准和一个或多个对照样品的体素可以具有任何尺寸。如上所述，一个或多个参考标准和一个或多个对照样品可以与测试样品具有相同的体积，或者它们可以具有不同的体积，并且本领域技术人员将理解，比较测试样品、一个或多个参考标准和一个或多个对照样品所进行的计算需要考虑到测试样品、参考标准和对照样品之间体积的任何变化。因此，如本文所述，预定义的体素包括但不限于约1立方微米至约8×10⁵立方微米的范围。例如，预定义体素在约1立方微米至10,000立方微米、或约10,000至100,000立方微米、或约100,000至800,000立方微米的范围内。在一个实例中，预定义体素为约1立方微米至10,000立方微米、或约2,000立方微米至约8,000立方微米。在另一实例中，体素为约6,125立方微米。

病理形貌和原子形貌之间的二维(2d)映射显示了锰的相对丰度。

根据本发明的任何方面、实施方式或实施例的方法可选地包括从受试者获得测试样品或获得来源于受试者的测试样品的步骤。例如，样品是从“受试者”、“参与者”或“患者”(在此称为“受试者”)获得的。样品可以来自于受试者的组织或器官。如根据本发明的任何方面、实施方式和/或实例所描述的受试者包括但不限于任何正常的人类或哺乳动物受试者、或需要根据本发明描述的任何治疗或预防的任何人类或哺乳动物受试者。受试者包括被诊断为患有癌症或根据本发明描述的任何形式的癌症或赘生物、或者疑似患有癌症或根据本发明描述的任何形式的癌症或赘生物的受试者。本领域技术人员还将理解，受试者可以正在接受针对任何异常(包括任何癌症)的治疗和/或预防。受试者可以是无症状的，但已经接受了指示潜在病症的测试或扫描，或者也可以是有症状的。受试者包括正在接受临床治疗(包括癌症治疗)或者以药物、化学疗法、免疫疗法、手术、放射或治疗装置的形式的临床干预的患者，或尚未接受任何临床治疗的患者。哺乳动物受试者包括但不限于猿、大猩猩、黑猩猩、濒危物种、牲畜(例如，牛、猪、马和宠物，例如狗和猫)。

根据本发明的对照样品可以是任何合适的样品并且优选是生物样品。例如，对照样品可以包括或来源于细胞、细胞群、一种或多种单细胞生物、组织样品或其部分、器官样品或其部分、一种或多种获得/来源于原核生物或真核生物的细胞、细胞群及其相关的非细胞基质组分、赘生细胞或赘生细胞群、来自受试者的任何器官或组织的组织样品、肿瘤(其中例如，肿瘤是固体肿块或“液体”细胞群，例如包括白血病细胞在内的造血系统的任何癌症、实体肿瘤的循环细胞衍生物、或细胞衍生物(如外来体，包括但不限于，已经发生转移的细胞或细胞群))。优选地，对照样品包括或来源于细胞，细胞群，“正常”组织样品，睾丸癌(例如，精原细胞瘤)、淋巴瘤(例如b细胞淋巴瘤)、小细胞肺癌、脑癌(例如，多形性成胶质细胞瘤/星形细胞瘤)、间皮瘤、黑素瘤和乳腺癌和前列腺癌的肿瘤/赘生物组织样品。

在另一方面，本发明提供了确定在进行放射治疗后可能复发的癌症的方法，其包括：

(a)通过选择所述测试样品的二维区域来量化癌症测试样品的三维区域中的锰含量，其中由x':y'坐标系以分区绘图的方式定义二维区域，其中三维区域对应于所述二维区域并具有由z表示的选定高度，其中三维区域被划分成预定义体积的三个或更多个体素，每个体素的体积由x×y×z定义；

(b)测定每个体素中锰的集中趋势含量；

(c)确定对应于体素的x和y坐标的二维区域中的高金属含量区域(hmr)，该高金属含量区域是锰含量比周围区域中的锰含量高的区域，由为数倍集中趋势或整数之间的任何近似值的统计学阈值实现；

其中在hmr的频率较高时，指示经过放射治疗后的癌症有复发的可能性，而其中在hmr的频率较低时，指示经过放射治疗后的癌症不再复发的可能性。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的方法，其中还确定了在测试样品的相应二维区域中的hmr，利用将癌细胞与其它细胞区分开的染色剂对该测试样品染色，优选苏木精和曙红(h&e)染色剂。

在另一方面，本发明提供了确定肿瘤放射应答性的方法，该方法包括测定肿瘤测试样品中的黑色素含量，其中黑色素含量越低，肿瘤对放射越敏感，黑色素含量越高，肿瘤对放射越具有抗性。

根据本发明的任何方面、实施方式或实施例的方法或用途可选地包括从受试者获得对照样品或获得来源于受试者的对照样品的步骤。例如，对照样品是从“受试者”、“参与者”或“患者”(在此称为“受试者”)的组织或器官获得的。如根据本发明的任何方面、实施方式和/或实施例所描述的受试者包括但不限于任何正常的人类或哺乳动物受试者、或需要根据本发明描述的任何治疗或预防的任何人类或哺乳动物受试者。受试者包括被诊断为患有癌症或根据本发明描述的任何形式的癌症或赘生物/肿瘤、或者疑似患有癌症或根据本发明描述的任何形式的癌症或赘生物/肿瘤的受试者。本领域技术人员还将理解，受试者可以正在接受针对任何异常(包括任何癌症)的治疗和/或预防。受试者可以是无症状的但已经接受了指示潜在病症的测试或扫描，或者也可以是有症状的。受试者包括正在接受临床治疗(包括癌症治疗)或者以药物、化学疗法、免疫疗法、手术、放射或治疗装置的形式的临床干预的患者，或者尚未接受任何临床治疗的患者。哺乳动物受试者包括但不限于猿、大猩猩、黑猩猩、濒危物种、牲畜(例如，牛、猪、马和宠物，例如狗和猫)。对照样品也可以是从其它物种获得的，包括但不限于禽类，如鸡、鸭或鹅。

本领域技术人员将理解，在本文中所描述的任何方面、实施方式或实施例中，设想了所有类型的放射，例如基于光子或质子的γ射线、α射线、β射线。设想了使水电离的任何类型的放射，而无论任何其它的主要影响怎样。例如，¹³¹碘，用于内部照射甲状腺的罕见肿瘤，或者通过使用放射活性的¹⁰³钯或¹²⁵碘而插入的前列腺癌种子进行近距离放射治疗，全部通过低能量x射线引起水的放射性分解；或者二氯化²²³镭，用于骨损伤转移，其经由α粒子辐射。同样高剂量的近距离放射治疗(包括临时插入含有¹⁹²铱的针)是以完全相同的机制进行操作的。不受任何特定理论的限制，虽然dna修复一直是本领域的焦点，但是人们认为蛋白质损伤可能是主要因素，而dna问题可能是次要的。各种破坏性离子通过破坏蛋白质而使细胞受到严重破坏。

集中趋势的常用度量是中位数、算术平均数和众数。也可以使用本领域已知的任何其它的集中趋势度量，包括但不限于几何平均数，中位均值(medimean)、缩尾k次均值(winsorizedk-timesmean)、k次截尾均值(k-timestrimmedmean)和加权平均数，并且也可以在计算集中趋势之前将数据进行转换。

在本发明之前，人们还尚未认识到锰的临床重要性，并且也尚未对锰进行量化以便确定测试样品的放射敏感性/放射抗性而作出关于放射治疗的临床决策。

应该理解的是，在本文中所使用的“放射敏感性”或“对放射敏感的”是指杀死细胞或使其无活性的，使得细胞在暴露于放射时不会进一步分裂。如在本文中所使用的“放射抗性”或“对放射具有抗性”是指一种或多种细胞在经过放射治疗之后仍然保持存活并且仍能够进行分裂以允许存活的肿瘤和基质细胞重新填充经过照射的部位，这将表示如果用放射进行治疗，受试者体内的原发性肿瘤或其转移性衍生物仍然能够生长和/或发生进一步的转移。

应理解的是，可以将测试样品中的锰含量与一个或多个参考标准物中的锰含量进行比较以计算根据本发明的ati。

根据本发明使用的阈值ati在本领域技术人员选择用于分析的测试样品、参考标准和/或对照会是显而易见的。应该理解的是，一个或多个ati阈值可以是基于来源于一个或多个对照样品的已知或推导出的放射应答性cc/s含量，其中一个或多个对照样品与测试样品一样，都包含相同癌症类型的细胞。例如，如本文中的实施例所示的，可以将⁵⁵mn放射敏感性阈值设定为2k校准计数/秒(cc/s)，这适用于35×35×5立方微米的体素。基于70×70×5立方微米的体素，可以将相同的数值阈值设定为8kcc/s。例如，也可以将阈值设定为比用对放射敏感的对照样品所获得的集中趋势值(优选平均值或中位数)高出1个标准偏差，或高出1.1个、1.2个、1.3个、1.4个、1.5个、1.6个、1.7个、1.8个、1.9个、2.0个、2.1个、2.2个、2.3个、2.4个、2.5个、2.6个、2.7个、2.8个、2.9个、3.0个、3.1个、3.2个、3.3个、3.4个、3.5个、3.6个、3.7个、3.8个、3.9个或4.0个标准偏差，或整数之间的任何近似值。也可以通过不同肿瘤类型的经验确定来设定阈值。如本文中的实施例所示的，以黑素瘤为例，可以将阈值设定为高出集中趋势值(优选中位数或平均值)的1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍，2.3倍、2.4倍或2.5倍，或整数之间的任何近似值。本领域技术人员将理解，在大多数情况下，将考虑使阈值包括给定样品中的“背景”值。例如，将认为比预先确定的ati阈值(通过参考对放射敏感的对照的ati设定的)低的任何测试样品ati指示该测试样品源是对放射敏感的；并且将认为比预先确定的ati阈值(通过参考对放射具有抗性的对照的ati设定的)高的任何测试样品ati指示该测试样品源是对放射具有抗性的。

作为另一实例，由于图11中三种放射敏感型肿瘤(精原细胞瘤、淋巴瘤和小细胞肺癌)数值中的87％低于2k，因此可以用于测量放射应答性的一种预先确定的ati阈值为2kcc/s。图11中临床上被认为是对放射具有抗性的两种肿瘤类型(即，间皮瘤和脑癌)的数值中的86％高于2kcc/s。然而，本领域技术人员将理解，2k阈值在某些情况下是合适的，但是在其它情况下可能是不合适的，由于根据其它因素(如患者的遗传背景)而在患者之间会存在差异。因此，在某些情况下，可以将放射敏感阈值设定为3k。事实上，对于任何给定的结果，肿瘤学上所接受的临床阈值通常有两个。低于第一阈值表示一种肯定的结果，高于第二阈值表示另一种肯定的结果，而在这两个阈值之间是具有临床差异性的“中间区域”，并且在这种情况下结果会发生变化。对于图11中的数据，可以将两个阈值分别设定为3k和4k，而中间区域则为3k至4k。随着将可获得更多的金属数据和放射治疗数据，这些阈值将会变得更加清楚的。

本领域技术人员将清楚，本发明还可以用于确定具有极高金属含量(包括锰)的本发明三维区域内的体素。例如，还设想了，通过将体素的阈值设定为在相对高的水平时对于锰呈现为阳性，则可以确定高金属含量的区域。如本文中所使用的，在涉及高金属含量区域(hmr)中的特定金属时，将hmr分别命名为，例如hmr(⁵⁵mn)、hmr(⁶⁶zn)、hmr(⁵⁶fe)和hmr(⁶³cu)，hmr(^am)是指任一金属(anymetal)的常规情况。本领域技术人员将理解，任一金属的hmr(hmr(^am))将最低限度地包含两个相邻的体素以满足体素邻接的标准。hmr(^am)的大小可以从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个等连续的体素变化至一整数(为分析特定肿瘤而选择的样品大小)。

本领域技术人员将认识到，根据本发明的hmr(^am)的大小是在使用现有技术可测定的任何范围内。应该理解的是，如果将常规载玻片加载到肿瘤物质的边缘上可以被分析的最大数量将取决于所选定的体素大小。例如，基于35×35(长×宽)平方微米大小，hmr(^am)大小的范围可以从2个体素到约800,000个体素，以及两者之间的任何值。仅通过举例说明，如实施例中所示的，通过经验选择的8×8体素(二维上的35×35平方微米)有效地显示了高金属含量的区域。最小的含hmr的8×8体素区域在x'和y'方向上都是有界限的。因此，在对30×30个体素(二维上表示为1mm²)的样品取样时，hmr的大于x8×y8体素可以在x'和y'二维方向上分别以整数倍递增，产生x[8+1]×y[8]:x[8]×y[8+1]:x[8+1]×y[8+1]:x[8+2]×y[8]:x[8+2]×y[8+1]:x[8+2]×y[8+2]:x[8+1]×y[8+2]:x[8]×y[8+2]至x[8+n]×y[8+n]的hmr，其中n是整数，可以从1变化到数千，但是优选地从1到22。将认识到，可以将阈值设定为少于8个体素(最小值)。这里采用了值8，是因为它是用于hmr的经过经验所推导出的高效搜索工具。

本领域技术人员也将认识到，hmr可以应用于肿瘤癌细胞，或应用于通常称为相关基质(由于它与邻近癌细胞的相互作用，其本身可以是处于“激活”状态的)的细胞和非细胞物质的区域。

根据本发明实际给予的放射和/或抗癌疗法的量通常由医师根据相关情况(包括待治疗的病症)、以及其它因素(如化学疗法和免疫疗法，个体患者的年龄、体重和反应程度，患者症状/病症的严重程度等)来确定。放射治疗包括但不限于立体定向体部放射治疗、分次体外放射治疗和近距离放射治疗，体外放射治疗(ebrt)包括调强放射治疗、适形放射治疗、立体定向体部放射治疗、质子束放射治疗、伽玛刀和射波刀，并且近距离放射治疗包括放射性同位素“种子”及临时高剂量放射性种子的永久植入。递送给患者的放射类型可以是基于光子或质子的，并且可以通过线性加速器、γ射线(来自任何来源)、或经由放射性种子进行递送，该放射性种子包括¹²⁵碘、¹³¹铯和¹³³铯或¹⁰³钯(用于ldrbt)，或¹⁹²铱(用于高剂量率近距离放射治疗(hdrbt)，或⁹⁰钇树脂微球，或与硅微粒缀合的³²p。还可以通过下面列出的其它实体递送放射物(chellanandsadler,2015,phil.trans.r.soc,a.373:20140182)：例如，⁹be，与蛋白质结合作为免疫应答的新抗原刺激剂，用于与放射联合的免疫疗法；⁸⁹锶，用于成骨细胞性骨转移；²²³镭，用于治疗骨转移和去势难治性前列腺癌；⁴⁷钪和⁴⁴钪，作为治疗剂放射性核素；⁵⁹镍，与mhc和多肽的表面结合，用于引发t细胞的免疫应答；⁹⁰钇，靶向生长激素抑制素受体，用于癌症治疗；⁹⁶钼，作为钼酸盐用作脂质的预防性抗氧化剂，用于治疗乳腺癌和食管癌；¹⁰¹钌，通过血清转铁蛋白递送至癌细胞；¹⁰⁵铑，用于骨转移；¹⁰³钯，作为近距离放射治疗用于前列腺癌和脉络膜黑素瘤；¹⁷⁸铪，作为纳米球被肿瘤细胞有效摄取，并且强化其对软组织肉瘤和头颈癌的放射效果；¹⁸⁴钨，以钨氧簇合物作为抗癌剂；¹⁸⁸铼和¹⁸⁶铼，用于小细胞肺癌和前列腺癌；¹⁹⁰锇，作为超氧化物模拟物和有机锇芳烃复合物，作为抗癌药物；¹⁹⁵铂，用于癌症的化学疗法；¹⁵³钐，用于骨肉瘤和转移性乳腺癌骨转移；¹⁶⁶钬，用于内部放射治疗；¹⁷⁵镱标记的聚氨基膦酸盐，用于骨转移；¹⁷⁷镏标记的肽和抗体，用于小细胞肺癌；²²⁵锕，用于髓样癌及其衰变产物²¹³铋；含有²⁸硅的酞菁，作为光敏剂用于杀死癌细胞；产生²¹²铅的²¹²bi(²¹²leadgenerating²¹²bi)，用于与曲妥珠单抗(与her2结合，并在不同类型癌细胞的内化时传递放射物)联合进行放射免疫治疗；³²p，作为phosphocol，治疗不同类型的癌症；⁷⁵砷，作为as2o3，用于早幼粒细胞性白血病、不可切除的肝细胞癌和非小细胞肺癌；²¹³铋标记的林妥珠单抗，用于急性髓细胞性白血病的靶向放射治疗；⁷⁹硒，用于针对前列腺癌的化学保护；¹²⁷碘和¹³¹碘，用于甲状腺癌；和²¹¹砹，用于消除脑内肿瘤细胞和复发性卵巢癌的细胞。在另一实例中，这些物质包含放射增敏剂，例如但不限于硼(¹⁰b)、孟加拉玫瑰红(rosebengal)、2-脱氧-d-葡萄糖或与放射物组合的免疫治疗添加剂(sharabi等人，oncology[willistonpark]2015,29(5),pii:211304；formenti,jnatlcancerinst105,256-265,2013)。

在本发明的上下文中，术语“x'×y'×z”中的字母x'、y'和z是指样品的“三维区域”的尺寸，并且“x'×y'×z”涉及组成三维区域体积的三维区域的长度×宽度×高度。

在本发明的上下文中，术语“x×y×z”中的字母x、y和z是指样品的“三维区域”内体素的尺寸，并且“x×y×z”涉及组成体素体积的体素的长度×宽度×高度。

因此，在本发明的上下文中，在出现如术语“35×35×5”时，它们涉及长度×宽度×高度，并给出测定的体积；而在出现术语“35×35”时，它们是指长度×宽度，并给出一面积(2d)。

在另一方面，本发明提供了确定黑素瘤的放射应答性的方法，该方法包括测定黑素瘤测试样品中的黑色素含量，其中测试样品中的黑色素含量越低，则黑素瘤对放射越敏感，而测试样品中的黑色素含量越高，则黑素瘤对放射越具有抗性。

在另一方面，本发明提供了确定黑素瘤的放射应答性的方法，该方法包括将黑素瘤测试样品中的黑色素含量与预先确定的黑色素阈值进行比较，其中通过评估测试样品中的黑色素含量是高于还是低于黑色素阈值来确定黑素瘤的放射应答性，

其中如果测试样品中的黑色素含量低于黑色素阈值，则确定黑素瘤对放射敏感；和

其中如果测试样品中的黑色素含量高于黑色素阈值，则确定黑素瘤对放射具有抗性。

在一个或多个实施方式中，将测试样品中的黑色素含量与预先确定的两个黑色素阈值进行比较，其中通过评估测试样品中的黑色素含量是高于还是低于这两个黑色素阈值来确定黑素瘤的放射应答性，

其中如果测试样品中的黑色素低于较低的黑色素阈值，则确定黑素瘤对放射敏感；

其中如果测试样品中的黑色素高于较高的黑色素阈值，则确定黑素瘤对放射具有抗性；和

其中如果测试样品中的黑色素在两个黑色素阈值之间，则确定黑素瘤对放射部分敏感。

设定预先确定的黑色素阈值完全在本领域技术人员的能力范围内。可以通过将金属标记的黑色素抗体结合至经由任何形式的元素分析法(如la-icp-ms)烧蚀的切片来首先确定含有黑色素含量的体素，同时地测定该体素中⁵⁵mn的含量。如果体素含有的黑色素含量超过施加相同金属标记抗体的无黑素性的黑素瘤样品的阈值水平，则该体素是能够提供信息的。测试样品中具有黑色素的体素的百分数以及该体素的加权中位数为放射防护指数。本领域技术人员将意识到，在集中趋势方面，可以以与ati相同的常规方式设定黑色素阈值，优选为以合适单位表示的中位数或平均值。还应该意识到，可以同时地对用于分析黑色素的相同体素进行⁵⁵mn测定。

例如，可以将阈值设定为对放射治疗具有不同反应(即，一些细胞对放射敏感，而另一些细胞对放射具有抗性)的队列的黑素瘤细胞中黑色素含量的平均值或中位数。可替换地，可以设定两个阈值，在这种情况下，例如，可以将它们设定为与一组对放射治疗具有不同反应的黑素瘤细胞(例如，对放射具有抗性的黑素瘤细胞与对放射敏感的黑素瘤细胞数量相等的队列)中的黑色素含量的平均值相差一个或两个标准偏差。

在另一方面，本发明提供了治疗受试者体内黑素瘤的方法，其包括对来自受试者的测试样品进行本发明的方法，并且如果确定黑素瘤是对放射敏感的，则包括在治疗所述受试者体内黑素瘤过程中进行放射治疗。

在另一方面，本发明提供了治疗受试者体内黑素瘤的方法，其包括对来自受试者的测试样品进行本发明的方法，并且如果确定黑素瘤是对放射具有抗性的，则包括在治疗所述受试者体内黑素瘤过程中不进行放射治疗。

除非在上下文中清楚地要求，否则贯穿整个说明书和权利要求书，词语“包括(comprise)”、“包含(comprising)”等将被解释为包含性的意义，而不是排他性的或穷举的意义；也就是说，表示为“包括但不限于”。

贯穿整个说明书，除非另外特别指出或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组应该被当作包括一个和复数个(即，一个或多个)的这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组。

除非另有特别说明，否则在本文中描述的本发明的方面、实施方式和/或实施例中的每一个均应加以必要的修正而适用于方面、实施方式和/或实施例中的每一个。

本领域技术人员将会理解，除了具体描述的那些以外，在本文中所描述的本发明易于进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这些变体和修改。本发明还包括在本说明书中单独地或共同地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任一和全部的组合或任何两个或更多个。

本发明在范围上不受在本文中描述的具体实施方式的限制，而该具体实施方式仅仅是为了举例说明的目的。如本文所描述的，功能上等同的产物、组合物和方法显然是在本发明的范围内。

本领域技术人员将认识到，本发明的方法在临床治疗内容方面不是常规的或传统的。目前并不存在本发明所提供的精确性。例如，基于la-icp-ms以区分肿瘤类型(特别是举例说明的八种肿瘤类型)是全新的发明内容；发明结果是出乎意料的，并且不能从现有技术中预测到。

附图说明

图1：一名48岁男性颈部ib期恶性黑素瘤的经过福尔马林固定和石蜡包埋(ffpe)块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，tnm分期标准为t2an0m0，其中t2表示固有肌层的侵袭；n0表示无淋巴结转移，m0表示无远处转移。注意到，该切片的右上角部分由苍白的非黑色素肿瘤细胞组成，而图的左侧和底部的深色区域由含有染色较深的黑色素的细胞组成，并且如图片下部的黑色斑点表示的，是细胞内和细胞外的较大黑色素块。

图2：三种不同的锰基结合实体的图解。应该指出的是，单个⁵⁵mn²⁺不能与所有三个实体同时结合(该图片仅仅是为了举例说明的目的-节选自slade和radman，microbiologyandmolecularbiologyreviews,75,133-191,2011)。

图3：a.一名50岁人类女性的正常人类皮质块的h&e染色的5微米组织切片的照片图像，其显示出正常皮质组织的特征。该图像举例说明了三轨道烧蚀(获得于较大的多轨道组织烧蚀)的位置，该烧蚀是在同一皮质块的相邻未染色切片上进行的，但在不同的载玻片上进行。图中所示的h&e染色区域相当于在不同载玻片上的由la-icp-ms分析得到的等同的未染色区域。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有70个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.原始数值(来自图3b)的图表表示，其中针对三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，每个轨道由70个以校准计数/秒表示的体素组成。

图4：a.一名患有脑肿瘤(分类为多形性成胶质细胞瘤)的19岁人类女性的h&e染色的5微米组织切片的照片图像。图中所示的h&e染色区域相当于在不同载玻片上的由la-icp-ms分析得到的等同的未染色区域。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有68个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有多形性成胶质细胞瘤的人类女性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图4b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图5：a.来自图4中示出的患有多形性成胶质细胞瘤的19岁人类女性的相同皮质块但区域不同的h&e染色的5微米组织切片的照片图像。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有69个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有多形性成胶质细胞瘤的人类女性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图5b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图6：a.一名患有恶性间皮瘤的60岁人类男性的h&e染色的5微米组织切片的照片图像。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有67个经过烧蚀的体素)的每个体素的四种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有恶性间皮瘤的60岁人类男性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的四种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图6b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图7：a.一名患有食管恶性黑素瘤的50岁男性的h&e染色的5微米组织切片的照片图像。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有68个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有食管恶性黑素瘤的50岁人类男性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图7b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图8：a.一名患有弥漫性b细胞淋巴瘤的57岁男性的h&e染色的5微米组织切片的照片图像。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有79个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有睾丸弥漫性b细胞淋巴瘤的57岁男性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图8b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图9：a.一名患有小细胞未分化恶性肺癌的38岁男性的h&e染色的5微米组织切片的照片图像。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有65个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有小细胞未分化恶性肺癌的38岁男性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图9b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图10：一名患有精原细胞瘤的52岁男性的代表性h&e染色的5微米组织切片的照片图像。b.示出了组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有79个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中的每一种的校准信号。c.针对来自于患有精原细胞瘤的52岁男性的三行烧蚀轨道的每一行中的相邻体素的三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe，以校准计数/秒表示的原始数值(来自图10b)的图表表示。y轴表示金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴表示三个烧蚀轨道的体素数量。

图11：来自患有精原细胞瘤(55)、淋巴瘤(10)、小细胞肺癌(20)、黑素瘤(64)、脑(成胶质细胞瘤和星形细胞瘤)(25)和间皮瘤(10)的患者肿瘤中的总中位数锰含量的图表表示(⁵⁵mn的cc/s，以校准计数/秒表示)。除了黑素瘤以外，每个方块代表一名患者；对于黑素瘤，其中64名患者中的两名患者在其肿瘤范围内各自具有两个主要谱系，并且每个谱系在直方图中分别以方块表示。

图12：图1所示的一名黑素瘤患者(体内的肿瘤具有两个主要谱系)的组织切片顶部的激光烧蚀轨道的二维表示。规模：右侧(深灰色)，0-15,000校准计数/秒；中间(发白的)，15,000-45,000校准计数/秒；左侧(浅灰)，45,000-150,000校准计数/秒。

图13：所有四种金属的分析结果的图表表示，小图(a)、(b)、(c)和(d)分别示出了图1所示肿瘤的⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu。

图14：来自54岁男性的左手食指的黑素瘤的h&e染色的组织切片的照片图像(第iv期，t4n0m1；上图)。肿瘤的烧蚀轨道的二维表示图(下图)。规模：淡灰色(肿瘤的主要群体⁵⁵mn值)0-2,000cc/s；白色平坦区域，在本文中统称为高金属含量区域(hmr)，在该特定实施例中，其对应于>6,500校准计数/秒。

图15：a.来自经图14分析的一名54岁男性左手食指上黑素瘤的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明组织和细胞形态。b.测定a中所示样品的金属含量。部分b是在进行la-icp-ms之后切片的各个体素中的⁵⁵mn含量的二维表示。在视觉检查体素矩阵数据后，两簇⁵⁵mn含量较高的连续体素(表示为hmr(⁵⁵mn)并显示为黑色区域)是可见的。c.通过采用为整个区域每个体素的中位数的2倍的阈值(加上机器背景值)，进一步分析了切片a和切片b的各个体素的⁵⁵mn含量的二维表示。黑色方块表示高于该特定阈值(2×中位数)的体素。d.通过采用为整个区域每个体素的中位数的阈值(加上整个区域体素值的标准偏差(st.dev)以及机器背景值)，进一步分析了切片a和切片b的各个体素的⁵⁵mn含量的二维表示。黑色方块表示高于该特定阈值(中位数+标准偏差)的体素。

图16：顶部小图：来自图15的a图的黑素瘤患者的肿瘤的经过h&e染色的相同的5微米标准组织切片的照片图像。中间小图：图15的c图所示的⁵⁵mn值的相同体素矩阵的二维表示，显示了构成hmr(⁵⁵mn)的两簇连续体素。下部小图：与中间小图显示的那些体素相同的体素的⁶⁶zn体素值，对于⁶⁶zn采用了与⁵⁵mn相同的阈值标准(2×中位数)。

图17：采用不同阈值标准，经由la-icp-ms产生的体素矩阵中hmr(⁵⁵mn)分布和出现的二维表示。左侧四个小图(t1、t2、t3和t4)示出了来自一名51岁女性患者的小细胞未分化肺癌的未染色的5微米标准组织切片的31×31体素区域的激光烧蚀的数据。右侧四个小图(t1、t2、t3和t4)示出了来自图14至图16中所描述的一名54岁黑素瘤患者的31×31体素区域的激光烧蚀的数据。应用于体素矩阵数据的⁵⁵mn阈值是：t1，0.5×中位数；t2，1×中位数；t3，1.5×中位数，t4，2×中位数。每个小图中的深色体素是其中⁵⁵mn值超过针对该小图的阈值的那些体素。超过阈值的单个不连续体素被称为单元素(singleton)，而两个连续体素被称为双元素(doublet)。

图18：针对来自图17的两名患者的相同样品，通过la-icp-ms产生的体素矩阵中hmr(⁶⁶zn)的分布和不出现hmr(⁶⁶zn)的二维表示。左侧四个小图(t1、t2、t3和t4)示出了如图17所示的相同31×31体素区域的激光烧蚀的数据，同时用于分析⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu。示出了⁶⁶zn的数据。右侧四个小图(t1、t2、t3和t4)示出了如图17所示的相同31×31体素区域的激光烧蚀的数据。使用如前所述的应用于体素矩阵数据的⁶⁶zn阈值：t1，0.5×中位数；t2，1×中位数；t3，1.5×中位数和t4，2×中位数。每个小图中的深色体素是其中⁶⁶zn值超过针对该小图的阈值的那些体素。

图19：直方图示出了20名患有小细胞肺癌的患者的肿瘤激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示从单个患者取样的肿瘤的约1800个体素总区域计算的中位数。顶部直方图示出了14名肿瘤患者不含有hmr(⁵⁵mn)。底部直方图示出了来自于六名患者(将其标记为t1至t6)的肿瘤含有hmr(⁵⁵mn)，该hmr(⁵⁵mn)是通过2×中位数的标准t4阈值测定的。黑色方块表示在t1至t6中的每名患者体内肿瘤中发现的hmr(⁵⁵mn)的中位数，其是采用标准t4阈值(2×中位数)确定的。将各hmr(⁵⁵mn)值通过虚线连接至各个t1至t6患者的肿瘤的⁵⁵mn值群体中位数。直方图的区间是200cc/s单位。

图20：在模拟的二维肿瘤样品中连续体素配置的选定样品的大小、形状和含量的示意图。将癌细胞高于指定阈值的体素表示为黑色。小图a示出了在只检查体素双元素时所有八种可能的体素配置的位置。小图b和e示出了满足高于8×8阈值hmr(^am)标准的许多可能的连续体素配置之一，其中^am代表任一金属。小图c示出了仅为7×7体素的体素配置，其的最小阈值将低于8×8最小阈值。小图d和f示出了将会是淋巴管或淋巴导管特征的体素配置。小图g示出了为癌细胞的“单行(singlefile)”移动或明显的机器“不顺畅运转(stutter)”特征的体素配置。小图h是在一些黑素瘤中出现的多个体素配置的特征，其中高于阈值的体素可能是由含有任何高含量金属的细胞或与任何金属结合的黑色素颗粒引起的。

图21：直方图示出了10名患有弥漫性b细胞淋巴瘤的患者的肿瘤(总区域为约1800个体素)的激光烧蚀样品中以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤进行计算的中位数。直方图的区间是200cc/s单位。

图22：直方图示出了55名患有典型精原细胞瘤的患者的肿瘤激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤的约1800个体素总区域进行计算的中位数。顶部直方图示出了51份不含hmr(⁵⁵mn)的精原细胞瘤。底部直方图示出了来自于四名患者(将其标记为s4至s7)的肿瘤含有hmr(⁵⁵mn)，该hmr(⁵⁵mn)是通过2×中位数的标准t4阈值测定的。黑色方块表示在s4至s7中的每名患者体内肿瘤中发现的hmr(⁵⁵mn)的中位数。将各hmr(⁵⁵mn)值通过虚线连接至各个s4至s7患者的肿瘤的⁵⁵mn值群体中位数。直方图的区间是200cc/s单位。尽管在标准阈值下患者肿瘤不含有hmr(⁵⁵mn)，但是具有高中位数的患者(标记为s1、s2和s3))是异常值。

图23：10名患有间皮瘤的患者的肿瘤的激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数的直方图。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤的约1,800个体素总区域进行计算的中位数。顶部直方图示出了9份肿瘤不含hmr(⁵⁵mn)。底部直方图示出了一份含有单个hmr(⁵⁵mn)的肿瘤，该hmr(⁵⁵mn)是通过2×中位数的标准t4阈值测定的。黑色方块表示在一名间皮瘤患者体内肿瘤中发现的hmr(⁵⁵mn)的中位数。将hmr(⁵⁵mn)值通过虚线连接至该肿瘤的⁵⁵mn值群体中位数。直方图的区间是200cc/s单位。

图24：直方图示出了25名要么患有脑部多形性成胶质细胞瘤要么患有脑部星型细胞瘤的患者的肿瘤的激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤的约1,800个体素总区域进行计算的中位数。顶部直方图示出了24份肿瘤不含hmr(⁵⁵mn)。底部直方图示出了一份含有单个hmr(⁵⁵mn)的肿瘤，该hmr(⁵⁵mn)是通过2×中位数的标准t4阈值测定的。黑色方块表示在该肿瘤中发现的hmr(⁵⁵mn)的中位数。将hmr(⁵⁵mn)值通过虚线连接至该肿瘤的⁵⁵mn值群体中位数。直方图的区间是200cc/s单位。

图25：直方图示出了64名患有黑素瘤的患者的肿瘤的激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤的约1,800个体素总区域进行计算的中位数(除了两名黑素瘤患者，对于同一种肿瘤，每名具有两个主要谱系)。顶部直方图示出了肿瘤不含hmr(⁵⁵mn)。底部直方图示出了肿瘤含有hmr(⁵⁵mn)，该hmr(⁵⁵mn)是通过2×中位数的标准t4阈值测定的。黑色方块表示在该肿瘤中发现的hmr(⁵⁵mn)的中位数。将hmr(⁵⁵mn)值通过虚线连接至该肿瘤的⁵⁵mn值群体中位数。一些肿瘤有多个hmr(⁵⁵mn)，对于该肿瘤将多个hmr显示在相同的虚线上。直方图的区间是200cc/s单位。需注意，由于许多cc/s值超过10,000的值，因此已将缩放比例进行了压缩。

图26：与用于分析本申请的金属结合的黑色素的复合聚合结构的示意图。

图27：小图a和b是来自一名45岁女性胸壁恶性黑素瘤的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明组织和细胞形态。c.该切片的单个体素中的⁶⁶zn含量，其中具有较高⁶⁶zn含量的连续体素以黑色区域表示。d.该切片的单个体素中的⁶³cu含量，其中具有较高⁶³cu含量的连续体素以黑色区域表示。e.该切片的单个体素中的⁵⁶fe含量，其中具有较高⁵⁶fe含量的连续体素以黑色区域表示。f.该切片的单个体素中的⁵⁵mn含量，其中具有较高⁵⁵mn含量的连续体素以黑色区域表示。

图28：直方图示出了64名患有黑素瘤的患者的肿瘤(总区域约为1,800个体素)的激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。如前所述，针对其肿瘤，64名患者中的两名各自具有两个主要谱系，并且在直方图中将每个这样的谱系单独地用方块表示。将黑素瘤样品分为源自原发部位的样品(顶部直方图)、源自淋巴结的样品(中间直方图)和源自远距离部位的样品(下部直方图)。

图29：a.来自一名54岁男性的小细胞肺癌的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明染成深色的癌细胞和染色较淡的基质区域的组织和细胞形态。b.具有高于选定阈值的⁶⁶zn含量(表示为白/灰)和低于阈值的基质组分(表示为黑色)的相同切片的二维立体图像。

图30：a.来自一名66岁男性的直肠恶性黑素瘤的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明染成深色的癌细胞、染成颜色更深的黑色素含量和染色较淡的基质区域的组织和细胞形态。b.具有高于选定阈值的⁶⁶zn含量(表示为白/灰)和低于阈值的基质组分(表示为黑色)的相同切片的二维立体图像。

图31：直方图示出了15名患有乳腺癌的患者的肿瘤的激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤的约1,800个体素总区域进行计算的中位数。顶部直方图示出了4份肿瘤不含hmr(⁵⁵mn)。底部直方图示出了11份肿瘤含有hmr(⁵⁵mn)，该hmr(⁵⁵mn)是通过2×中位数的标准t4阈值测定的。黑色方块表示在11名患者中的每一位的肿瘤中发现的hmr(⁵⁵mn)的中位数。将hmr(⁵⁵mn)值通过虚线连接至肿瘤的⁵⁵mn值群体中位数。一些肿瘤具有多个hmr(⁵⁵mn)，并且对于该肿瘤将多个hmr显示在相同的虚线上。直方图的区间是200cc/s单位。

图32：a.来自一名39岁女性的高分化乳腺癌的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明组织和细胞形态。b.在进行la-icp-ms后，该切片的单个体素的⁵⁵mn含量的二维立体图像。将多簇高⁵⁵mn含量的连续体素表示为黑色区域。

图33：采用不同阈值标准，来自图32中的该39岁女性的经由la-icp-ms产生的体素矩阵中hmr(⁵⁵mn)分布和出现、以及不出现hmr(⁶⁶zn)的二维表示。左侧四个小图(t1、t2、t3和t4)示出了不同阈值标准下的乳腺癌的31×31体素区域的激光烧蚀的⁵⁵mn数据(t1，0.5×中位数；t2，1×中位数；t3，1.5×中位数，t4，2×中位数)。右侧四个小图(t1、t2、t3和t4)示出了在相同阈值标准下的相同31×31体素区域的激光烧蚀的⁶⁶zn数据。每个小图中的深色体素是其中⁵⁵mn值或⁶⁶zn值超过该小图阈值的那些体素。

图34：该39岁女性乳腺癌样品中的⁵⁵mn体素值和⁶⁶zn体素值的分布变化分析，⁵⁵mn体素值和⁶⁶zn体素值的二维数据显示于图33中。根据y轴特定区间中的体素频率和x轴的体素值，小图a示出了⁵⁵mn体素的右侧偏斜。图b示出了来自相同样品的⁶⁶zn体素值的近似对称分布。

图35：a.来自一名48岁女性的浸润性导管乳腺癌的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明组织和细胞形态。b.以上图像的主要形态特征的描述，显示了淋巴管中的癌细胞(c1至c5)、由相关脂肪细胞包围的正常导管(n)、一定浓度的免疫细胞(免疫)和其它基质组分。

图36：最上面的两幅小图是来自图35的48岁女性的浸润性导管乳房癌的经过福尔马林固定和石蜡包埋块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像，用于图解说明异质性的组织和细胞形态。底部的四个小图：在含有脂肪细胞的区域和部分基质区域中的四种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu的差异分布的二维立体图像。

图37：a.图解说明了患有前列腺癌和psa(8.1)的患者x的临床数据，示出了不同前列腺区域中的异常，其中12个区域中的7个区域显示出变化不大，5个具有“癌症”的区域由格里森评分(gleasonscores)评为不高于7(上部小图)。b.患者x的十二个核心针活检的累及范围的诊断总结(第a部分至部分l)。

图38：直方图示出了10名患有前列腺癌的患者的肿瘤的激光烧蚀样品中的以校准计数/秒(cc/s)表示的⁵⁵mn的⁵⁵mn含量中位数。每个灰色方块表示对来自于单个患者的肿瘤的约1800个体素总区域进行计算的中位数。在采用本文中的2×中位数的标准阈值条件下，不存在hmr(⁵⁵mn)。

图39来自一名70岁男性患者y的脑部的磁共振图像。a.在药物治疗和放射之前的经医疗护理的大脑左侧顶叶(箭头)处出现的对比增强的病变。b.在放射和免疫治疗药物治疗之后的相同脑部区域的mri。c.在脑部扫描之前的来自切除多年的同一患者的原发性黑素瘤的经过福尔马林固定和石蜡包埋的块的经过h&e染色的5微米标准组织切片的照片图像。d和e.通过la-icp-ms分析的感兴趣区域的高功率图解。

图40：来自患者y的原发性黑素瘤的五个分开的癌细胞区域的⁵⁵mn的校准信号轨道(箭头→)。在每个选择的区域中有六个标准的35微米×35微米×5微米体素的连续烧蚀轨道，轨道长度分别为19个体素、19个体素、13个体素、19个体素和19个体素。对于6行烧蚀轨道中的每一个，示出了每个相邻体素的⁵⁵mn的校准计数/秒的原始数值。

图41：顶部小图，患有鳞状癌的患者z在放射治疗之前的口腔区域。底部小图，放射治疗后6个月的患者z。

图42：通过la-icp-ms分析黑素瘤患者的实体肿瘤的流程图。为医生提供诊断证据的可选途径是基于ati的同质性或异质性的，以此建议对患者进行放射治疗还是避免进行放射治疗。关键的决定点是⁵⁵mn体素值是高于某些指定的阈值还是低于某些指定的阈值，以及基于金属结合的肿瘤黑化程度。

图43：通过la-icp-ms分析非黑素瘤患者的实体肿瘤的流程图。为医生提供诊断证据的可选途径是基于ati的同质性或异质性的，以此建议对患者进行放射治疗还是避免进行放射治疗。关键的决定点是⁵⁵mn体素值是高于某些指定的阈值还是低于某些指定的阈值。

具体实施方式

在研发本发明的工作中，出于比较目的，发明人注意到许多肿瘤(特别是黑素瘤)的二维空间特征变化很大，例如，如图1所示的。图1示出了来自一名48岁男性的颈部ib期恶性黑素瘤的经过福尔马林固定和石蜡包埋(ffpe)的块的h&e染色的5微米标准组织切片，其tnm分期标准为t2an0m0，其中t2表示固有肌层的侵袭；n0表示无淋巴结转移，m0表示无远处转移。注意到，该切片的右上角部分由苍白的非黑色素肿瘤细胞组成，而图的左侧和底部的深色区域由含有染色较深的黑色素的细胞组成，并且如图片下部的黑色斑点表示的，是细胞内和细胞外的较大黑色素块。如上所述，这类肿瘤的病理学诊断是基于对h&e染色的载玻片的主观分析，采用该病理学诊断以确定治疗方式并基于此作出是否进行放射的决策。尽管也通过在一种类型的肿瘤与另一种类型的肿瘤中不同的一组抗体标记这类组织切片以辅助病理学诊断，但是这类结果也是主观性的而远非量化性的。在本发明之前，还不存在可利用的量化测试方法或预测放射敏感性或抗性的测试方法以辅助肿瘤学家作出是否将使用放射作为治疗方案一部分的决策。

具体地，柳叶刀肿瘤学委员会(lancetoncologycommission)最近针对涉及扩大全球放射治疗可行性的问题提出了新证据(atun等人，lancetoncology2015,16,1153-1186)。该委员会强调了放射治疗是进行有效治疗和控制癌症的基本方式，而且一般都是次优使用的。“柳叶刀”杂志的编辑指出，放射治疗比其它治疗方式更具有可扩展性，并且是用于提供有效治疗和姑息治疗的独特方式(coburn&collingridge，lancetoncology，2015,16,1143)。然而，目前对于根据个体患者的需要而调整放射治疗存在两个相继障碍。

●首先，在本发明之前，还没有“量化测试”来测定给定患者中给定肿瘤对给定放射治疗方案的反应程度。

●其次，目前还没有“量化测试”来测定任何肿瘤在放射治疗之后复发的可能性。

在本发明之前，临床决策是基于医疗技术的，而不是用于确定放射应答性的量化测定。

不受任何具体理论的束缚，本发明人提出以下解释来说明意外发现ati可用于预测放射应答性：

-电离放射，如γ射线和x射线，其导致水分解，因而导致在所有细胞(细菌、藻类、真菌、无脊椎动物或数百种人类细胞类型、或因导致癌细胞的扰乱而出现的异常细胞类型的细胞)内形成相同类型的化学实体。

放射分解通常产生相同类型的反应性分子，三种关键分子是：

-羟基自由基oh^●，超氧自由基o2^●-和过氧化氢(h2o2)(daly,m；naturereviewsmicrobiology,7,237-245.2009)。

在尚未被照射的正常健康哺乳动物细胞中，也形成同样的这三种分子而作为通过线粒体电子传递链发生的正常线粒体呼吸过程的一部分。如果氧原子所接收的电子少于其全部电子，那么会形成o2^●-和h2o2。如果h2o2没有被立即清除，则任一杂铁原子fe²⁺都会与其发生反应，并生成高度危险的羟基自由基oh^●。

在哺乳动物细胞中，由线粒体、胞质和胞外酶系统处理(即位于线粒体中的锰超氧化物歧化酶mnsod、胞质中的铜-锌超氧化物cuznsod和主要锚定于内皮细胞的细胞外超氧化物歧化酶ecsod)处理超氧自由基o2^●-。

由过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶清除h2o2以产生水和分子氧。

酶学反应不能处理高度危险的羟基自由基oh^●。较高程度的氧化代谢的后果之一是在哺乳动物的大脑中使得脑细胞易于由于oh^●发生脂质过氧化。

发明人推断化学元素和元素含量对放射应答性有益，例如锰。发明人注意到，虽然全身暴露至10gy(gy)对大多数脊椎动物是致命的，但是一些细菌如耐辐射球菌(d.radiodurans)的存活剂量超过17,000gy。它可以达到该高剂量的一种贡献机制是它累积的锰比对放射敏感的细菌物种高出150倍并且累积的铁(fe)为其的三分之一(daly,m；naturereviewsmicrobiology,7,237-245,2009)。锰-铁比最高的细菌物种是最具有放射抗性的，而mn/fe比最低的细菌物种是高度敏感的。放射性反应的机理基础揭示了锰累积能够使含有铁-硫(fe-s)复合物的蛋白质屏蔽在放射期间形成的超氧自由基如(o2^●-)。由锰产生的这种屏蔽作用防止了含铁-硫蛋白中的亚铁离子(fe²⁺)的释放，从而防止了fe²⁺与过氧化氢之间的高度破坏性相互作用。如果fe²⁺尽量与h2o2发生反应，则会产生危险性的羟基自由基oh^●，并将会氧化几乎所有类型的生物分子。

与过氧化氢相比，o2^●-不易穿过细胞膜并因此在细胞室内积聚。因此，能够有效屏蔽含fe-s的蛋白质使其不暴露于o2^●-以及将可用于芬顿反应(fentonreaction)的fe²⁺量最小化的任何细胞系统将使放射后带来的损伤最小化并增强放射抗性。发明人推断，细菌数据表明，锰离子是一种保护性金属，甚至在高浓度下对细菌细胞来说基本上是无害的，并且很可能被许多细胞类型的多细胞生物体所耐受。相反地，任何锰含量低且游离铁含量高的细菌系统极易不能够保护蛋白质和脂质免受损害，并且芬顿反应(fentonreaction)将导致破坏性oh^●将持续升高，而引起蛋白质和脂质破坏以及细胞死亡，因而是细胞放射敏感性的。对于真核生物而言，也将是类似的情况。

已知游离铁的胞内可用性是通过蛋白质羰基化对不可逆蛋白质损伤起关键作用的。在酵母中，在酵母缺乏特定的铁储存蛋白(其同系物是位于人类线粒体的共济蛋白蛋白质)时，羰基化水平增加。将人类铁蛋白导入到这种缺陷型酵母菌株，部分地恢复这种酵母的铁储存能力，降低游离铁水平并抵消升高的羰基化水平。因此，铁储存蛋白可能是防止电离放射后细胞损伤的重要参与者。

应当注意的是，虽然超氧自由基o2^●-是高度带电荷的，但它不与dna反应。然而，它与选定的靶标反应，这些靶标是某些蛋白质的任何暴露的铁硫(fe-s)基团。

总而言之，oh^●对所有细胞成分具有极大的破坏性，但是由于其寿命短，因而其造成的附带破坏被受限于其形成部位的几埃距离内。相反，h2o2可以在整个细胞内扩散并与fe²⁺反应，产生所已知的氧化能力最强的反应之一。该反应产生更多oh^●。细菌数据表明，对电离放射的反应性从生物上是连续变化的，其在以下方面产生多种影响：细胞锰浓度和清除自由基的相关酶学、螯合游离铁、减少过氧化氢以及将蛋白质最小化和再生成蛋白质。

体外系统已经证明对人锰超氧化物歧化酶将超氧化物自由基o2^●-转化成h2o2和o2。在许多人类体外细胞系统中，人类mnsod蛋白水平和活性与对电离放射的抗性增加相关。类似地，降低细胞系统中mnsod蛋白质和活性的水平导致对放射的抗性降低。

因此，在仔细控制的实验环境中(其中实验细胞和对照细胞的遗传背景保持恒定，并且唯一变量是引入的基因(其反义产物)或空载体)，位于线粒体的mnsod蛋白有助于保护细胞免受电离放射的影响。

在人类细胞中只存在处理超氧自由基o2^●-的三种超氧化物歧化酶，并且这些超氧化物歧化酶都具有不同的细胞位置。锰超氧化物歧化酶mnsod位于线粒体内，铜-锌超氧化物cuznsod存在于细胞质和细胞核中，而胞外超氧化物歧化酶ecsod主要锚定于内皮细胞中。这三种超氧化物歧化酶在这三个不同位置处处理o2^●-。

虽然人们已经将注意力集中在超氧化物歧化酶上，但是对于化学元素(如mn和cu)的基本化学和生物化学、其在细胞内的定位和用途远比超氧化物歧化酶的特异性研究得广泛得多，例如mn存在于复合物形成的过程中(daly等人，plosone,5,e12570,2010；slade和radman,microbiologyandmolecularbiologyreviews,75,133-191,2011)。

图2示出了三种不同的锰结合实体。锰与正磷酸盐形成复合物并清除o2^●-。锰还与游离氨基酸或肽形成复合物，以清除和分解过氧化氢、羟基自由基(oh^●)和o2^●-。核苷、游离氨基酸和各种有机代谢物清除羟基自由基(slade和radman，microbiologyandmolecularbiologyreviews,75,133-191,2011)。

无机金属(如铁、铜、锌和锰)通常被认为作为蛋白质的催化辅因子。

尽管存在前述的有关金属在放射抗性方面发挥作用的建议，但是在本发明之前，与正常相比，在肿瘤的二维癌性背景下，尚未将锰量化，由此确定放射敏感性/放射性抗性，随后首先用于作出关于放射治疗的决策，其次用于预测在放射治疗之后肿瘤复发的可能性。

目前用于实施本发明的所有硬件和软件均是商业和临床上能够获得的。对于本领域技术人员显而易见的是，技术变体可以是有用的。可以根据本领域中任何已知的方法制备根据本发明用于分析的组织切片、细胞或细胞群。例如，根据本领域制备未染色的组织切片、未染色的冷冻切片或通过surepath系统沉积为单层的细胞，并且例如，按照本文描述进行制备。可以使用本领域中可利用的任何系统，例如，surepath系统在紧密圆形区域中的载玻片上产生单层细胞，并且以这种方式制备的材料将适合用于la-icp-ms方法学。只要不损失二维完整性，本领域已知的任何方法可用于制备本发明的测试样品和/或对照样品。可以通过以下方法制备大量烧蚀轨道，例如，激光烧蚀-电感耦合等离子体-质谱(la-icp-ms)、激光烧蚀-飞行时间质谱(la-tof-ms)、电感耦合等离子体-发射光谱(icp-oes)、微波等离子体-原子发射光谱(mp-aes)、激光诱导击穿光谱(libs)、二次离子质谱(sims)、x射线吸收近边结构(xanes)、原子吸收光谱(aa)或x射线荧光(xrf)。

如果在单个或多个烧蚀轨道内的值全部都高于指定阈值或全部都低于指定阈值，则不需要由病理学家进行检查。然而，对于被计算机软件标记的任何轨道，则需要由病理学家检查同一批经过染色的载玻片。

可替换地，首先由病理学家检查载玻片，由病理学家指导应在哪个区域制备优选的烧蚀轨道。

应当注意的是，对于单个烧蚀轨道(宽度小于110微米)，将在约70秒内烧蚀1cm的肿瘤组织轨道。在这个方面，利用现有方法，对于贯穿肿瘤样品或肿瘤中的多个分散区域(位于用于随后烧蚀分析的区域或由病理学家指定的用于随后烧蚀分析的区域)的多个轨道，可能需要几分钟完成。

激光烧蚀-电感耦合等离子体-质谱(la-icp-ms)最初是由gray(analyst,110,551-556.1985)使用红宝石激光器引入的。随后被固态nd：yag和准分子激光器取代。由hare,d等人(analyst134,450-453.2009)描述了前种方法的使用(hare等人，操作参数，表1)。对于准分子激光器，该光束由惰性气体(氩、氪或氙)与反应性气体(如氯或氟)组合的气体组合物产生。在高压和电刺激下，产生了称为激发复合体的假分子(xecl、krf或arf)，其在紫外线的作用下产生激光。

在la-icp-ms的背景下，普遍的准分子系统是与新波准分子(newwaveexcimer)(产生193纳米的波长)偶联的agilent7700icp-ms，首先由gunther等人使用该激光器(gunther等人,j.anal.at.spectrom.12,939-944,1977)。在la-icp-ms上进行游离离子的元素分析，例如，使用icp-ms仪器(agilenttechnologies7700系列)，其与newwaveresearchexcimer193激光器烧蚀元件相互作用。此外，icp-ms仪器配有八极杆碰撞/反应池。也可以利用其它的icp-ms仪器，包括thermofisher的icap^tmqicp-ms、perkinelmer的nexion系列、shimadzuicp-ms2030和tofwerk的icp-tof-ms。除了icp-ms系统，也可以利用原子发射光谱技术确定ati，如电感耦合等离子体-发射光谱(icp-oes)、微波等离子体-原子发射光谱(mp-aes)、或激光诱导击穿光谱(libs)、或二次离子质谱(sims)或x射线吸收近边结构(xanes)、或原子吸收光谱(aa)或x射线荧光(xrf)。

使用高纯度液态氩(ar)作为载气和等离子体源，同时采用超高纯度(99.999％)氢气(h2)作为反应气体。每天都对la-icp-ms系统进行调整，使用玻璃中的微量元素nist612用于标准模式和反应模式，以获得最大灵敏度并确保低氧化物的形成。通过测定248/232质荷比(m/z)(表示为²³²th¹⁶o⁺/²³²th⁺)来确保低氧化物产量，并且其始终小于0.3％。使用基质匹配的组织标准对仪器进行微调以进行组织分析。

下面给出了la-icp-ms系统的典型操作参数，为了清楚起见，分别示出了7700icp-ms和激光器的操作参数。

icp-ms参数

射频功率是1250.0瓦特；冷却气体流量为15.0升/分钟；载气流速为1.2升/分钟，样品深度为4毫米；四极偏压是-3.0伏；八极偏压是-6.0伏特；停留时间为每m/z62毫秒；提取透镜1为5.0伏；提取透镜2为-100.0伏特，并且氢气碰撞气体为3.1毫升/分钟。

新波193准分子激光器的参数

波长193纳米；重复频率为40赫兹；激光能量密度为0.3至0.5焦耳/平方厘米；光斑直径为35微米；行间距为35微米；监测的质荷比(m/z)、55(mn)、56(fe)、63(cu)和66(zn)。光栅速度为140微米/秒(35微米的四倍)。

简而言之，将具有来自特定组织的未染色切片的玻璃显微镜载玻片置于烧蚀室中，并将高能激光束(直径不同)聚焦到该切片上，并且一些生物材料被汽化(由于来自激光束的能量转移所产生的)。通过载气(通常为氩气、氦气或氩气加上氦气，在本发明的一个实施方式的系统中使用的是氩气)将所产生的颗粒物质移动到电感耦合等离子体(该等离子体的温度超过7,000摄氏度，但低于10,000摄氏度)中，将该颗粒物质雾化并电离成其组成元素。使用碰撞/反应池(tanner等人，spectrochim.acta，partb，57,1361-1452,2002)使光谱干扰最小化，并“除去”多原子离子(如氧：氩物质(¹⁶o⁴⁰ar⁺)，其可能作为56信号出现，并且错误地归因于⁵⁶fe)。在动态反应池中，干扰性多原子离子以更高的m/z被转换成不同物质，并且不再干扰目标离子。从碰撞池出来之后，离子被集中到四极滤质器，在那里以m/z比将它们分开，并进行检测和量化。

除了四极系统，icp-ms系统可以包含双聚焦扇形区场质谱仪或飞行时间(tof)分析仪。icp-tof-ms具有每秒30,000个完整质谱的极高吞吐量获取能力(resano等人，massspectrom.rev.29,-55-78,2010)。

为了在显微镜载玻片上产生材料的二维元素图，激光跨越样品对其从一侧到另一侧进行光栅扫描，每次一个轨道，从顶部到底部，其中轨道具有选定的宽度。将得到的图像作为相邻像素可视化，但是由于经过烧蚀的材料具有深度，因此每个像素表示一定体积的组织(一个体素)。

对于本领域技术人员显而易见的是，本发明提供了以下优点：

a)制备最少化的样品以避免引入人工产物；

b)同时且快速地提取多元素数据的能力；

c)关于肿瘤结构(就其肿瘤细胞、基质细胞、异常脉管系统、转运免疫细胞和非细胞物质(如胶原蛋白束)而言)的二维信息的去卷积，所有这些信息形成相互作用的形成肿瘤的环境，并且在放射敏感性下限和放射抗性上限之间的位置处撞击；

d)它直接转化为实施治疗方法或避免进行治疗方法，即对任何类型的组织或器官进行电离放射。在进行放射治疗的情况下，本发明确定了肿瘤复发的可能性。

e)对特定类型的肿瘤没有特异性。该方法适合用于任何肿瘤、局部的或转移性的、良性的或恶性的。因此，该方法是泛诊断性的。例如，前列腺特异性抗原测试法测定血液中的单个该循环实体，其可以指示良性肿瘤或恶性肿瘤的存在性、或仅仅是良性前列腺增生、或剧烈运动。因而，该循环实体并不意味着需要进行治疗干预。该方法还是对男性具有特异性的。相反，本发明不受性别或肿瘤类型的特异性限制，因此不需要开发针对特定肿瘤类型的特异性抗体或药物，例如用于非小细胞肺癌的特罗凯(tarceva)。

f)放射(可以是外部束或植入“种子”)被递送至局部的解剖区域，其与经由血管系统递送到所有组织并且总是对正常组织具有脱靶效应、并引起各种毒性水平(如用于黑素瘤中的威罗菲尼(vemurafenib)诱导角化棘皮瘤)的小分子量药物、化学疗法剂或基于抗体的生物制剂不同。

g)本发明是直接的。针对样品的多个制备步骤，该方法不存在中间步骤。该测定法不受在处理中依赖于信号放大(如pcr)的方法中所固有的潜在偏差的困扰，在pcr方法中常用的酶可以由于不同序列的扩增速率差异而引入系统偏差。不需要抗体与组织切片进行杂交(其中，杂交特异性和扩增信号测定会发生改变)。本发明测定了样品中所含有的物质，并且不会出现由于多步骤过程而引起的失真。

h)在可以得出的测定范围内存在七级线性动态范围。由于该范围和线性允许真实测定细胞群中的元素丰度，因此它们都是至关重要的，而不会出现由需要进行实体转化和放大的现有方法中引入的潜在误差。

本发明特别适合用于检测疾病状态、干细胞和衍生细胞群的分化状态、检测或测定药物对细胞状态的影响、以及细胞状态的精确指示是有用的任何其它情况。

现在将参考描述具体组合物和所使用方法的具体但非限制性的实施例来更详细地描述本发明。然而，应当理解的是，具体步骤、组合物和方法的详细描述仅仅是为了举例说明本发明的目的。不应以任何方式理解为对如上所描述的发明概念的广义描述的限制。

实施例1

制备组织标准物

使用30μm厚的基质匹配的组织标准切片进行标准化和校准实验。这些标准物是由去除了任何脂肪或结缔物质的鸡胸组织制备的，并且使用配备有聚碳酸酯探针的omnitechth组织匀浆器(凯莉科学资源公司(kellyscientific)，北悉尼，新南威尔士州，澳大利亚)对其部分进行均质化，随后加入标准的ca、mn、fe、co、cu和zn溶液。采用溶于1％hno3(choiceanalytical，桑利，新南威尔士州，澳大利亚)的高纯度(最低为99.995％)的可溶性氯化金属盐、硫酸金属盐或硝酸金属盐(sigma-aldrich，城堡山，新南威尔士州，澳大利亚))制备溶液，并将其稀释至约100,000μgml-1和10,000μgml-1的浓度。然后将等份的鸡胸组织掺入不同浓度的各种元素，并以低速均质化5分钟。对于每份均质化的组织标准物，在milestonemls1200封闭的容器微波消化炉(kellyscientific)中以5:1的hno3/h2o2(seastar基线级，choiceanalytical)消解6份约250mg的等分试样，并且使用溶液icp-ms分析以确认在组织标准物中的每个元素的浓度和均质性。将加入标准金属溶液的组织冷冻并切成30μm的切片并置于玻璃显微镜载玻片上进行分析。这种方法可以简单地应用于切成5微米的切片，将切片的一小部分添加到每个肿瘤载玻片上。

校准和背景分析

将所制备的基质匹配的组织标准物用于在稍后描述的用于运行la-icp-ms的条件下构建分析物的灵敏度归一化的校准曲线。采集烧蚀组织之前10秒的数据以获得来自气体空白的每个m/z的背景信号。该方法被用于允许进行不同肿瘤的不同运行之间的比较。例如，实现了2k校准计数/秒。

一个或多个灵敏度阈值

作为相对于放射敏感对照物的平均值和中位数的标准偏差或者作为来自任何肿瘤类型的经验确定值，设定先前所描述的阈值的另一种方式是设定灵敏度阈值，例如通过分配在图11的顶部直方图中的睾丸样品，使得将阈值定义为该直方图的百分比。例如，图11的精原细胞瘤来源于55名患者，其中该55名患者中的41名占阈值低于75％的直方图的75％，并且所有这些患者是对放射敏感的。接下来，55名患者中的47名占直方图的85％，并将对放射敏感的。最后，55名患者中的52名占直方图的近95％，但这些异常患者中的一些可能具有一定程度的放射抗性。这些代表直方图比例的百分比数字是表示可被选择用于放射应答性的可变阈值的另一种方式。

实施例2

在一个实施例中，将如本文所描述的在显微镜载玻片上的正常脑组织的切片激光烧蚀，并且由la-icp-ms系统分析其金属含量。

图3a示出了来自一名50岁人类女性的正常人皮质块的代表性h&e染色的5微米组织切片，其显示了正常皮层组织的特征。该图举例说明了在相同块的相邻未染色切片(但在不同的载玻片上)上进行的三轨道烧蚀(从较大的多轨道组织烧蚀获取)的位置。图3a中显示的h&e染色区域对应于在不同载玻片上通过la-icp-ms分析的等同未染色区域。将未染色的5微米组织切片从同一块中切下，激光烧蚀，并以前述的详细操作参数使用安捷伦科技公司(agilenttechnologies)的7700la-icp-ms系统进行分析。通常使用未染色的组织切片，以避免引入在染色剂、染色溶液中出现的任何化学元素或在处理过程中从容器中浸出的化学元素。也可以使用经过染色的切片。

为了在单独的显微镜载玻片上产生未染色材料的元素图，激光横向地扫描整个载玻片，每次从顶部到底部扫描一个烧蚀轨道。通常，取决于组织样品的大小，产生高达数百个水平轨道，每个轨道宽度为35微米。横向分辨率是四极质谱仪的积分时间的函数，并且在这些数据集中进行选择以提供35微米的分辨率。生成了由35微米×35微米像素的基本单位组成的完整图像。由于组织切片是5微米厚，每个像素代表35×35×5的组织体积，即6125立方微米的体素。烧蚀运行50条水平轨道，其中每条烧蚀轨道由70个体素组成，产生由3500个体素组成的二维图像。

确定了三种金属⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe中每一种的校准信号。示出了来自组织切片(每个轨道具有烧蚀的70个体素)的三个连续烧蚀轨道的每个体素的结果(图3b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数(以校准计数/秒表示)分别为3,409、6,651和441,317。由于技术原因，⁶³cu的测定数据是不可获得的。

这些原始数据在图3c中以图形形式呈现，其中每个轨道由70个体素组成。图3c示出了三行烧蚀轨道中每一行的相邻体素针对三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的以校准计数/秒cc/s表示的原始数值的图表。将未染色的5微米组织切片从同一块中切下，激光烧蚀，并以下述的具体操作参数使用安捷伦科技公司(agilenttechnologies)的7700la-icp-ms系统进行分析。

在激光扫描载玻片上的整个未染色组织切片时，每种金属的值从背景水平变化到组织样品的那些特征，然后再次返回到背景值。值的变化通常与经过染色的组织切片中看到的肿瘤结构的形态学变化和变体一致。

在该实施例中，顶部小图中的原始游离锰离子值显示在烧蚀行2中体素55处存在激增，而与其邻接的八个体素中没有一个体素显示出这种与中位数之间的较大偏差(如从图3b的数据来看)。单个体素的这种较大的单一激增是由于机器“抖动”所引起的，并且这种激增几乎总是比中位数大3个标准偏差。虽然在此是为了说明原始数据的目的而显示出来的，但是由于它们代表机器“噪音”，因而在统计分析之前将它们移除。即使它们仍然是数据分析的一部分，它们也是非常少见的，它们对重要结果(如中位数值)只有极小影响。

实施例3

具有对比放射抗性和敏感性的肿瘤样品

如上所述，柳叶刀肿瘤学委员会强调了放射治疗是有效治疗和控制癌症的一个基本组成部分，而且一般都是次优使用(atun等人,lancetoncology2015,16,1153-1186)。在本发明之前，临床上接受的标准是某些肿瘤类型(如成胶质细胞瘤、间皮瘤和黑素瘤)在很大程度上是具有放射抗性的，而大多数淋巴瘤、小细胞肺瘤和睾丸肿瘤(如经典的精原细胞瘤)是放射敏感的。其它主要的肿瘤类型(如乳腺癌和前列腺癌)通常被认为是“中等”放射应答性的，但是“中等”是依赖于环境的并且难以确定的。临床现实涉及单独被放射治疗根除的原发癌的百分比、所需要的放射剂量，以及各种转移病灶对烧蚀放射治疗的易感性百分比。因此，大规模的精原细胞瘤和淋巴瘤肿块很容易被放射治疗根除，而尽管剂量很大但肉瘤和胰腺癌很不容易被根除。另外，对于一些“低/中等”风险的前列腺癌和一些前列腺癌骨转移，放射治疗被认为是“治愈性的”，因而当然可以将这类前列腺癌归类为对放射非常敏感的。

鉴于上述临床变化，我们已经选择了用于评估ati的六种肿瘤类型，其中前三种提供了用于放射抗性的模型(bookend)，而后三种提供了用于放射敏感的模型(bookend)。然而，临床上公认的是，即使在这六种肿瘤类型的每一种的范围内，仍然也有少数患者以预期的方式对放射治疗没有反应。这是由于在本发明之前所使用的方法存在的问题所引起的，例如，h&e染色的病理材料的低分辨率以及在任何肿瘤类型内病理学家分类之间的显著不同。即使添加抗体对经过福尔马林固定且石蜡包埋和苏木精-伊红(h&e)染色的组织切片进行染色，但是针对肿瘤类型内变化的解释仍然是主观性的，并且病理学家之间是不一致性的(elmore等人，jama,313；1122-1132.2015)。

黑素瘤示出了对于个性化放射治疗是充满挑战性的。从历史上看，它一直被认为固有地具有放射抗性，这种认识来源于早期细胞培养研究和存活曲线分析。近来已经根据黑素瘤患者的四十年临床实施放射治疗的数据评估了这种观点(mahadevan等人，oncology,29,(10):743-751,2015)。更新解释是黑素瘤的放射应答性是多种多样的。burmeister精确地总结为：“我治疗黑素瘤已经超过25年了，可是仍令我吃惊的是，在一些病人身上，该肿瘤会自动发生消解，而在另一些患者身上，它们会在几星期或几个月内使患者死亡，这种疾病的表现形式在个体患者身上发生难以置信的变化”。

如同本文中呈现的原子数据所揭示的，本文首次提供了(i)哪些黑素瘤患者(以及其它肿瘤类型)为放射治疗的合适候选者的量化性支持，(ii)确定放射治疗后哪些患者体内癌症可能会复发的量化基础，以及(iii)肿瘤变体的可测定的基础。还应该指出的是，这种异质性不限于黑素瘤。乳腺癌患者和前列腺癌患者及其肿瘤在多个层面(其中一种是它们对放射治疗的反应)上也是多样化的。

1.对放射具有抗性的肿瘤

在另一个实例中，分析了被认为处于临床表现(clinicalspectrum)的放射抗性端的肿瘤金属含量值。例如，如实施例2中所描述的，分析了被认为处于临床表现的放射抗性端的致死性脑肿瘤(多形性成胶质细胞瘤)。该实施例举例说明了，在正常样品和肿瘤样品同时出现在同一载玻片上，并在相同的实验运行条件下以相同la-icp-ms系统进行评估时，脑肿瘤金属含量值与正常脑部组织中的金属含量值的差异。

图4a示出了来自一名患有脑肿瘤(分类为多形性成胶质细胞瘤)的19岁人类女性肿块的代表性h&e染色的5微米组织切片。图中所示的h&e染色区域对应于在不同载玻片上通过la-icp-ms分析的等同的未染色区域。

确定了三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)中每一种的校准信号，并且针对来自组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有68个体素)的每个体素示出了该校准信号(图4b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数值(以校准计数/秒表示)分别为3,198、5,066和219,905。制备了来自患有多形性成胶质细胞瘤的人类女性的三行烧蚀轨道中每一行的相邻体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的原始数值(以校准计数/秒表示)的图表，并且示于图4c中。

为了获得从患有多形性成胶质细胞瘤的同一人类受试者的相同肿块取得的不同切片之间的变化量度，通过la-icp-ms在同一机器运行中分析了同一载玻片上的两块未染色的区域。结果示于图5a、5b和5c中。

图5a示出了来自患有多形性成胶质细胞瘤的一名19岁人类女性(图4中所示的)的同一块的不同区域的代表性h&e染色的5微米组织切片。

确定了来自组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有69个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)中每一种的校准信号(图5b)。制备了来自患有多形性成胶质细胞瘤的人类女性的三行烧蚀轨道中每一行的相邻体素中三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的原始数值(以校准计数/秒表示)的图表，并且示于图5c中。

这些结果证明，对于取自同一个体的同一块的不同组织切片，以相同la-icp-ms机器运行的扣除背景的中位数(校准计数/秒)的变体是优异的。分别地，⁵⁵mn的cc/s值是3,198和2,980；⁶⁶zn的cc/s值是5,066和4,155，并且⁵⁶fe的cc/s值是219,905和190,127。

接下来的实例是另一种不同的赘生物，其也被认为是处于临床表现的放射抗性端。该实例为源自间皮的赘生物，并且获得自一名患有腹腔恶性间皮瘤的60岁男性，其特征如图6a、6b和6c所示。

图6a示出了来自一名患有恶性间皮瘤的60岁人类男性的代表性h&e染色的5微米组织切片。

确定了来自于组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有67个经过烧蚀的体素)的每个体素的四种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu)中每一种的校准信号(图6b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数值(以校准计数/秒表示)分别为4,522、8,805、112,772和1,097。确定了来自该患有恶性间皮瘤的60岁人类男性的三行烧蚀轨道中相邻体素的四种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu)的原始数值(校准计数/秒)的图形表示，并且示于图6c中。

另一个实例是另一种不同的赘生物，也被认为处于临床表现的放射抗性端，其来自于一名患有食管恶性黑素瘤(第iia期，t3n0m0)的50岁男性。在图7a、7b和7c中示出了金属含量特征。

图7a示出了来自该患有食管恶性黑素瘤的50岁男性的代表性h&e染色的5微米组织切片。

确定了来自于组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有68个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)中每一种的校准信号(图7b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数值(以校准计数/秒表示)分别为10,565、6,961和121,495。确定了来自该患有食管恶性黑素瘤的50岁人类男性的三行烧蚀轨道中相邻体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的原始数值(校准计数/秒)的图形表示，并且示于图7c中。

应当注意的是，在一些黑素瘤的体素之间的金属含量比在正常组织和其它赘生物中的金属含量变化更大。造成这种差异增加的主要原因之一是黑色素(一种对不同化学元素(特别是金属)具有储存能力的实体)分布在细胞内和细胞外不均匀。在本申请呈现的第一个附图中的形态不均匀性是清晰可见的，该图是来自48岁男性颈部ib期恶性黑素瘤的h&e染色切片的一部分(图1)。在同一个肿瘤内，存在无黑色素谱系和高度黑色素化的不同区域。在本文中进一步描述了这种肿瘤的金属含量特征(参见实施例5)。

2.对放射敏感的肿瘤

现在将描述被认为处于临床表现的放射敏感端的三种不同类型的赘生物的特征。它们是弥漫性b细胞淋巴瘤、小细胞肺癌和睾丸精原细胞瘤。

淋巴瘤：被认为处于临床表现的放射敏感端的赘生物的第一个实例，其来自于一名患有睾丸弥漫性b细胞淋巴瘤的57岁男性。其金属含量特征如图8a、8b和8c所示。

图8a示出了来自该患有弥漫性b细胞淋巴瘤的57岁男性的代表性h&e染色的5微米组织切片。

确定了来自于组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有79个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)中每一种的校准信号(图8b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数值(以校准计数/秒表示)分别为776、18,892和247,923。制备了来自该患有睾丸弥漫性b细胞淋巴瘤的57岁男性的三行烧蚀轨道中每一行的相邻体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的原始数值(校准计数/秒)的图形表示，并且示于图8c中。y轴示出了该金属离子的校准计数/秒(cc/s)，而x轴示出了三个烧蚀轨道的体素数量。

恶性肿瘤：被认为处于临床表现的放射敏感端的赘生物的第二个实例，其来自于患有小细胞未分化恶性肺癌(第iiib期，t4n1m0)的38岁男性。其金属含量特征如图9a、9b和9c所示。

图9a示出了来自该患有小细胞未分化恶性肺癌的38岁男性的代表性h&e染色的5微米组织切片。

确定了来自于组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有65个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)中每一种的校准信号(图9b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数值(以校准计数/秒表示)分别为1,749、4,836和88,317。制备了来自该患有小细胞未分化恶性肺癌的38岁男性的三行烧蚀轨道中每一行的相邻体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的原始数值(校准计数/秒)的图形表示，并且示于图9c中。

精原细胞瘤：被认为处于临床表现的放射敏感端的赘生物的第三个实例，其来自于一名患有精原细胞瘤的52岁男性。其金属含量特征如图10a、10b和10c所示。

图10a示出了来自患有精原细胞瘤的52岁男性的代表性h&e染色的5微米组织切片。

确定了来自于组织切片的三个连续烧蚀轨道(每个轨道具有79个经过烧蚀的体素)的每个体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)中每一种的校准信号(图10b)。这些金属的每个体素的扣除背景的中位数值(以校准计数/秒表示)分别为1,565、13,528和52,115。制备了来自该患有精原细胞瘤的52岁男性的的三行烧蚀轨道中每一行的相邻体素的三种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn和⁵⁶fe)的原始数值(校准计数/秒)的图形表示，并且示于图10c中。

全部地，以上实例证明了处于临床表现的放射抗性端的三种类型赘生物(成胶质细胞瘤、间皮瘤和黑素瘤)的金属含量特征，以及处于临床表现的放射敏感端的三种类型赘生物(b细胞淋巴瘤、小细胞肺癌和睾丸精原细胞瘤)的金属含量特征。

实施例4

la-icp-ms方法在患者队列中的应用

尽管上述实例举例说明了每一类癌症患者中的单个个体的金属含量特征，但是对55例精原细胞瘤患者、10例淋巴瘤患者、20例小细胞肺癌患者、64例黑素瘤患者、25例多形性成胶质细胞瘤或星形细胞瘤患者、和10例间皮瘤患者的深入分析揭示了其总锰含量存在两种情形(dichotomy，二分法)，并且确定了这些癌症类型的放射治疗所已知的临床结果且示于图11中。确定并示出了患有睾丸(精原细胞瘤)、淋巴瘤、小细胞肺癌、间皮瘤、脑部(多形性成胶质细胞瘤和星形细胞瘤)和黑素瘤的癌症的患者的肿瘤中的游离锰离子含量的总中位数(以校准计数/秒表示，⁵⁵mn的cc/s)。除了两例黑素瘤情况(64名患者中的两名在其肿瘤内各自具有两个主要谱系)外，每个方块表示一名病人，并且在直方图中用方块分别表示每个谱系。

公认的临床情况为精原细胞瘤、淋巴瘤和小细胞肺癌中的约85％对放射敏感，导致肿瘤大量减少，有时甚至被完全消除，因而延长预期寿命。与这些值相一致且如本文所确定的，发现89％的精原细胞瘤患者、80％的小细胞肺癌患者、90％的淋巴瘤患者体内的总肿瘤锰含量为低于2000cc/s。在这方面，首次证明了总肿瘤锰含量值低于2000cc/s阈值的这类对放射敏感的肿瘤之间的相关性。

与上述相对的是，有三种类型的肿瘤(间皮瘤、多形性成胶质细胞瘤与星形细胞瘤、和黑素瘤)被认为是对放射具有较强抗性的且还具有一定比例的不同敏感性，这三种类型的肿瘤呈现出不同的结果。不仅这三种肿瘤类型的每一种之间的差异大大增加，而且90％的间皮瘤、85％的多形性成胶质细胞瘤与星形细胞瘤、和59％的黑素瘤均具有高于2000cc/s的锰值。

鉴于上述的二分法(dichotomy)，金属含量(例如，肿瘤的锰含量)可以成为放射治疗的关键指标，而在本发明之前，一直都未认识到可以将其用于实用临床护理。在利用35微米像素的这些实施例中，患有总锰含量较低(例如，低于2,000cc/s)的肿瘤的个体非常可能从放射治疗中获得益处，而具有锰含量(例如，显著高于2,000cc/s)的患者很可能通过避免放射治疗而受益。随着像素尺寸增加，cc/s将增加，并且因此设想了更高的阈值。由于值的范围保持在线性范围内，因此没有出现成问题的统计学问题。

考虑到大多数癌症患者接受基于医疗技术的放射治疗，而不是与肿瘤特征相关的量化数据，这类数据支持例如使用la-icp-ms将量化数据用于临床实际。医疗技术涉及仅仅通过利用放射治疗能够根除多少百分比的原发性癌症、如此所需要的放射剂量，以及各种转移病灶对烧蚀放射治疗的易感性百分比。而作为一种以人群为基础的方法，它不适用于特定患者的肿瘤，也不适用于“个性化医疗”。

统计学分析

双样本非参量的柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验(kolmogorov-smirnov(k-s)test)比较了两个数据集的累积分布。零假设是两个数据集都是从具有相同分布的群体中采集的。

根据以上数据，睾丸癌(精原细胞瘤)与淋巴瘤的值分布之间的比较产生了0.2182的d值，其具有0.762的相关非显著性p值；精原细胞瘤和淋巴瘤之间没有显著差异，并采集于具有相同分布的群体。

睾丸癌(精原细胞瘤)与小细胞肺癌的值分布之间的比较产生了0.3182的d值，其具有0.081的相关非显著性p值；精原细胞瘤和小细胞肺癌之间没有显著差异，并采集于具有相同分布的群体。

小细胞肺癌与淋巴瘤的值分布之间的比较产生了0.3000的d值，其具有0.507的相关非显著性p值；小细胞肺癌与淋巴瘤之间没有显著差异，并采集于具有相同分布的群体。

结论：来自精原细胞瘤、淋巴瘤和小细胞肺癌的数据表示了统计学上有效的单一群体(unitarygrouping)。

脑癌(成胶质细胞瘤和星形细胞瘤)与间皮瘤的值分布之间的比较产生了0.3250的d值，其具有0.371的相关非显著性p值；脑癌和间皮瘤之间没有显著差异，并采集于具有相同分布的群体。

脑癌(成胶质细胞瘤和星形细胞瘤)与黑素瘤的值分布之间的比较产生了0.2226的d值，其具有0.277的相关非显著性p值；脑癌和黑素瘤之间没有显著差异，并采集于具有相同分布的群体。

黑素瘤与间皮瘤的值分布之间的比较产生了0.4303的d值，其具有0.056的相关非显著性p值；黑素瘤和间皮瘤之间没有显著差异，并采集于具有相同分布的群体。

结论：脑癌、间皮瘤和黑素瘤是统计学上有效的单一群体。

组间比较

睾丸癌(精原细胞瘤)与脑癌的值分布之间的比较产生了0.7712的d值，其具有0.000的相关显著性p值；精原细胞瘤和脑癌显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

睾丸癌(精原细胞瘤)与间皮瘤的值分布之间的比较产生了0.8455的d值，其具有0.000的相关显著性p值；精原细胞瘤和间皮瘤显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

睾丸癌(精原细胞瘤)与黑素瘤的值分布之间的比较产生了0.6879的d值，其具有0.000的相关显著性p值；精原细胞瘤和黑素瘤显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

淋巴瘤与脑癌的值分布之间的比较产生了0.7750的d值，其具有0.000的相关显著性p值；淋巴瘤和脑癌显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

淋巴瘤与间皮瘤的值分布之间的比较产生了0.9000的d值，其具有0.000的相关显著性p值；淋巴瘤和间皮瘤显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

淋巴瘤与黑素瘤的值分布之间的比较产生了0.6727的d值，其具有0.000的相关显著性p值；淋巴瘤和黑素瘤显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

小细胞肺癌与脑癌的值分布之间的比较产生了0.7333的d值，其具有0.000的相关显著性p值；淋巴瘤和脑癌显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

小细胞肺癌与间皮瘤的值分布之间的比较产生了0.9000的d值，其具有0.000的相关显著性p值；淋巴瘤和间皮瘤显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

小细胞肺癌与黑素瘤的值分布之间的比较产生了0.6273的d值，其具有0.000的相关显著性p值；淋巴瘤和黑素瘤显著不同，并采集于具有不同分布的群体。

结论：发现精原细胞瘤、淋巴瘤和小细胞肺癌的单一群体在统计学上与脑癌、间皮瘤和黑素瘤的单一群体不同。

统计学上的分析表明，淋巴瘤、小细胞肺癌、脑癌和间皮瘤服从于正态分布，而对于黑素瘤和精原细胞瘤来说并非如此，它们既不符合正态分布也不符合对数正态分布。

采用柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验的统计学分析指示了图11中示出的黑素瘤值的分布既不符合正态分布也不符合对数正态分布。如在后面的实施例中所示的，黑素瘤表现出异质性，其是由黑色素(与多种金属结合的异质聚合物集)的胞内和胞外沉积、以及通过存在分布于多种类型的黑素瘤中的高金属含量区域(hmr)而增加的。这些hmr展现出隐藏的原子变化，通过本申请中描述的技术首次揭示了这些原子变化。通过常规的病理检查无法检测到这些区域。

图11中的精原细胞瘤很可能由两种群体组成，一种是组成主要个体的变化较小的群体，而另一种是更加多变的且从2kcc/s延伸到4kcc/s的群体。图11中的大部分精原细胞瘤可能对应于对放射具有极强反应性的临床组，而其余亚组则相对具有更强的放射抗性。这一发现与临床数据一致(见下文)。还应该指出的是，图11所示的精原细胞瘤是一组单一群体，即在病理环境下的“经典”精原细胞瘤。尽管该精原细胞瘤细胞在表面上看上去具有形态同质性，但是金属含量分析揭示了在传统分析中所隐藏的潜在异质性。

1.睾丸癌

对于睾丸肿瘤，主要差异相对较为简单，睾丸生殖细胞瘤(gct)分为两大类：精原细胞瘤和非精原细胞瘤。对于表现出睾丸“癌症”的患者而言，大约50％的患者被诊断为患有精原细胞瘤。在这些患者之中，约85％表现出i期疾病，其余的表现为临床上的iia期和iib期。(iia期与iib期之间的区别在于前者的淋巴结为≤2cm，后者的淋巴结为2至5cm)。

半个多世纪以来，睾丸精原细胞瘤的术后放射治疗一直是辅助治疗的主要手段。精原细胞瘤是对放射最敏感的肿瘤类型之一，其中i期睾丸精原细胞瘤的临床试验表示，在5年内20格雷(gray)的治疗剂量(在2周内分10次给予)足以达到近98％的治愈率(jones等人，journalofclinicaloncology,23,1200-1208,2005；medicalresearchcounciltrialte18/europeanorganisationfortheresearchandtreatmentofcancertrial30942(isrctn18525328))。该放射剂量与用于更严重程度的胶质瘤(如多形性成胶质细胞瘤)的60gy(高达90gy)相比，总体存活时间仅增加了数月。

充分描述了对早期精原细胞瘤的极端放射敏感性，对于睾丸上皮内瘤变(其是更具有侵入性癌症的前兆)，将剂量降低至13gy(sedlmayer等人，intjradiat.oncol.biol.phys.50,909-913,2001；classen等人,brjcan.88,828-831,2003)。欧洲生殖细胞共识小组(europeangermcellconsensusgroup)在2008年总结了其立场，其中20gy(每次单次剂量为2gy)是推荐的放射治疗剂量(krege等人，eur.urol.53,478-496,2008)。作者指出，针对ii期睾丸精原细胞瘤，iia期的总剂量为30gy且iib期的总剂量为36gy“似乎是合理的”。这两种剂量“似乎是合理的”的陈述强调了现有技术的不精确性(krege等人，eur.urol.53,497-513,2008)。还应当注意的是，尽管36gy是推荐剂量，然而classen等人先前已经指出针对ii期，存在降低剂量的可能性(classen等人,jclinoncol21,1101-1106,2003)。还应该指出的是，针对iia期的无复发存活率为95％，而针对iib期无复发存活率则为89％。整体存活率接近100％。

美国针对i期和ii期精原细胞瘤的建议与上述的欧洲建议一致。直到2015年，mead等人对许多临床试验的证据进行了评估，并推荐对于i期精原细胞瘤进行如上治疗(mead等人，journalofthenationalcancerinstitute，103,241-249,2011)。对于iia期精原细胞瘤，在总腺病区域内，推荐对主动脉旁淋巴结和上方同侧骨盆以25至35gy的总剂量进行低剂量放射治疗。

通过比较睾丸癌与脑癌的放射敏感性，将生殖系肿瘤的精确敏感性纳入考虑范围。

2.脑部癌症

对于成人神经胶质瘤的管理和治疗，在临床实践上存在相当大的变化，其中在澳大利亚和新西兰发生的频率如下：4％的星形细胞瘤i级；10％的星形细胞瘤ii级；22％的星形细胞瘤iii级；52％的多形性成胶质细胞瘤iv级；以及剩余为少突神经胶质瘤和少突星形细胞瘤(澳大利亚癌症委员会/澳大利亚癌症网络/澳大利亚临床肿瘤学会(cancercouncilaustralia/australiancancernetwork/clinicaloncologicalsocietyofaustralia)，isbn978-0-9775060-8-8；2009)。本发明感兴趣的是多形性成胶质细胞瘤，在这些类型的神经胶质瘤中其是最高级的，因为放射科医师认为它具有放射抗性。此外，成胶质细胞瘤与星形细胞瘤iii期在其金属组学方面的比较与临床比较不同(见下文)。针对级别高的星形细胞瘤，标准放射治疗的治疗剂量为60gy(每次为2gy，有时增加至10gy)，但是目前还没有数据以确定针对iv级胶质瘤(如多形性成胶质细胞瘤)的最佳剂量。针对iii级胶质瘤，许多放射科医师采用59.4gy的剂量(每次使用1.8gy)，为了将iii级胶质瘤对组织造成的影响减少，“预期”将每次剂量减少10％，从2.0gy降低到1.8gy。

两组iii期临床试验与这些数据有关：放射治疗肿瘤组(rtog7401)和东部肿瘤协作组(ecog1374)(nelson等人，ncimonogr.6,279-284,1988和chang等人，cancer,52,997-1007,1983)。在治疗组(放射、放射加放射增强、放射加bcnu以及放射加ccnu)之间不存在存活差异，并且在间变型星形细胞瘤和成胶质细胞瘤之间差异不大。在间变型星形细胞瘤和成胶质细胞瘤之间的存活结果差异微小的情况下，显著的是，这些类别的金属学数据是不均匀的(它们的分布重叠)，并且在采用柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验进行测试时彼此没有显著差异(p＝0.581)。

对全脑进行放射治疗的中心问题是发生多种并发症(如神经认知问题、脑白质病和内分泌病)。虽然已经通过累及野放射治疗(ifrt)使一些并发症得以改善，但复发频率并没有改变，也没有改变患者出现多局灶性失败的百分比。

显然需要对患者进行更好的个性化治疗，例如，对那些处于临床表现的放射敏感端的患者进行放射治疗，同时不对可能对放射具有抗性的患者进行放射治疗。考虑到本申请所提供的包括金属学数据在内的新知识，目前的通用疗法(例如，放射治疗)是过时的。

3.浆膜的癌症；间皮瘤

间皮瘤被认为是对放射具有抗性的，并且治疗方案是给予54gy的剂量，每次递送1.8gy。

间皮瘤的临床情况与医生所面对的其它肿瘤类型区别不大。在首次检查手术可切除的肿瘤时，存在三种经典的方式：确定无疑的外科手术、放射治疗和全身化学疗法。在间皮瘤的情况下，确定无疑的外科手术带来的作用是有争议的，肿瘤切除术是否会使具体患者的存活率得到改善不得而知，并且不存在与该间皮瘤相关的前瞻性临床试验。目前也没有充分的强有力的随机iii期临床试验来说明在手术之前或手术之后进行放射治疗和化学疗法联合治疗的效果，最近的试验是在胸外全肺切除术后采用54gy的半胸部放射治疗的ii期临床试验(rusch等人,jthoraccardiovascsurg122,788-795,2001)。

4.小细胞肺癌

放射科医师和内科医师都认为小细胞肺癌是对放射治疗具有良好反应率的放射敏感性肿瘤。欧洲肿瘤医学学会(europeansocietyofmedicaloncology)(esmo)已经记录了其修改后的肿瘤结节转移分类和分期分组，并公布了其诊断、治疗和随访指南(fruh等人，annalsofoncology,24,(增刊6),vi105,2013；表3)。意图治愈的最佳总体存活结果为45gy的总剂量，每日每次1.5gy，连同使用化学疗法(turrisi等人，nengljmed,340,265-271,1999)。

5.淋巴瘤

澳大利亚癌症委员会(cancercouncilaustralia)和澳大利亚癌症网络(australiancancernetwork)已经为淋巴瘤的诊断和管理制定了临床实践指南(isbn:0-9775060-0-2；2005)。对于临床ⅰ-ⅲ期的低程度滤泡性淋巴瘤，其推荐进行30至36gy的累及野放射治疗。对于成人非霍奇金淋巴瘤，美国国家癌症研究所(usnationalcancerinstitute)建议使用25gy至50gy之间的剂量。对于本文所述的弥漫性b细胞淋巴瘤，美国国立综合癌症网络(nationalcomprehensivecancernetwork)(nccn.org；2015)建议，经过化学疗法后的剂量为30-36gy，作为难治性化学疗法或不适合化学疗法的主要治疗方法的剂量为45至55gy，对于用于干细胞转移前后挽救的剂量为30至40gy。在包括非霍奇金淋巴瘤的不同临床表现中，一些患者患有长时间处于惰性的肿瘤，而另一些患者病情进展迅速并需要进行立即治疗。从以上可以看出，在放射治疗方面，这在很大程度上是一种普遍情形。

6.黑素瘤

通常认为黑素瘤是对放射具有抗性的肿瘤，但是数据存在相互矛盾性，其中的许多证据来源于已经表现出广谱放射应答性的细胞系。澳大利亚癌症理事会(cancercouncilaustralia)/澳大利亚癌症网(australiancancernetwork)/新西兰卫生部(ministryofhealthnewzealand)已经详细阐述了在澳大利亚和新西兰的黑素瘤管理的临床实践指南。对于澳大利亚，参见isbn978-0-9775060-7-1，对于新西兰，参见isbn(电子)978-1-877509-05-6。wazer等人对临床数据进行了概述，然而该数据也是相互矛盾的(wazer等人,uptodate,2015)。wazer等人通过回顾临床试验，得出了结论：黑素瘤是放射应答性的肿瘤，但是“最佳剂量和次数仍不确定”。对于转移性疾病而言，在皮肤、淋巴结、内脏之间转移或者转移至骨或脑的放射应答性是显著不同的。(需要注意的是，在金属学数据方面的相互矛盾的临床试验数据反而具有更好的科学意义，如图1所示的，患者之间锰含量的范围很广，单个肿瘤内的差异很大)。取决于黑素瘤的部位，剂量从32gy到100gy不等。最后，尽管放射治疗对于在骨、脑和内脏转移情况下的姑息治疗是有用的，但是是否大剂量放射能够实现缓解仍不是很清楚。

实施例5

黑色素和形态不均匀性和放射敏感性/不敏感性

如上所述，具有储存不同化学元素(尤其是金属)的能力的黑色素的分布可能是黑素瘤所见变化的主要原因。图1是h&e染色的黑素瘤的图像，显示出形态上的不均匀性，这种不均匀性在两个不同的谱系中清楚可见；一个谱系是染色较浅的且基本上无色素的，另一个谱系是染色较深的并含有细胞内和细胞外的黑色素。此外，无色素区域的细胞在核大小和形态方面比黑色素沉着区域的细胞更均匀，这是一个影响ati的发现。细胞群对多个特征中的任何一个特征的变化越小，该细胞群对任何扰动的反应就越受限制。测定了如图1所示的同一组织切片顶部的金属含量。图12示出了获得自黑素瘤的烧蚀轨道的二维表示。这些数据说明了同一肿瘤的不同部位的锰含量的变化，并且强调了表征二维图形的重要性，以便对患者是否应该接受放射治疗作出明智选择。在这些以视觉选择的区域中的锰的背景校准中位数值是31,939校准计数/秒和3,045校准计数/秒。

二维图形提供了对于肿瘤内的存在于指定阈值以上的采样区域的比例的估计。在以上的样品中，例如，可以限定二维图形中的低于第10百分位数、第20百分位数、第30百分位数、第40百分位数、第50百分位数等等的比例，从而实现量化。因此，例如，如果90％的采样面积具有非常低含量的锰，那么肿瘤作为整体可能是对放射敏感的。另一方面，如果90％的面积具有高含量的锰，照射对于肿瘤几乎是没有意义的，因为放射并不会使大部分肿瘤受损伤。需要注意的是，这些百分位数并不可能获得自针对分子作用已经是“分散”的肿瘤样品。

对图1的同一肿瘤进行进一步分析，并测定所有4种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu)的含量，结果示于图13中。从形态上看，这些结果明显存在两种情形。随着烧蚀从左侧(具有较高值)到右侧(具有较低值)，拐点发生在体素34周围。

另一方面，形态均匀的黑素瘤仍然可能显示出金属含量大不相同。例如，图14示出了来自一名54岁男性的左食指的黑素瘤(第iv期，t4n0m1)的h&e染色的组织切片。该具体黑素瘤具有均匀的形态，并且对于有经验的病理学家来说病理学似乎没有显著区别(图14，上部小图)。测定了在这种黑素瘤内的金属含量，结果示于图14的下部小图中。潜在的二维金属含量非常不同。事实上，存在两种较高浓度的细胞含有高含量的锰。

测定该肿瘤样品群体的⁵⁵mn值中位数为817校准计数/秒(背景校正的)，这将肿瘤置于放射应答性谱的极敏感端。另一方面，发现两个发白的平坦区域中的较大区域(即hmr)的值超过6,500校准计数/秒，这将肿瘤置于放射应答性谱的放射抗性端。

从体素矩阵的视觉检查看这两个区域是明显的。然而，严格的阈值分析对于这两个hmr区域的深入分析是必要的，并且该分析结果示于图15和16中。如本文所使用的，在涉及高金属含量区域(hmr)中的特定金属时，例如，将hmr分别称为hmr(⁵⁵mn)、hmr(⁶⁶zn)、hmr(⁵⁶fe)和hmr(⁶³cu)，其中hmr(^am)是指任一金属的常规情况。

图15的小图a示出了通过标准的h&e病理学可视化的22×60个体素(从约1800个体素区域中取样)的肿瘤区域的均匀形态学性质。小图b示出了通过视觉检查每个体素的数字而发现的两个hmr(⁵⁵mn)区域。小图c示出了在将整个区域每个体素的中位数加上整个区域体素的标准偏差(st.dev)作为阈值时(中位数+标准偏差)，出现在该22×60个体素的二维图像中的hmr。另一种阈值方法也明显地示出了在该22×60个体素的二维图像中的两个同样的区域(小图d)，第二种方法利用的是整个区域的体素值的中位数的两倍(2×中位数)。

如由小图c和d中出现的在阈值以上的聚类体素的分布所看到的(灰色方块背景中的黑色方块)，采用(中位数+标准偏差)对比(2×中位数)的结果在发掘hmr(⁵⁵mn)方面几乎是相同的。对六种类型肿瘤的分析示出了2×中位数法可能比中位数+标准偏差法在检测hmr(⁵⁵mn)、hmr(⁶⁶zn)、hmr(⁵⁶fe)和hmr(⁶³cu)方面更具有一致性。虽然对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明可以采用任一种方法，但是作为非限制性实例，在本文所示的后续分析中已经采用了2×中位数的方法学。

图16示出了涉及相同原子图像中的hmr(⁵⁵mn)和hmr(⁶⁶zn)分布的其它重要发现。顶部小图示出了与图15相同的h&e肿瘤图像，中间小图示出了检测到的两个hmr(⁵⁵mn)区域，并且底部小图示出了与小图b中体素矩阵体素相同的体素的锌的分布。与两个hmr(⁵⁵mn)不同的是，只有小块hmr(⁶⁶zn)区域出现，该区域的hmr高于2×中位数的锌阈值。锌值、铁值和铜值通常保留在hmr(⁵⁵mn)区域的肿瘤区域中。这种概括对于黑色素肿瘤的富含黑色素的区域不成立，其中所有这四种金属都发现为具有较高浓度，与黑色素颗粒浓度一致。

本领域技术人员应该认识到，存在许多得到阈值的数学方法和统计方法，这些方法可用于揭示最常用于放射治疗的临床决策的感兴趣肿瘤的金属含量区域。

图17提供了出现在不同肿瘤类型(如放射敏感性肿瘤与放射抗性肿瘤)中的hmr(⁵⁵mn)的程度的实例。将一名患有小细胞未分化肺癌的51岁女性患者(第1期，t1n0m0)与患有左食指黑素瘤的54岁患者(第iv期，t4n0m1)进行比较。为了举例说明的目的，对于这两种肿瘤中的每一种，在此使用的区域对应于约1mm×1mm的样品(31×31个体素，共961个体素)。图17中的8个小图采用四种不同的阈值示出了⁵⁵mn浓度的区域，该四种不同的阈值为(i)t1，高于0.5×中位数的阈值，(ii)t2，高于1.0×中位数的阈值，(iii)t3，高于1.5×中位数的阈值，和(iv)t4，高于2.0×中位数的阈值。

在小细胞肺癌的情况下，保持在最高阈值(2×中位数)以上的体素通常是散布在整个样品中的非连续体素(单体素)。在这种对放射敏感的肿瘤样品中，很少有连续或相邻浓度的hmr(⁵⁵mn)体素。然而，来自黑素瘤患者的四个右侧小图示出了在t3(1.5×中位数)处易于被辨别的连续hmr(⁵⁵mn)体素的出现，并且在更严格的t4等级(2×中位数)下仍存在这些hmr(⁵⁵mn)。

作为非限制性的实例，图18的数据示出了，在将同样的阈值标准应用于这两种肿瘤的相同体素，同时测定了hmr(⁶⁶zn)时，在该特定患者的小细胞癌中在t1、t2、t3和t4阈值处未发现hmr(⁶⁶zn)区域，并且在黑素瘤患者的肿瘤中只有少量的连续zn体素是明显的。如图17所示，在这两种肿瘤中，⁶⁶zn体素值的分布保持相对恒定，而hmr(⁵⁵mn)在黑素瘤中占主导地位。

在接下来的7个图(图19至25)中，通过非限制性实例的方式进一步强调了两种肿瘤类型(一种是放射敏感性的，另一种是放射抗性的)的比较。这些图举例说明了来自184名患者的数据，这些患者肿瘤是放射应答性谱的两端的示例：小细胞肺癌、淋巴瘤和睾丸癌处于谱的放射敏感端，而间皮瘤、脑瘤和黑素瘤处于谱的放射抗性端。

作为非限制性的实例，以下提出了具有高金属含量的肿瘤区域的概述及其临床意义。

图19示出了在对约1800个体素的肿瘤区域进行采样时，来自20名患有小细胞肺癌的患者中的每一个患者的⁵⁵mn体素数据。由方块表示每名患者的肿瘤群体(thebulkofthetumour)的⁵⁵mn值中位数，并且置于200合并计数/秒(处于0cc/s至7,000cc/s的范围内)的区间内。所有20名患者全都患有肿瘤，其中群体⁵⁵mn值低于3,000cc/s(灰色方块)。在采用t4阈值(2×中位数)时，二十名患者中的十四名患者(位于顶线上方，由灰色方块表示)不具有hmr(⁵⁵mn)。相对地，6名患者的肿瘤(从t1到t6)具有单个hmr(⁵⁵mn)(由虚线将黑色方块连接到灰色方块)。在具体实例中，患者t6肿瘤群体的⁵⁵mn值中位数在2400至2600区间(灰色方块)，但该肿瘤也具有值处于6,400至6,600区间的hmr(⁵⁵mn)(黑色方块)。超过阈值的6个患者样品(t1至t6)hmr(⁵⁵mn)的连续体素的数目分别占样品肿瘤区域的4.9％、3.1％、2.1％、12.3％、12.6％和5.2％。在t2、t5和t6这三名患者中，其hmr(⁵⁵mn)的⁵⁵mn含量超过4,000cc/s。这些区域可能含有表现出一定程度的放射抗性的细胞。

作为非限制性的实例，最小8×8体素的区域有效地展示了高金属含量的区域。本领域技术人员将会理解，在小于该尺寸的范围内，并且取决于所采用的仪器的灵敏度，获得越来越小的hmr，直到它们最终与随机产生的单态背景不可区分，如图17的小细胞肺癌所示。具有8×8hmr的图像在x'和y'方向都有界限。可以设想，大于x8×y8体素的hmr可以分别地在x'和y'方向上以整数增加，得到x[8+1]×y[8]^:x[8]×y[8+1]^:x[8+1]×y[8+1]^:x[8+2]×y[8]^:x[8+2]×y[8+1]^:x[8+2]×y[8+2]^:x[8+1]×y[8+2]^:x[8]×y[8+2]^…至x[8+n]×y[8+n]的hmr，其中n是整数，从1到数千不等。优选地，在样品为30×30个体素(取样1mm²)时，整数从1到100变化，更优选地从1到22变化。本领域技术人员将理解，可以将阈值设定为比最小8个体素还要低。在此采用的值为8，是因为是经过经验推导出的，并且可以作为hmr的高效搜索工具的实例。

hmr的大小

任何hmr的重要描述符是其大小、形状和含量。对184名患者的6种类型肿瘤进行了分析。本领域的技术人员将理解，hmr的大小、形状和含量可以变化，并且对最小面积的限定将取决于机器抖动，并且在一些情况下，单个体素可以代表罕见的低频电子“尖峰”数据。此外，机器的“不顺畅运转”偶尔会在x方向或y方向上产生两个或三个连续的高值，但能够通过合适的图像过滤软件容易地识别出来。

鉴于以上所述，任何金属的hmr[hmr(^am)，其中^am＝任何金属]可以包含两个相邻的体素以满足体素连续性的标准。图20的小图a示出了八种不同的理论方式，其中两个相邻的体素(双峰)可以由参考单个体素(星号)配置。hmr(^am)的大小可以从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等连续体素变化至一整数(用于分析该特定肿瘤而选择的样品大小)。本领域技术人员将理解，根据本发明的hmr(^am)的大小处于使用现有技术能够测定的任何范围内。例如，hmr(^am)大小可以在2个体素至约800,000个体素的范围内，以及在两者之间的任何值(如果将肿瘤材料加载到普通载玻片的边缘，可以用于分析的最大数量为35×35微米像素)。本领域技术人员还将理解，hmr可以应用于肿瘤中的癌细胞、或通常称为相关基质的细胞和非细胞物质的区域(由于与邻近的癌细胞的相互作用，其本身可以处于“活化”状态)。

对于临床应用，单个样品大小的面积通常是1mm²，由于在常规病理分析中具有该大小的先例。因此，病理学家在检查肿瘤切片的有丝分裂速率时，例如在黑素瘤中，他们通常使用每个高倍视野或每十个高倍视野中的有丝分裂数量(burton等人，2012,am.jsurg.204,969-974)。作为非限制性的实例，就hmr(^am)而言，在本申请中，1mm²样品便利地近似于1,000个体素。可以将多个1mm²样品从载玻片上的单个组织切片上激光切除。可以将多个1mm²样品从同一肿瘤群体的多个切片上激光切除。可以将多个1mm²样品从表示来自相同肿瘤(或其转移性衍生物)的不同样品的多个块上激光烧蚀。对于单个肿瘤，从多个样品确定的累积hmr(^am)大小可以从4个体素(2个双元素)变化到几百万个体素不等。将理解的是，上限受到分析结果所需时间和医疗费用的实用性的限制。

hmr的形状

作为非限制性的实例，在1mm²的样品大小(或35×35×5微米的样品，～1000个体素)内，可以存在符合体素邻接条件的大量hmr(^am)形状。如在本文中首次描述的，常见的形状是通过实例在图14和15的黑素瘤患者数据中示出的并在图20的小图b和c中风格化地表示的形状。如小图d、e、f、g和h所示的图案表现出不同的肿瘤类型。例如，小图d是淋巴管或淋巴导管恶性上皮细胞系中的一种，如在乳腺癌和前列腺癌中的。小图e和g将表示经典的“单行”移动的细胞，其遵循肿瘤中的结构基序，如成胶质细胞瘤或星形细胞瘤中的胶原束或主要神经管道，或示于乳腺癌切片上的单行模式。小图f示出了包含在血液或淋巴管内的癌症细胞的情况，如在乳腺癌的原位导管癌(dcis)中。小图h代表了一些黑色素肿瘤中的细胞和黑色素沉积物的分布。

可以理解的是，可以使用任何已知的数学方法和统计方法来分析矩阵和相关软件中的模式和不均匀性。这样的方法可以揭示许多种形状和尺寸的体素数量，然后可以将其映射到潜在的病理学图像上。

hmr(^am)的足迹及其在放射应答性上的值

采用2×中位数的阈值，在具有1000个体素的样品中，小图b、c、d、e、f和g中的hmr(^am)(图20中的黑色方块)分别占样品的4％、3.7％、2.4％、1.5％、3.7％和0.9％。

如图19所示，预期如果基于意向治疗或姑息治疗对患有肿瘤的患者t2、t5和t6进行放射治疗，那么将杀死大部分癌细胞(hmr(⁵⁵mn)的值<800、<1,800和<2,600)或将癌细胞完全破坏而不能进一步进行细胞分裂。然而，这些肿瘤的大多数细胞(hmr(⁵⁵mn)的值>4,000、>4,200和>6,400)能够存活，并及时产生新的肿瘤形式，表现出为肿瘤复发的熟悉的临床现象。

来自淋巴瘤、睾丸肿瘤、间皮瘤、脑癌和黑素瘤的hmr数据

图21示出了在通过激光烧蚀技术对约1,800个体素的肿瘤面积进行采样以测定⁵⁵mn含量时来自10名患有弥散性b细胞淋巴瘤的患者的数据。在采用2×中位数的阈值时，任一肿瘤都不具有hmr(⁵⁵mn)，如没有黑色方块示出。另外，所有⁵⁵mn的中位数都低于3,200cc/s。预期如果基于意向治疗或姑息治疗对这10名患者的肿瘤进行放射治疗，则将杀死细胞群体或将细胞完全破坏而不能进一步进行细胞分裂。从该领域的日常临床实践可以认识到，通过放射治疗易于根治大型淋巴瘤肿块。

图22示出了在对约1,800个体素的肿瘤区域进行采样时来自55名患有睾丸肿瘤的患者的数据。该55份肿瘤全都是典型的精原细胞瘤，根据病理学标准形成统一的组。由于通过放射治疗易于根治大型精原细胞瘤，因而放射肿瘤学家和医学肿瘤学家认为该肿瘤对放射非常敏感。在采用2×中位数的阈值时，这些精原细胞瘤中的51份肿瘤不具有hmr(⁵⁵mn)，如在顶部线上方的51个灰色方块所示的。相比之下，s4、s5、s6和s7四名患者相对于其群体值(灰色方块)具有单个hmr(⁵⁵mn)(黑色方块)。这四个hmr(⁵⁵mn)的大小范围占取样面积的1.8％至6.3％。在这四名患者中的两名患者(s6和s7)的hmr(⁵⁵mn)的cc/s值超过5,000cc/s，并且该区域可能含有对放射具有抗性的细胞。该数据支持了以下情况的可能性：在基于意向治疗或姑息治疗对这2名患者进行放射治疗时，细胞群体被杀死或被完全破坏而不能进一步进行细胞分裂，而含有hmr(⁵⁵mn)的细胞存活并及时产生新的肿瘤形式。

最后，如从这些精原细胞瘤的早期统计分析中发现的，它们不是单一组。很可能的是，三个精原细胞瘤患者(s1、s2和s3)的肿瘤位于顶端分布的极右侧尾部，它们的⁵⁵mn中位数在3,000和4,000之间，却具有一定程度的放射抗性。来自这三个异常值(以及来自患者s4、s5、s6和s7，这些患者的肿瘤具有hmr(⁵⁵mn))的数据与表明小部分的精原细胞瘤表现出放射抗性迹象的临床数据一致。

图23示出了在对约1,800个体素的肿瘤区域进行取样时的10名间皮瘤患者的数据(间皮瘤被认为是具有放射抗性的实体)。在采用2×中位数的阈值时，其中的9名患者不具有hmr(⁵⁵mn)，如在顶线上方的灰色方块所示。一名cc/s体素值的中位数最低的患者具有cc/s超过5,000(黑色方块)的单个hmr(⁵⁵mn)，hmr(⁵⁵mn)的大小占取样面积的3.2％。重要的是，大多数间皮瘤⁵⁵mn值超过以上三种敏感肿瘤类型的⁵⁵mn值。

图24示出了在对约1,800个体素的肿瘤区域进行采样(脑肿瘤在很大程度上被认为是具有放射抗性的)时，来自25名脑肿瘤患者(成胶质细胞瘤和星形细胞瘤)的发现。在采用2×中位数的阈值时，其中的24名患者不具有hmr(⁵⁵mn)，如顶线上方的灰色方块所示。一名⁵⁵mn值中位数较低的患者具有单个hmr(⁵⁵mn)，其hmr(⁵⁵mn)的cc/s超过6,000，并且hmr(⁵⁵mn)的大小占取样面积的3.6％。虽然大多数脑部⁵⁵mn值大于以上三种敏感肿瘤类型的⁵⁵mn值，但是这些数据表明，一些成胶质细胞瘤和星形细胞瘤将对放射治疗起反应，由于其中的八名患者的⁵⁵mn值的中位数低于3,000cc/s。

图25示出了在对约1,800个体素的肿瘤区域进行采样时的来自64名黑素瘤患者的数据，一直以来都认为黑素瘤是具有放射抗性的肿瘤。黑素瘤相对于其它五种肿瘤类型显示出非常广泛的异质性，其中的29名患者的肿瘤不具有hmr(⁵⁵mn)，35名患者的肿瘤具有hmr(⁵⁵mn)。与先前的五种肿瘤类型不同(其中hmr(⁵⁵mn)作为单一实体存在于肿瘤样品中)，一半的黑素瘤在同一肿瘤内具有多个hmr。hmr(⁵⁵mn)的大小占取样面积的1.6％到21.8％不等。由于在本文中严格地采用2×中位数的阈值，因而每个样品的hmr(⁵⁵mn)值实际上是最小的估计。图25还示出了，对于近30％的肿瘤，肿瘤群体的中位数低于2kcc/s阈值(灰色方块)，并且对于三分之二的肿瘤，大部分体素的中位数低于4kcc/s阈值(灰色方块)。

事后看来，这些原子数据表明了许多黑素瘤具有对放射敏感的区域。就转移性疾病而言，在皮肤、淋巴结、内脏转移与转移至骨或脑之间的放射应答性存在显著差异。人们对于黑素瘤具有放射抗性的普遍看法是基于相互冲突的数据，尤其是基于在放射治疗后一些黑素瘤消融而另一些黑素瘤尽管经受了放射治疗却仍可以迅速杀死患者的发现。在本文中展示的金属学数据首次表明了如何通过发现先前未知的黑素瘤肿瘤hmrs(⁵⁵mn)来部分地解释传统上相互矛盾的数据。

图25还示出了88％的黑素瘤hmr(⁵⁵mn)超过4,000的cc/s值(黑色方块)，并且近一半的hmr(⁵⁵mn)值超过10,000，并且一些的hmr(⁵⁵mn)值接近100,000。这些新的数据表明，许多黑素瘤可能最初是放射敏感性的，但是由于大部分hmr含有大量的锰，所以这些细胞群可能在放射治疗后存活，并且肿瘤可能会从放射抗性的残余物中再生。临床结果是患者在放射治疗后癌症复发，复发的肿瘤比初始肿瘤更具有抗性。其次，许多黑素瘤含有大量细胞外和细胞内的黑色素，而且正如本申请数据首次展示的，在通过激光烧蚀分析的组织切片中，黑色素可以通过下面概述的生物化学过程来促成放射抗性。

黑色素是三维结构不确定的非均匀聚合物，该非均匀聚合物形成由二羟基吲哚和苯并噻嗪环的重叠片层和各种未鉴定的化学基团所组成的多层复合物(zecca等人，trendsinneurosciences,26；578-580,2003)。在神经黑色素的情况下，还存在大量的多不饱和脂质。神经黑色素可以汇集许多金属(包括铬、钴、汞、铅和镉)，并且对此种应用重要的是，神经黑色素还含有mn、zn、fe和cu的同位素(图26)。可以将黑色素释放于细胞外，并且由于其化学特性，黑色素可以在细胞外环境中存活较长时间。黑色素具有放射保护特性，通过生活在切尔诺贝利(chernobyl)核反应堆壁上的及生活在目前正在运行的核反应堆的冷却水中的黑化真菌得以证实。黑色素散射x-射线，并作为放射的屏蔽。尽管存在关于分离的黑色素性质的大量文献，但是仅在2007年的文献才首次尝试对其放射保护性质作出系统性的解释(dadachova等人,pigmentcellmelanomares.21；192-199,2007)。在本发明之前，还未实现在病理癌症材料水平上对黑色素的放射保护能力作出物理性解释以及未实现患者治疗与放射治疗之间的预测相关性。此外，迄今为止的大多数化学和结构研究都是基于分离的黑色素，而不是基于它们的原位分子特性，并且没有对在本文中所述的肿瘤的组织切片进行二维分析。这点是通过检查一名患有胸部恶性黑素瘤的45岁女性(第ii期，t4n0m0)的黑素瘤的黑色素含量来突出显示的(图27)。

为了清楚呈现和比较不同实体的含量，小图a和小图b是一式两份的相同h&e染色切片。在该切片中的黑色素分布非常明显，因而不需要通过黑色素特异性抗体进行染色来显示黑色素分布。在以下四个小图中示出了四种金属(⁶⁶zn、⁶³cu、⁵⁶fe和⁵⁵mn)的分布，并且与黑色素的分布相比较，它们在视觉上是可见的。

小图c示出了⁶⁶zn的二维分布，其最高浓度(黑色)与主要黑色素轨道共定位。在染色较浅区域中的大量⁶⁶zn值从3,000cc/s到18,000cc/s不等，而黑色素轨道中的⁶⁶zn含量从18,000到45,000不等。

小图d示出了⁶³cu(黑色)的二维分布，其也与黑色素分布密切相关。在染色较浅区域中的大量⁶³cu值为200cc/s至1,000cc/s，而黑色素轨道内的⁶³cu含量为1,000至4,000。

小图e示出了高含量的⁵⁶fe(黑色)，其也与黑色素分布密切相关。在染色较浅区域中的大量⁵⁶fe值为20,000cc/s至80,000cc/s，而黑色素轨道内的⁵⁶fe含量为80,000至100,000。

小图f示出了密切跟随黑色素轨道的⁵⁵mn含量。在染色较浅区域中的大量⁵⁵mn值为1,000cc/s至2,500cc/s，而黑色素轨道内的⁵⁵mn含量为2,500至10,000。如先前实例图12所示的，由严重黑化区域组成的hmr(⁵⁵mn)，可以达到的⁵⁵mn含量为100,000。因此，黑色素成为高含量金属的储存库，如果将金属释放出来的话，这些金属可以是放射抗性的重要因素。据我们所知，本文首次证明了癌组织的二维组织切片描述中的黑色素中的原位⁵⁵mn含量，并且按照金属和黑色素的这种共定位在以放射疗法进行患者治疗方面首次作出了量化性预测。黑素瘤对放射具有双重防御。首先是细胞中⁵⁵mn的累积。其次是产生大量的黑色素，该黑色素不仅能够储存⁵⁵mn，而且可以从结构上屏蔽电离放射。

图27中的富含黑色素的体素轨道的大小和形状可以与图20中概述的一些可能的体素聚集体的大小和形状(特别是图20的小图h)进行比较。

黑素瘤对于进一步的临床意义具有启发性，因为图25中呈现的数据可以细分为来自原发性肿瘤或来自转移部位的黑素瘤样品。这些数据显示在图28中。对于原发性黑素瘤患者和转移性黑素瘤患者的cc/s值中位数分布的比较得到了0.1889的d值，相关的非显著性p值为0.557。因此，在黑素瘤来源的⁵⁵mn值中位数方面，原发性黑素瘤和转移性黑素瘤与从具有相同分布的群体所取样的黑素瘤一致。

将原发性肿瘤的⁵⁵mn值分布与特异性地来自于已经转移至淋巴结的转移性肿瘤的⁵⁵mn值分布进行统计学比较得到0.2222的d值，相关的非显著性p值为0.442。因此，原发性肿瘤的⁵⁵mn值中位数和从淋巴结取样的肿瘤的⁵⁵mn值中位数与从具有相同分布的群体所取样的肿瘤一致。

将含有hmr(⁵⁵mn)的肿瘤的分布和不含hmr(⁵⁵mn)的肿瘤的分布进行检查以确定原发性肿瘤和转移性肿瘤在hmr(⁵⁵mn)频率上是否存在差异，结果是原发性肿瘤和转移性肿瘤之间不存在差异，得到的非显著性p值为0.457。因此，在⁵⁵mn值中位数的分布方面，原发性肿瘤与转移性肿瘤难以区分。目前还未探索出对原发性肿瘤与其在淋巴结中的转移性衍生物之间的差异性⁵⁵mn累积有利的生物化学过程，这点将支持以上发现。

尽管举例说明了⁵⁵mn含量及其在肿瘤组织中的二维区域内的分布，但是作为以针对⁵⁵mn分析的最佳区域为重点的鉴别指标，作为非限制性的实例，另一种金属(锌)也可以是有用的。许多区域的肿瘤含有与不同细胞谱系混合的癌细胞，以及正常细胞和非细胞成分。肿瘤环境可以包含成纤维细胞、细胞外基质组分、胶原纤维束、毛细血管、淋巴管和支持细胞(如周细胞和平滑肌细胞)、巨噬细胞、成骨细胞、破骨细胞和如在骨小生境中的羟磷灰石的组分。如果首先是选择用于ati量化的癌细胞群，那么可以采用锌来区分癌细胞和非癌细胞。因此，锌可以起过滤作用，以确保只有最相关的含有癌细胞的体素才被用来确定⁵⁵mn值及其分布。(需注意，锌不能用于区分放射敏感性细胞和具有放射抗性的细胞。)锌体素值允许初始地避免将区域错误地鉴定为hmr(⁵⁵mn)区域。在图29和30中进行了举例说明。

图29的小图a示出了来自一名患有未分化小细胞肺癌的54岁男性(第iiia期；t2n2m0)的h&e染色切片。从h&e来看，大部分非癌性细胞和非细胞性物质是染色较浅的区域，这是明显的。相对于染色较深的癌细胞，该染色较浅区域的⁶⁶zn体素值较低。在将适当阈值应用于⁶⁶zn数据时，小图b中产生的图像与在其上方的h&e图像中看到的不同区域极其相似。这表示仅基于小图b中所示的那些⁶⁶zn体素，在不受非癌区域体素的影响下，对该肿瘤样品中的⁵⁵mn值的分析是更合适的。该方法并不是要淡化基质组分的临床意义，而仅仅是为了将数据分析结果区分开来。利用⁶⁶zn对组织切片图像进行预先筛选，对如乳腺癌和前列腺癌等肿瘤是特别适用的，其中非癌物质与含癌细胞的体素是非常密切地混合在一起的。从以上图形的染色较浅区域可以看出，锌还可以用于确定哪些肿瘤部分可以最佳地产生基质群的ati。

图30示出了类似的实例，其中小图a示出了来自一名患有直肠恶性黑素瘤的66岁男性(第iib期；t4n0m0)的h&e染色切片。非癌细胞区域也是非常明显的，特别是在图6点钟方位的下面部分。在将适当的阈值应用于⁶⁶zn数据时，小图b中产生的图像反映出与其上面的h&e图像中看到的差异较大的细胞组分。利用⁶⁶zn进行预先筛选再次表明，仅利用小图b所示的那些⁶⁶zn体素，在不具有来自非癌/基质区域的体素的“污染”下，可以更准确地进行⁵⁵mn值的后续分析。

本领域技术人员将会理解，除了⁶⁶zn之外的其它原子元素及其相关同位素可以在区分基质的癌性组分、正常组分、活化组分和非细胞组分方面具有相同的有用功能，特别是在不同的组织中。

实施例6

乳腺癌

本文中呈现的数据首次证明了⁵⁵mn含量与涉及放射敏感性和放射抗性的肿瘤谱两端之间存在相关性。本文中呈现的数据还显示了存在先前所未知的hmr，该hmr是不能通过传统病理检查发掘的，而其对放射抗性发挥重要作用，且是肿瘤在放射治疗后可能复发的指标。此外，该数据还为源自基质组分和癌细胞群之间相互作用的金属成分所起的作用提供了依据。

作为非限制性的实例，根据本发明还分析了被较为宽泛地分类为“中等”放射敏感的肿瘤(例如，乳腺和前列腺)。

如本文中描述的对六种类型肿瘤所用的，将相同量化方法(即激光烧蚀-电感耦合等离子体-质谱)应用于15例乳腺肿瘤。在图31中呈现了这些数据的概括。经检查，这些乳腺肿瘤(灰色方块)的块⁵⁵mn值在1,000和4,400cc/s之间。基于该检测水平，其⁵⁵mn值确实是介于精原细胞瘤、小细胞肺癌和淋巴瘤的敏感值和成胶质细胞瘤、间皮瘤和黑素瘤的较高⁵⁵mn值之间。然而，超过70％的这些乳腺癌肿瘤存在hmr(⁵⁵mn)，其⁵⁵mn值从4,000cc/s延伸至16,000cc/s(下图中的黑色方块)。此外，利用严格的8×8检测阈值，一些肿瘤具有双重和三重hmr(⁵⁵mn)。在本发明之前，一直没有认识到原子数据与“乳腺癌是非常异质的”的临床观察一致。

在个性化医学背景下，目前的医疗技术认为乳腺癌为异质性的，并不可用于就哪些患者将从放射治疗中获益以及哪些患者应当避免放射治疗所带来的有害影响做出决定。而临床现实是，在不存在有用的预测指标以及存在统一的h&e病理学的情况下，在手术切除肿瘤之后，仍对大多数乳腺癌患者进行照射，例如在美国，以便看起来是进行了所有可能的治疗方式。乳房肿瘤的切除边缘可能较大，因此手术切除后的任何残余癌细胞可能存在于肿瘤周围的机会增加。尽管放射治疗进一步增加了破坏未被切除的细胞的可能性，但是在原子数据显示⁵⁵mn含量非常高的情况下，可以避免放射危害。在如此高⁵⁵mn的情况下，对于有意向进行治疗的患者，放射治疗在很大程度上是徒劳的。

图32的顶部小图示出了来自一名39岁女性的高分化浸润性导管乳腺癌(第iiia期，t3n1m0)的图像。h&e切片通过病理检查是统一不显著的。然而，在底部小图显示的原子数据揭示了隐藏的hmr(⁵⁵mn)异质性(较大的黑色区域)及其重要的临床意义。该乳房切片的面积经检查为约1mm²，以保持该面积与通常用于测定有丝分裂速率的标准样品大小一致。

图33示出了使用先前采用的标准阈值(t1，0.5×中位数；t2，1×中位数；t3，1.5×中位数和t4，2×中位数)用于同时分析两种原子元素(⁵⁵mn和⁶⁶zn)的31×31体素的约1mm²面积的分析结果。采用t4阈值，mn分析的两个hmr(⁵⁵mn)是明显不同的，而相同体素的⁶⁶zn保持在其肿瘤群体水平。这些hmr的关键特性正是⁵⁵mn含量。在小图t3和t4中，尺寸小于8×8阈值的潜在hmr(⁵⁵mn)明显高于其它两个。

对该约1mm²面积的进一步分析证实了与“汇集”数据的看上去均质性的病理样品的群体分析相比，分析hmr是有用的。对于⁵⁵mn和⁶⁶zn值，以直方图形式的样品中的所有961个体素的分析结果如图34所示。在顶部小图中，体素中较高⁵⁵mn含量的异质性被认为是超过5000cc/s(且达到约15,000)值的峰值和拖尾值(smearofvalue)。可以以严格的统计方式，例如通过使用bowley非参数偏差统计(npss)(bowley’snonparametricskewstatistic)分析体素含量来检查这种异质性(bowley,1901,elementsofstatistics,psking和son,出版商,威斯敏斯特,伦敦,英国)。作为非限制性的实例，将异质性应用于⁵⁵mn数据，并且npss值([平均值-中位数]/[标准偏差])为0.25，而对于更对称的⁶⁶zn数据，异质性为0.02，表示差异很大。本领域技术人员将清楚，有很多种统计方法测定异质性，可以与本文所示的偏度一起使用。

进一步的面积分析揭示了高⁵⁵mn值的分布，该⁵⁵mn值由遍及整个样品的均匀分布的体素或作为聚集体存在的体素组成。最后，与⁵⁵mn含量的异质性相比，底部小图示出了相同体素的zn值更均匀。这与底部小图中主峰右侧缺少峰或拖尾相关。

转移过程中淋巴管/“导管”中的癌细胞

与上述侵袭性癌中所见的病理学形态同质性的实例相反，图35的顶部小图显示了通过h&e可见的来自48岁女性的乳腺浸润性导管癌(第iia期，t2n0m0)的形态学异质性。从ati的角度来看，样品信息丰富，样品切片包含(i)3点钟方位的正常乳腺小叶区域(用n表示)和相关的脂肪细胞，(ii)在淋巴管内且在转移过程中可见的癌细胞(表示为c)，表示为c1至c5的5个区域，和(iii)免疫细胞集中的区域(表示为免疫的)以及基质组分，包括遍布样品中间和右侧的脂肪细胞。

在正常乳房部分中的正常淋巴管的⁵⁵mn值(表示为n)，产生的cc/s值为3,204、3,104和3,155。含有癌细胞的淋巴管包含大量信息。淋巴管c1产生的值为2,904，c2和c3产生的值为2,804，c4产生的值为2,771。由此，这些转运性转移细胞的⁵⁵mn含量与构成乳腺正常管的祖细胞几乎相同。相比之下，淋巴管5中的转运细胞的cc/s中位数为8612，并预测其是放射抗性的。这个实例举例说明了在较小的单个乳房样品中出现的原子微观异质性。由于癌细胞在微观水平上看起来难以区分，因此通过转移过程中的c1到c5癌细胞的病理学不能获得微观异质性。

金属学数据揭示，相对于在h&e染色的切片中看到的细胞和无细胞区域，所有四种金属(⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁶³cu和⁵⁶fe)易于溶解在由脂肪细胞组成的区域中(图36)。通过这些细胞中的高浓度脂质稀释脂肪细胞的金属含量。

从形态学和金属化水平方面清楚看到的乳腺癌切片中的异质性问题在其它癌症类型中也是普遍的，甚至在相同器官中的不同的较大区域中也是如此。

医学专业人员在治疗癌症患者方面考虑了许多重要的问题，包括但不限于患者的年龄；病人当前的健康状况；合并症；肿瘤的位置(原发性或转移性)；是否选择手术、化学疗法、药物治疗、免疫治疗或放射治疗，以及治疗的目的是意向治愈还是姑息治疗。该列表举例说明了必须对临床决策网络进行指导以产生最佳选择。血液检查和扫描完成后的中心决定节点是肿瘤的病理。由于推断肿瘤是否可能为良性的或可能进展，因此按照来自于该节点所获得的信息做出其它决定。直到本发明之前，目前的推断不是基于量化数据，而是基于对于特定类型肿瘤的一般经验，测定有丝分裂率的情形另外。对于相对罕见的肿瘤，通常很少有临床试验提供哪种治疗步骤是最佳选择的指导。即使对于常见的肿瘤类型，如乳腺癌、前列腺癌、脑癌、皮肤癌和卵巢癌，目前众多临床试验中存在的缺陷仍然存在持续不断的争议。主要问题在于从特定肿瘤类型的关键病理决定节点处收集的数据不具有必要的量化性质量，并且直到本申请之前，不能推广到所有肿瘤类型。

关键病理信息的临床“价值”(即指示是否应该实施如放射的主要治疗选项)主要取决于染色方法的主观性解释，并与抗体信息或各种形式的原位杂交结合，通过更新的基因组和蛋白质组学技术进行了进一步补充。正如下面进一步的实例所强调的那样，原子数据提供了迄今为止在这个关键的病理学/放射治疗决定节点上缺乏的新的量化量度。任何肿瘤类型的原子治疗指标首次提供了量化性基础，其中患者是适合放射治疗的候选人，并且放射治疗后患者可能再次出现肿瘤。

实施例7

前列腺癌

图37示出了组织或器官的不同部位(在这种情况下为前列腺)的病理状态的异质性的临床实例。通过美国的最终前列腺活检报告说明了这一点(患者完全允许公开)。患者(以下称为患者x)患有psa水平为8.1ng/ml的前列腺癌。活检报告记录了前列腺不同区域的异常情况，其中12个区域中的7个区域显示变化不大，5个具有“癌症”的区域由格里森评分(gleasonscores)评为不高于7(上部小图)。还显示了十二个核心活检中每一个的累及范围的诊断总结(下部小图；第a部分至部分l)。在本发明之前，对患者进行放射治疗的评估，而没有任何量化措施证明这种治疗是有必要的。患者在与他的主治医师讨论之后，根据个人喜好对其进行放射治疗，另一种选择是对患者进行根治性前列腺切除术。根据本发明，确定每个这些区域内元素的化学分布，例如，通过激光烧蚀确定⁵⁵mn含量、二维分布和hmr(^am)。采用可利用的统计方法和统计学理论对结果进行分析，包括计算集中趋势的度量，其中集中趋势的常用度量为中位数、算术平均数和众数。也可以采用本领域已知的任何其它集中趋势度量，包括但不限于几何平均数、中位均值、缩尾k次均值、k次截尾均值和加权平均数，并且也可以在计算集中趋势之前将数据进行转换。例如，数据还采用非参数统计进行测试，包括柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验，它不涉及数据分布的假设。其它统计方法包括贝叶斯(bayesian)和更多标准统计学的组合，这种更多标准统计学清楚地记载在lee和共同作者的“demystifystatisticalsignificance-timetomoveonfromthepvaluetobayesiananalysis”(lee,jjournalofthenationalcancerinstitute,103,2-32010)和berry、carlin、lee&muller的bayesianadaptivemethodsforclinicaltrials(chapmanandhall/crcbiostatisticsseries.isbn9781439825488.2010；nuzzo,nature,506,150-152.2014)中。

其它统计方法包括以下列出的那些：talfryn等人，britishmedicaljournal,316,989-991,1998；sterne&smith，britishmedicaljournal,322,226-231,2001；bland&altman，britishmedicaljournal,328,1073,2004。在临床上，其它方法包括：rubinstein等人，journalofthenationalcancerinstitute,99,1422-1423,2007；krzywinski&altman,naturemethods,10,1041-1042,2013。

在完成统计分析后，基于不同肿瘤区域的放射敏感性或放射抗性以及最适当的治疗方案作出决定。例如，如果肿瘤被认为在群体水平和其癌细胞负荷的hmr(⁵⁵mn)(如果有的话)方面是放射敏感性的，则对肿瘤进行照射。对于对放射具有抗性，或具有较大hmr(⁵⁵mn)的患者，不推荐采用放射治疗。对于放射敏感性的特定肿瘤区域，还推荐进行选择性放射治疗。例如，推荐选择性靶向特定肿瘤区域的任何放射治疗。还考虑了在本领域中可利用的和已知的这类选择性放射处理方法。本领域技术人员能够容易地确定哪种选择性治疗是必要的。

如到此所描述的用于前述七种肿瘤类型的方法，将相同的la-icp-ms量化方法用于10种前列腺肿瘤。这些数据的概述如图38所示。

结论：无肿瘤具有高hmr(⁵⁵mn)，并且它们的体素值通常处于ati谱的低端(即，低范围的cc/s)，因此通过该样品而预期肿瘤主要是放射敏感性的。

实施例8

皮肤原发性黑素瘤转移到脑部

图39和图40揭示了详细的临床数据及其与来自70岁患者(在下文中表示为患者y)的量化原子数据的比较，该患者最先呈现为原发性黑素瘤并随后被诊断为脑肿瘤。患者接受全脑放射治疗、各种药物、免疫治疗(prembrolizumab)，最后进行立体定向开颅手术。这个实例说明了匹配原子数据所需的临床细节水平，以及将ati置于常规医疗实践所涉及的临床基线。病人已经提供了充分的披露许可。

患者y最初被诊断为患有上背部原发性黑素瘤，具有清晰的前哨淋巴结，以及大量基底细胞癌和鳞状细胞癌。数年后，按照合适的方法(followingafit)，通过mri扫描发现左侧顶叶的脑部赘生物(图39，小图a，箭头)。在放射治疗之后，mri扫描显示肿瘤部位存在残留物质，并伴有相关的模糊不清的解释(图39，小图b)。

详细的病理学报告指出来自皮肤原发性黑素瘤的切片示出了溃疡的结节性黑素瘤，其中肿瘤细胞针对黑素a(melana)是阳性的而针对34be12是阴性的，这与黑素瘤一致(图39，小图c)。布雷斯洛(breslow)厚度为3.8毫米；克拉克(clark)为4级；溃疡3毫米；真皮浸润性肿瘤宽度的百分比约为50％；真皮有丝分裂为9/mm²(认为是高有丝分裂率)；优势细胞类型、痣样的和上皮样物质；未看到血管内和淋巴管侵袭，光化/日光性弹力组织变性较轻。

从右上方广泛地切除黑色素区域，将4个前哨淋巴结切除。用s100、hmb45和黑素a处理切片以确认病变是原发性黑素瘤。

尽管主要的椭圆形展示了黑素瘤，但在较宽的切除部分不再存在明显的肿瘤。邻近表皮确实显示了反应性变化。前哨淋巴结1、2、3和4在h&e和免疫过氧化物酶染色的基础上没有发现其它恶性肿瘤的证据，而未报道淋巴结3的状况。切除后，宣布患者是“无癌症”的，6个月后没有出现黑素瘤复发的迹象。

三年后，患者因癌症而崩溃但随后恢复健康，尽管行走时出现左腿不协调的迹象。类似的不自主的腿运动每天复发达20次，最初他们的头部左侧伴随着一种奇怪的感觉。大脑mri显示了中央前回周围的正中左侧顶叶的14mm对比增强病灶(图39)。放射科医师对低程度的神经胶质瘤做出了鉴别诊断，但由于患者3年前患有黑素瘤，因此颅内病变可能反而是复发的黑素瘤。这种模糊性反映在mri的局限性上。放射科医师的结论是“这种病变的性质是不确定的。这可能代表脑部赘生物，特别是低程度的脑部赘生物，因为不存在质量效应或与病变相关的水肿。在adc(表观扩散系数)图上的低信号的扩散加权扫描的发现使得其可能是如神经节胶质瘤的低程度病变，但也考虑了没有任何囊变的dnet(dysembryoplasticneuroepithelialtumor，胚胎发育不良性神经上皮瘤)或多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphicxanthoastrocytoma)。仍然可能是较小的少突胶质细胞瘤。

有人建议当时不要进行神经外科手术，立体定向放射外科手术是适当的选择。鉴于患者被诊断为原发性黑素瘤，脑部病变可能是转移性黑素瘤。患者针对假定的转移性黑素瘤而进行放射治疗，递送的总放射剂量为25gy，并且在放射治疗2个月后开始进行pembrolizumab的免疫治疗疗程。又一个月后，mri显示中线额叶转移瘤的直径从16毫米减少到11毫米。在面值上，肿瘤具有敏感性和抗性组分。将肿瘤更好地限定为具有更薄的增强边缘和更加离散的低信号中心。大部分肿瘤大小的减少是出于放射而不是由免疫治疗药物pembrolizumab引起的，因为在这种药物治疗一个月后肿瘤消退平均只有6％(hamid等人，2013，,newenglandjournalofmedicine,369,134-144)。该患者的肿瘤直径从16mm：16mm：16mm减小到11mm：11mm：11mm。减少了(5+5+5)/(16+16+16)，即31％，其中6％可以归因于药物，25％归因于放射。这表示肿瘤初始消退的80％(25/31)是由放射引起的。在3个月后的又一次mri扫描显示了肿瘤病灶周围白质的周边对比增强呈现红色，表明自上次检查以来肿瘤发生了进展。2个月后，肿瘤的最大直径仍然是11mm。甚至随后的mri显示肿瘤周围存在明显的进展，测定的最长直径为23mm(图39，小图b)，但是不可能判断这是放射性坏死还是进行性肿瘤。患者也开始用阿瓦斯汀(avastin)进行治疗，并且决定开始开颅手术。在开颅手术之前，注意到高信号的中央坏死性肿瘤，横轴约18×33mm和上斜为33mm，符合高级肿瘤的特点。患者接受了立体定向开颅手术以清除左侧额叶病变。

切除的脑肿瘤的组织病理学揭示了2片棕褐色和棕色不规则易碎软组织，其尺寸为15mm×10mm×5mm和9mm×6mm×5mm。几乎没有分散失活的含有不清楚核的“黑素瘤”细胞，没有明确证据表明在该组织中存在残余活性恶性肿瘤。该组织针对黑素瘤标记物(黑素a和hmb45)为阴性，并且没有观察到明确的色素。在没有标记物确认的情况下，虽然病理学家倾向于黑素瘤，但是没有充分证据明确指出这是转移性黑素瘤或独立的脑部病变。

原发性肿瘤活检的原子分析

由于在放射之前没有脑部病变的活组织检查，因此唯一可用的关于肿瘤身份和放射应答性的证据源于原发性肿瘤(图39，小图c、d和e)。获得未染色的5微米标准组织切片(满足所有伦理、法律和患者同意的问题)，并且图39的小图c的整个区域被激光烧蚀，然后检查在正常基质异质性(这在大部分小图c中是可见的)之中是否存在巢状癌细胞。

图40示出了从激光烧蚀获得的数值数据，其中分析了原发性肿瘤的五个不同区域。背景扣除后的所有五个轨道的中位数⁵⁵mn值为3,747cc/s(ati)，将原发性肿瘤置于放射应答性的中间范围内。由于通过放射烧蚀肿瘤，从而临床数据与此值相符。

如上所述，还采用靶向pd-1的派姆单抗(pembrolizumab)的免疫治疗方案治疗患者，因此所有这些因素的组合都对最终结果有贡献。然而，如上所述，可以将初始肿瘤大小减少80％归因于放射治疗。

实施例9

可见肿瘤经过照射后的肿瘤状态

存在一种对ati的更精确量化方法有利的肿瘤来源，并且这些肿瘤是“外部可见的”肿瘤，其放射治疗后的状态、进展和状况可以比“内部”肿瘤更易于测定。患者z就是这种情况的实例(图41)。出于隐私的原因，这种情况只是作为对外部可见肿瘤进行放射得到的直接测定的明确结果的一个例证，并且突出了与经受内部肿瘤问题(经受患者y的脑部病变)的不明确性之间的差异。

对患者z进行放射以治疗鳞状细胞癌(图41，顶部小图)，在放射治疗后的6个月内鳞状细胞癌几乎完全消退(底部小图)。如果可以进行针对原子分析的活检，那么将临床反应与ati进行比较就会是有用的。

ati适用于所有肿瘤类型，而与提供关于患者是否患有特定肿瘤类型的信息但却不提供专门针对该患者的下一步治疗方法的其它诊断不同。ati是泛诊断性的。例如，如果在psa检测中，获得的值高于4ng/ml，则不受限于psa检测，随后的问题是：什么是治疗性干预？是根治性前列腺切除术、放射治疗(体外放射、近距离放射治疗或质子束照射)、观察等待、冷冻治疗还是雄激素阻断治疗？与ati不同，psa检测本身不提供治疗性指示。

在乳腺癌的情况下，即使对肿瘤进行大面积的完全切除，然后进行化学疗法、放射治疗、激素治疗和药物治疗(赫赛汀(herceptin)和/或阿瓦斯丁(avastin)和/或免疫检查点抑制剂和/或免疫激动剂和/或疫苗)，如果没有关于其潜在放射应答性的主要来源的信息，则肿瘤将复发的可能性是怎样的？例如，如果乳腺肿瘤活检具有亚阈值ati，那么放射治疗后肿瘤复发的可能性将低于活检ati高于阈值且肿瘤具有一个或多个hmr(⁵⁵mn)的情况(细胞可能已经发生迁移)。如果肿瘤细胞已经扩散到乳房附近的淋巴结，那么在这些淋巴结中测定的ati(高或低)将为临床医生提供是否需要更加警惕地监测患者的指示。

类似地，在黑素瘤的braf^v600e突变和许多基因组测试中，从细胞样品或从脉管系统的循环核酸推断出可靶向“驱动”突变的存在性。由于细胞样品是一组合并的实体，因而这种突变并不具有肿瘤情况的二维可视化的高价值信息。这是采用ati和合并样品之间的关键区别，在合并样品中，不可能判断出高读数是否是从较少量的癌细胞或激活基质细胞的输出物获得的，或者大多数样品细胞是否对读数有用。治疗的临床意义是非常不同的。例如，用威罗菲尼(vemurafenib)治疗的黑素瘤患者(具有少量产生变异蛋白质的肿瘤细胞)几乎不会从治疗中受益，而对于其中大量肿瘤细胞产生缺陷性蛋白质产物的黑素瘤患者，该药物将是更加有效的。除非可利用二维信息，否则难以形成该区别。

实施例10

使用放射敏化剂/增效剂进行测定

¹⁰硼

根据本发明，通过测定⁵⁵mn及其校准信号来确定肿瘤的放射应答性，并且也可以通过添加敏化剂来影响放射应答性。在这种情况下，硼中子俘获疗法(boronneutroncapturetherapy)是否成功将取决于总⁵⁵mn校准信号和敏化剂的信号。将敏化剂(如对硼苯丙氨酸)添加到锰含量高的肿瘤细胞群中可能不如将该敏化剂添加至锰含量低的细胞群中有用。在该实例中，在采用硼中子俘获疗法之前，采用la-icp-ms确定肿瘤的ati。

肿瘤样品获得自先前已经静脉注射有fda批准的敏化剂(例如，¹⁰硼衍生物，如对硼苯丙氨酸)或如先前所述的静脉注射含硼衍生物的脂质体(heber等人，proc.natl.acad,sci.usa,111,16077-16081.2014)或如先前所述的硼纳米颗粒(petersen等人，anticancerresearch,28,571-576,2008)。然后检查肿瘤样品的¹⁰硼的二维分布，以确定其含量和分布是否有利于放射。同时或单独地确定mn的分布和含量。⁵⁵mn和¹⁰b的相对量决定了适合放射治疗的患者肿瘤。

对硼中子俘获疗法(bnct)进行简要描述。已知许多外部实体使肿瘤对放射(例如，硼，¹⁰b)更加敏感。热中子被¹⁰b的核捕获，随后的裂变反应产生作为反冲的⁷锂、α粒子、弱γ射线(0.5mev伽马光子)和2.4mev的动能。将⁷li离子和α粒子归类为高线性能量转移放射并具有高度破坏性。

在小鼠的研究中，将用硼纳米颗粒预孵育的细胞皮下注射到小鼠体内，然后用中子放射物照射小鼠，由于使肿瘤生长延迟，因而导致小鼠存活时间更长(可能是因为含硼的肿瘤对中子照射更敏感)(petersen等人，anticancerresearch,28,571-576,2008)。boneca公司已经启动了头颈部肿瘤治疗的临床试验(clinicaltrials.govidentifier；nct00114790)。此外，已经经受对硼苯丙氨酸和中子放射治疗的阿根廷患者(具有黑素瘤的多次皮下转移)的i/ii期临床试验产生了近70％的应答率(menendezpappl.rad.isot.67,(增刊7-8)s50-s53).2009)。也已经将硼中子俘获疗法用于非小细胞肺癌(farias等人，phys.med.30,888-897.2014)。

2脱氧-d-葡萄糖，2-dg

其它有用的放射增敏剂包括，例如在shenoy&singh，cancerinvestigation10,533-551,1992中总结的那些放射增敏剂。这些包括2脱氧-d-葡萄糖(2-dg)，其是葡萄糖的近似类似物，但是在2位上没有羟基。

肿瘤细胞优先使用葡萄糖作为可用燃料，该肿瘤细胞大量吸收2-dg，然而在被己糖激酶磷酸化后，2-dg不再受到进一步代谢。因此，2-dg通过与葡萄糖摄取和随后步骤竞争，引起代谢应激并使细胞对放射更敏感。在暴露于电离辐射并同时用2-dg处理的细胞系中，一些细胞的放射损伤增加，并且观察到细胞系之间常见的异质性(dawrkanath等人，int.jradiat.oncol.biol.phys.50,1051-1061,2001)。据认为，通过硫醇代谢的紊乱而使一些肿瘤细胞群出现放射敏感性(lin等人，cancerresearch,63,3413-3417,2003)。

在患有晚期脑肿瘤的患者的i/ii期早期的临床试验中，发现采用将2-dg与放射治疗(每次较大剂量，5gy)结合(2-dg加上rt)的方法产生的毒性和可行性是良好耐受的(mohanti,b,int.j.radiat.oncol,biol.phys,35,103-11,1996)。

以增加剂量的口服2-dg和放射治疗多形性成胶质细胞瘤患者，显示了患者对高达250毫克/千克体重的剂量良好耐受，正常脑部无显著病变。此外，该队列的60名患者中的一些患者显示了存活期中位数超过仅接受放射治疗的患者(singh等人，strahentherapieundonkologie,8,507-514,2005)。患者治疗和结果的总结记载在dwarakanath,j.cancerresearchandtherapeutics,5,21-26,2009中。

最后，在患有异型胰腺肿瘤的裸鼠中，与对照相比，用2-dg加上放射进行治疗使得肿瘤生长受到抑制且存活期延长(coleman等人，freeradicalbiologyandmedicine,44,322-331,2008)。

因此，在放射之前检测肿瘤的⁵⁵mn(和任何其它相关的金属学数据)是本发明技术对放射增敏剂(而不仅仅是2-dg)的另一实际应用。

免疫疗法

放射和随后的抗肿瘤免疫应答与癌细胞表面上的抗原呈递增加和大量蛋白质和肽(以及与蛋白质和肽结合的金属)的释放形成了相互作用系统，这类蛋白质和肽的释放影响抗原呈递细胞的反应。因此，已被照射的原发性肿瘤(或未经照射的同一个体内的远处转移性生长)可以变得对各种免疫细胞的攻击敏感。这种敏感性增强的机制基础正在受到积极地讨论，但仍未得到统一的结论(sharabi等人,2015,oncology[willistonpark]2015,29(5),pii:211304；formenti,jnatlcancerinst.105,256-265,2013)。对放射具有较强抗性的黑素瘤具有高水平的黑色素(黑色素存储大量金属)。在本发明的上下文中，还提出了免疫疗法的功效。不受任何特定理论的束缚，放射抗性癌细胞与放射敏感性癌细胞的广泛且差异较大的代谢特性将不可能在免疫系统中受到同样的处理，不管是在放射治疗之前还是之后。因此，放射联合免疫治疗(放射在免疫治疗之前，或免疫疗法在放射之前)，将由于差异选择而在肿瘤内产生差异较大的细胞群。在这个实例中，根据本文中的任何方面、实施方式或实施例的方法，首先通过肿瘤的ati将其进行表征，然后应用有用的免疫疗法。通过实施根据本文中的任何方面、实施方式或实施例的本发明的方法，预期了免疫疗法的功效和/或何时施用放射治疗(例如，在免疫疗法之前、期间或之后)。不同类型的免疫疗法被认为与相同类型的放射产生不同的相互作用。例如，用于去势抗性前列腺癌的sipuleucel-t(树突细胞疫苗，设计成诱导针对前列腺酸性磷酸酶的免疫)、用于不可切除的转移性黑素瘤的易普利单抗(ipilimumab)(抗-ctla4)、用于黑素瘤的派姆单抗和纳武单抗(nivolumab)(抗-pd-1)、用于黑素瘤和晚期鳞状非小细胞肺癌的纳武单抗以及替西木单抗(tremelimumab)和利丽单抗(lirilumab)，与涉及嵌合抗原受体t细胞(基于car-t的免疫疗法)的免疫疗法相比，可能对放射产生不同的反应。检查点封锁免疫治疗(checkpointblockadeimmunotherapy)结合立体定向放射治疗正在用于对成胶质细胞瘤进行治疗，而将成胶质细胞瘤作为单一实体进行治疗。因此，根据本文中的任何方面、实施方式或实施例的方法对任何成胶质细胞瘤进行表征，并且为对免疫疗法作出最佳反应的患者提供评价。

孟加拉玫瑰红和黑素瘤

孟加拉玫瑰红(4,5,6,7-四氯-2',4',5',7'-四碘-荧光素)是1882年获得专利的工业化学品，其使纱线和食物变成红色。在将该孟加拉玫瑰红病灶内地应用于皮肤黑素瘤时，可能有一些肿瘤显著萎缩(thompson等人，melanomaresearch,18,405-411,2008；thompson等人，ann.surg.oncol.22,2135-2142,2015)。在用孟加拉玫瑰红病灶内治疗后的经过治疗的皮肤病变的体积减小，同时在同一患者体内的一些远端未治疗的肿瘤也萎缩，表明可能涉及免疫应答。如同时接受两种治疗方式(rb加上rt)的3名患者所示，将孟加拉玫瑰红(rb)治疗与放射治疗(rt)结合可以进一步增强肿瘤烧蚀(foote等人，melanomaresearch,2010,20,48-51,2010)。然而需注意，这些患者的放射治疗并不是基于多种肿瘤的放射敏感性或放射抗性的任何先验知识，因为在本申请之前无法确定放射应答性。事实上，有人指出，“关于黑素瘤的最佳剂量和给予次数还没有达成共识”(foote等人，melanomaresearch,20,48-51,2010)。

孟加拉玫瑰红可被认为是具有多种作用模式的试剂：细胞对放射的敏化剂、通过增强免疫系统的敏化剂、“添加剂细胞杀死”试剂或增效剂。由于这些相互作用的分子机制是未知的，并且已经摄取rb的癌细胞和基质细胞的空间布置仍然是未知的，因而不可能区分这些试剂。因此，临床医生面临治疗黑素瘤患者的困难任务，特别是具有局部转移区域的患者，如局部复发、卫星灶复发和途中复发。目前的治疗方法主要包括手术切除、局部烧蚀、病灶内化学疗法和靶向药物(如威罗菲尼)。所有这些治疗方法都是具有挑战性的，“由于疾病异质性以及病变的频繁且持续增殖”(thompson等人，2015,ann.surg.oncol.22,2135-2142,2015)。

本申请与孟加拉玫瑰红和治疗性治疗选择的相关性在于孟加拉玫瑰红分子含有4个碘原子，通过la-icp-ms在组织切片中易于测定出该4个碘原子。因此，在放射治疗之前和之后，可以针对碘、⁵⁵mn或任何其它原子，同时分析每个体素中的已经由孟加拉玫瑰红进行了病灶内注射的任何肿瘤的切片，以确定哪些细胞群对放射敏感。以这种方式，可以更精确地靶向敏感性病变。目前还没有数据可以确定rb之后是放射治疗产生的相对临床效果，或者放射之后是rb产生的相对临床效果。明确的是，可以通过本申请的方法来分析能够进行病灶内注射rb的任何肿瘤，以提供关于放射治疗选择的量化数据。

作为非限制性实例，通过多核针方法将rb注射到前列腺中，以及同时对来自组织切片的碘和⁵⁵mn进行激光烧蚀分析将提供关于哪些是正常细胞类型、哪些是癌细胞群和哪些是基质群体的信息，优选地保留rb。这些空间分布将加强放射治疗方面的决策。

类似地，将rb病灶内沉积到乳腺肿瘤区域内将允许同时对来自组织切片的碘和⁵⁵mn进行激光烧蚀分析，并且提供关于哪些是正常细胞类型、哪些是癌细胞群和哪些是基质群体的信息，优选地保留rb(如本申请的图35和36中针对⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu所述的)。这些空间分布将加强放射治疗方面的决策。

实施例11

原子治疗指标的临床实施

来自八种不同肿瘤类型的数据分析揭示了将ati的技术和临床方面置于透视图中的许多发现。在意料之中的是，黑素瘤与所有其它上皮肿瘤不同，因为没有其它肿瘤类型合成黑色素(除非是在不相关细胞类型中最终产生黑色素的所有途径的偶然激活，或者是免疫细胞和黑素瘤细胞之间细胞融合的结果)。另外，黑素瘤来源于神经嵴细胞的初始胚胎衍生物，该神经嵴细胞是迁移和建立不同胚胎结构的迁移细胞。除了生殖细胞的初始迁徙性质之外，神经嵴细胞是仅有的长距离迁移的其它瞬时细胞类型。如本文所述的，对于各种黑色素肿瘤，黑色素与高浓度的⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu共定位。在它们之中，⁵⁵mn是最有可能提供放射保护的，这是通过在⁵⁵mn与各种化学实体结合时，其结合o2^●-、h2o2和较危险的羟基自由基oh^●的能力进行的(图2)。此外，贯穿整个肿瘤的较高浓度的黑色素可以提供一定程度的对放射的物理屏蔽，而该黑色素是任何其它肿瘤类型没有的。唯一的可以合理地被所有其它类型肿瘤取代的黑素瘤是通过导致产生的黑色素是完全无黑色素的失活步骤得到的那些黑素瘤。在这方面显著的是，已经在本文中经过检测的，并通过视觉显微镜检测(不是量化性的)发现确实具有低浓度的黑色素颗粒的黑素瘤具有较低的⁵⁵mncc/s值(体素值的中位数为1,939cc/s、1,239cc/s、817cc/s、1,439cc/s、1,278cc/s、939cc/s、1,617cc/s和1,678cc/s)。这些都低于图11所示的2kati阈值。如果随后量化性地证实了这一发现，那么在不存在hmr下的无色素病症可以表示较低的⁵⁵mnati和放射敏感性。

在临床背景下，将ati应用于肿瘤活检的一种操作方式是图42和43中所示的流程图。在图42中，通过手术切除术将易于接近的黑素瘤切除，如通过患者y举例说明的。通过bowley非参数偏差统计(npss)分析体素含量将提供同质性或异质性的首要指示(bowley,1901,elementsofstatistics,psking和son,出版商,威斯敏斯特,伦敦,英国)。其次，同质性的条件是：(i)⁵⁵mn、⁶⁶zn、⁵⁶fe和⁶³cu的npss值都很低，(ii)样品的癌细胞或基质间都没有hmr(⁵⁵mn)，和(iii)没有明显的黑化。如果发现样品是同质性的，那么其ati将高于或低于临床意义上选定的阈值。由于已将原发性肿瘤切除，那么关于同质性和高于或低于阈值的这些数据将提供关于已经发生转移的任何细胞的可能特征的信息，如患者y的颅内转移。对来自已经去除原发性黑素瘤的患者的切除淋巴结的分析，将按照上述相同的方式进行。如果原发性肿瘤的转移性衍生物在晚些时期出现，那么ati将为是否启动放射治疗提供指导。如果来自转移部位的活检是可利用的，则图42的流程图重新开始。

图42的右侧小图示出了重新对在体素特征方面为异质性的样品进行活检和将肿瘤切除时的情形。异质性由大量促进因素产生：(i)主要样品内的异质性，(ii)癌细胞和基质间的hmr(⁵⁵mn)的存在性、大小和含量，以及(iii)黑色素颗粒的有无和细胞内黑色素浓度大小。所有hmr(⁵⁵mn)的评估将指示远距离处肿瘤复发的可能性(如果在原发性肿瘤切除之前，任何细胞已经较早地发生转移)。

图42的流程图还适用于从不适于通过手术切除的部位取得的任何活检，并且适用于需要通过确定ati来做出决定的情况(如果对于意向通过放射进行治疗，放射是有用的选择方式)。

对于除了黑素瘤以外的所有其它肿瘤类型，图43的流程图将产生关于是采用放射治疗还是将其备用的临床决策点。活检将表明同质性或异质性(异质性在临床意义上是不可避免的灰色区域)。可以切除或不切除肿瘤，但是如果在不存在hmr(⁵⁵mn)下得到的ati低于阈值，那么将使用放射物。如果肿瘤是异质性和可切除的，那么ati将成为远距离转移是否在患者生命的晚些时期出现的预期指标。如果肿瘤是不可切除的，则根据阈值做出是否进行照射的决定。

本领域技术人员将会理解，主治医师和患者都会考虑许多与ati无关的其它因素。这些因素将包括但不限于患者的年龄、患者当前的健康状况、合并症、肿瘤的位置(原发性或转移性)以及使患者对放射敏感的任何遗传性状况。在脑部病变的情况下，一些肿瘤将会比其它肿瘤更具有放射抗性，因为癌细胞采用通过微管相互连接的新机制，使受损的癌细胞被肿瘤内的其它癌细胞修复(osswald等人，nature,528,93-98,2015)。

实施例12

原子治疗指标与其它实体结合的临床实施

本申请的关键基础在于施加在整个组织切片上的高辐照度激光能量的聚焦脉冲以及通过质谱得到的汽化材料的分析结果提供了二维空间原子图，其在通过ati放射治疗癌症患者方面具有直接的治疗重要性。该ati/h&e图是其它不同图谱可以叠加在其上的基础。本领域技术人员将认识到，对提供多层/叠加信息的生物实体的明智选择将进一步增加ati的临床影响，这是在本申请之前不可获得的情形。我们在下面展示了将使用元素分析法利用金属标记的抗体得到的其它图谱整合在一起如何可以增强临床决策的能力，该元素分析法即为激光烧蚀-电感耦合等离子体-质谱(la-icp-ms)、或激光烧蚀-飞行时间质谱(la-tof-ms)、或电感耦合等离子体-发射光谱(icp-oes)、或微波等离子体-原子发射光谱(mp-aes)、或激光诱导击穿光谱(libs)、或二次离子质谱(sims)、或x-射线吸收近边结构(xanes)、原子吸收光谱(aa)或x-射线荧光(xrf)。

其它图谱

可以采用排列的逆转录寡核苷酸(dt)引物和荧光标记的核苷酸，通过“空间转录组学”测定组织切片中的基因表达(stahl等人，science,353,78-82,2016)。这提供了相对于组织切片的h&e图的基因表达的空间图，但是是通过付出大量劳力获得的，涉及文库构建、扩增步骤、荧光随时间的强度损失、染色伪影和自发荧光、以及临床意义未知的实体大数据集的解卷积。据我们所知，先前的组织切片的空间基因表达图谱从未在放射是否是患者的优选治疗选择的临床问题上进行过报道。

直到本申请之前，临床上有用的二维图谱仍是不可获得的，该二维图谱是通过同时测定ati以及在蛋白质或细胞水平上的特定选择的生物学参数所产生的。这些参数需要是推定为参与放射治疗的，并且需要是采用当前的病理和分子技术能够立即实施的。下面提供了这类图谱的一些实例。

许多肿瘤声称为含有“癌症干细胞”(csc)(clevers,naturemedicine,17,313-319,2011)，该癌症干细胞实质上是对放射具有抗性的(ogawa等人，2013,anticancerresearch,33,747-754)。csc的这种放射抗性被认为是由于许多因素引起的，包括其突出的dna修复能力和对活性氧类(reactiveoxygenspecies)的高度防御。这种csc被认为是自我更新的，分裂缓慢，且能够重建肿瘤。如果情况确实如此的话，则在ati/h&e图谱上构建和叠加“癌症干细胞特性”图谱在临床上是有利的。这可以使用金属标记的抗体来进行。

目前关于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片的技术通常采用针对感兴趣抗原的抗体，但是采用目前的免疫组织化学将多个蛋白质肿瘤标记物(例如4个或5个蛋白质肿瘤标记物)共同定位在相同的组织切片上是几乎不可能的。在利用抗原特异性的第一抗体后，随后进行的是涉及酶标记的第二抗体的扩增步骤。染色5个按顺序的组织切片(在不同时间和不同染色条件下进行的)的时间因素，既对快速准确的生产没有好处，也不利于解释现象。然而，利用金属(尤其是镧系元素及其易于被区分的同位素)进行抗体标记的应用表示可以将不同抗体(各自标记有不同的同位素)应用于同一组织切片，然后通过la-icp-ms进行直接检测(giesen等人，2011,anal.chem.83,8177-8183)。在此，共定位的染色程序、荧光问题或量化是明确的。该方法已经用于在诊断背景下采用镧系元素-钬、铥和铽来标记第一抗体、抗-her2、抗-ck-7和抗-muc1以及通过la-icp-ms检查它们随后在乳腺癌组织切片中的位置(giesen等人，2011,anal.chem.83,8177-8183)。该方法也被应用于利用镱-173直接标记抗-酪氨酸羟化酶(th)(paul等人，2015,chemicalscience,doi:10.1039/c5sc02231b,2015)。

以上数据表明，通过元素分析法对多个镧系元素标记的抗体进行分析可以报告在同一组织切片中抗原的空间分布，并提供用于基于药物的患者治疗的临床信息。然而，在放射治疗信息的情况下，要求是不同的。需要在同一组织切片或相继的连续切片中测定ati和具有放射治疗意义的实体(例如，在图35所示的乳腺癌切片中，淋巴管内存在癌细胞，并且那些转移性细胞具有不同的⁵⁵mn含量)。该目的可以通过以下来实现。

已知15种镧系元素(镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥)以及钪和钇具有通过la-icp-ms易于区分的多种同位素。然而，不仅仅是17种元素，还存在约32种标签的最小组合(palette)，从中选择精选的标签抗体。在本申请的上下文中，接下来是选择那些作为“干细胞特性”、dna修复、ros、细胞分裂以及甲基化酶和去甲基化酶(涉及癌症细胞中肿瘤抑制因子的沉默)的标记物的抗原，所有这些抗原都会影响放射治疗的相关性。

在非限制性的情况下，第一步包括：

(i)选择涉及“干细胞特性”网络(与肿瘤侵袭性/转移潜能相关)的蛋白质，如由clevers所述的cd44(乳腺、肝脏和胰腺)、cd133(脑、结肠直肠、肺、肝脏)、epcam(结肠直肠和胰腺)(naturemedicine,17,313-319,2011)，以及靶向癌症干细胞的药物靶向的蛋白质，如notch、dll4、fak、stat3和nanog(kaiser,science,347,226-229,2015)。

(ii)选择参与dna修复的蛋白质，如brca1、brca2和atm，如wood等人综述的(2001,science291,1284-1289，以及随后的更新)。

(iii)选择在肿瘤小生境中具有主要作用的参与活性氧类代谢网络的蛋白质，如缺氧诱导因子-hif(simon和keith，naturereviewsmolecularcellbiology,9,285-296,2008)；碳酸酐酶ix和过氧化氢酶。

(iv)选择参与细胞分裂网络的蛋白质，如ki-67(inwald等人，breastcancerrestreat.139,539-552,2013)。

(v)选择沉默或激活基因组区域并影响肿瘤内细胞的致癌潜力的蛋白质，如dna脱甲基酶tet1和tet3(forloni等人,cellreports,16,1-15,2016)和dna甲基化酶(如dnmt1、dnmt3a和dnmt3b)。

第二步包括利用针对这些蛋白质产物的第一抗体，然后用合适的镧系元素标记第一抗体或第二抗体，随后将这些抗体与组织切片杂交。

第三步包括将元素分析法应用于这种富含抗体的切片。这包括对已经在本申请中使用的内源性金属(mn、zn、fe和cu)同时读数以产生ati并定位hmr，以及对各种镧系元素进行空间读数以突出ati/h&e图谱中的与镧系元素相连的相关蛋白质的位置。这是临床意义上的快速多路复用制图。在应用于如图35所示的组织切片时，可以更全面地了解乳腺淋巴管和毛细血管(和任何其它肿瘤)中的细胞群的特征、原发性和继发性肿瘤内的异质性，并且在前列腺穿刺活检的情况下，这种扩展性眼光远远高于当前的病理学见解。

将多层信息叠加到ati/h&e图谱上的这种逻辑延伸提供了先前未有的新的病理学分类法，该方法从同一或按顺序的组织切片快速产生量化性临床相关信息，可以在放射治疗的情况下评估该信息。

本发明的优点

与将肿瘤均质化并测定每单位质量组织的锰含量的非制图法替代方法相比，本发明的二维制图法特性具有大量与可以进行的临床放射治疗性处理相关的重要属性。

·首先，所有肿瘤的基质物质的含量和类型是异质性的，因此肿瘤细胞与基质物质的相对含量(仅在参考二维图谱时是可见和可测定的)将影响ati的中位数。

·其次，即使二维区域几乎全部由癌细胞组成，它们的mn含量也可能会差异很大。图1很好地说明了这一点，其中三分之一左右的切片由中位cc/s值为约3,000的无黑色素肿瘤细胞组成，而切片的其余部分由mn含量在15,000cc/s至45,000cc/s之间并因此hmr(⁵⁵mn)在45,000cc/s至150,000cc/s之间变化的区域组成。如果将该切片均质化，那么中位ati将远远大于10,000cc/s。对这种从临床意义上本应该被排除的情况的患者进行放射治疗可能会杀死ati较低的那三分之一肿瘤，并由此可以降低肿瘤负担，为患者而带来临床益处。

·更重要的是，将切片或肿瘤样品均质化使得本发明的一个重要方面，即可预测肿瘤复发的hmr(⁵⁵mn)失去意义。大多数hmr占切片的不到10％，因此均质化使得ati中位数几乎不发生变化，而将使得hmr(⁵⁵mn)存在的信息丢失。

在有关乳腺癌的实例图35中，存在正常乳腺导管、免疫细胞区域、脂肪细胞和基质细胞的混合物，其中最危险的临床相关细胞是仅存在于一个淋巴管c5中的细胞。这些细胞正在发生转移，并且其中位数为8,612cc/s。如果将整个切片均质化，则经过均质化的切片的中位数会为约1,669cc/s(受脂肪细胞群、基质和正常管状物(其值相对较低)的影响而使得中位数值偏低)，从而使得这种临床相关信息将完全丢失。