一种鉴别染色体平衡易位携带胚胎和正常胚胎的方法与流程

本发明属于基因诊断和人类辅助生殖领域，具体而言，涉及胚胎植入前诊断技术(PGD)，是一种能够鉴别胚胎是否携带亲本平衡易位染色体遗传信息的单体型连锁分析方法。
背景技术：
：染色体平衡易位是一种常见的染色体结构变异，是由于不同染色体的断裂部分发生错误拼接而造成的染色体异常。正常人群中大概有0.19％的发生率，在反复流产或者反复IVF种植失败的患者中发生的概率约为5％。尽管平衡易位携带者一般情况无异常表型，但是其原始生殖细胞减数分裂产生的配子中有高达19％-77％为不平衡型的配子，这与染色体易位的断裂点和发生易位的具体染色体有关。染色体的四价体结构，通常发生在细胞减数分裂I期，由易位的两条染色体和与其对应的两条正常的同源染色体配对产生。这种四价结构通常的形式有2:2，3:1或者4:0三种分离模式。只有在2:2的模式下，对位分离模式能产生正常或者平衡的配子，其他的分离模式均产生非平衡类型的配子。非平衡的配子会导致不孕，反复流产，或者生育智力障碍或其他先天异常的后代。PGD即“胚胎移植入诊断技术”最早由HandysideAH首先成功应用于临床，最初的PGD技术使用PCR或FISH方法检测性别，帮助有风险生育血友病A、进行性肌营养不良等X连锁遗传病后代的夫妇妊娠分娩出正常女婴；2006年来，有研究者通过选择与致病基因在染色体的位置上紧密连锁的STR标记位点来诊断胚胎是否遗传了致病基因，进行单基因疾病的胚胎植入前诊断，该方法又被称为植入前遗传学单倍型分析(preimplantationgenetichaplotyping，PGH)。PGD技术由于可以在染色体平衡易位的患者中筛查出没有染色体大片段异常的健康胚胎，提高临床妊娠率，在辅助生殖领域得到广泛的应用。对于具有已知的染色体平衡易位的夫妇，基于荧光原位杂交(FISH)的PGD最早用来筛选出不平衡的胚胎，但是由于FISH技术在细胞固定和信号读取方面的技术限制，会影响结果解读的精确性。近年来，基因芯片技术和测序技术由于其能对23对染色体全面进行筛查的优点被广泛应用于各个生殖中心，提高了临床妊娠率。但是尽管如此，这些传统的PGD技术只能对胚胎的拷贝数变异进行检测。到目前，已有一些关于鉴别染色体平衡易位携带胚胎和完全正常胚胎的文章报道。最初，研究者针对染色体易位断裂点设计特跨断裂点的特异性FISH探针，可用于区别染色体正常和平衡易位的胚胎，虽然该方法有一定的可行性，但方法设计复杂、耗时很难在临床工作中得到应用。近期，Treff等人的研究则采用了基于SNP芯片技术，以易位携带者夫妇双方和不平衡胚胎为参照，通过构建断裂点5Mb之内的单体型进行鉴别，可以鉴定染色体相互易位的携带者胚胎的染色体状况。另有研究小组发明了一种MicroSeq-PGD的技术，通过结合染色体易位断裂点显微切割技术和NGS，检测出易位断裂点附近的DNA的序列，从而区别正常的胚胎和平衡易位的胚胎。但是，上述方法都存在下述缺陷：1)方法技术流程都非常复杂，耗时较长；2)无法判断断裂点区域的同源重组情况；3)不适用于罗伯逊易位的携带者。可见，现有技术中仍然缺乏能够准确、快速应用于临床的鉴别染色体平衡易位(相互易位和罗伯逊易位)胚胎的辅助生殖技术。技术实现要素：针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明建立了一种基于全基因组大规模SNP基因分型结果进行胚胎植入前单体型分析(PGH)的方法。根据本发明所述方法，针对染色体平衡易位(包括相互易位和罗伯逊易位)的患者及其配偶、体外授精后的胚胎和易位携带者亲属的染色体进行家系单体型连锁分析，能快速、简便、准确地区分出染色体平衡易位的胚胎和染色体正常的胚胎，并同时对胚胎的染色体拷贝数变异进行筛查，提高临床妊娠率，能够在体外受精的胚胎植入前及时区分携带平衡易位染色体的胚胎和正常染色体的胚胎，从而优先移植染色体完全正常的胚胎，及时阻断染色体平衡易位遗传给下一代。一定程度上推动了人类辅助生殖技术的发展进步。本发明的具体技术方案如下：本发明提供了一种用于鉴别染色体平衡易位携带胚胎和染色体完全正常胚胎的家系单体型构建方法，包含以下步骤：1)样本基因分型：将染色体平衡易位携带者夫妇双方、至少一名携带者亲属和染色体平衡易位携带者夫妇体外受精胚胎进行大规模SNP基因型检测；携带者亲属可为与携带者具有相同平衡易位的亲属，也可为染色体正常的亲属；2)确定信息SNPs位点：信息SNPs的选择标准为：在染色体平衡易位携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点；选择覆盖染色体易位断裂点、易位染色体和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs，染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP；在覆盖断裂点区域，信息SNPs从断裂点上下游1‐5Mb范围内选择；3)构建家系单体型：集合步骤2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖两处断裂区域、易位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型。本发明提供了一种鉴别染色体平衡易位携带胚胎和染色体完全正常胚胎的PGH方法，包含以下步骤：1)样本基因分型将染色体平衡易位携带者夫妇双方、至少一名携带者亲属和携带者夫妇体外受精胚胎进行大规模SNP基因型检测；携带者亲属可为与携带者具有相同平衡易位的亲属，也可为染色体正常的亲属；将染色体平衡易位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本，携带者夫妇体外受精胚胎称为待定样本；2)确定信息SNPs位点信息SNPs的选择标准为：在染色体平衡易位携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点；选择覆盖染色体易位断裂点、易位染色体和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs，染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP；在覆盖染色体易位断裂点区域，信息SNPs从染色体易位断裂点上下游1‐5Mb范围内选择；3)构建家系单体型集合步骤2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖两处断裂区域、易位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型；4)数据收集和分析将待定样本中染色体易位断裂点区域的单体型信息和参照样本的染色体单体型信息进行比对，通过整条染色体的单体型判断染色体易位断裂点区域是否发生了同源重组：i)当以与携带者具有相同平衡易位的亲属为参照时：a.若待定样本染色体易位断裂点区域没有发生重组，当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体平衡易位携带者以及与携带者具有相同平衡易位的亲属的单体型信息一致时，则为平衡易位携带胚胎；当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体平衡易位携带者单体型信息一致，但与携带者具有相同平衡易位的亲属的单体型信息不一致时，则为染色体完全正常的胚胎；b.若待定样本染色体易位断裂点区域发生了同源重组，则平衡易位携带或染色体完全正常胚胎的判断标准与a相反；ii)当以染色体正常的亲属为参照时：a.若待定样本染色体易位断裂点区域没有发生重组，当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体平衡易位携带者以及与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时，则为染色体完全正常的胚胎；当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体平衡易位携带者单体型信息一致，但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时，则为平衡易位携带胚胎；b.若待定样本染色体易位断裂点区域发生了同源重组，则平衡易位携带或染色体完全正常胚胎的判断标准与a相反。本发明所述大规模SNP基因型检测覆盖23对染色体；大规模SNP基因型检测方法优选基因芯片和基因测序。本发明选择胚胎发育至第3‐7天时，活检获取1‐10个细胞作为步骤1)中所述体外受精胚胎的检测样本；优选来源于胚胎卵裂球活检或囊胚滋养外胚层活检的细胞。本发明信息SNPs位点在覆盖染色体易位断裂点区域时，所述信息SNPs从断裂点上下游2‐4Mb范围内选择，优选从断裂点上下游2Mb范围内选择。本发明构建家系单体型时，每条染色体每Mb范围内至少选择2、3、4、5、6、7、8、9或10个信息SNPs。本发明将活检获取的细胞裂解，进行全基因组扩增；全基因组扩增方法可选自MDA方法、MALBAC方法、或其他全基因组扩增方法。本发明染色体平衡易位携带者夫妇双方与携带者亲属的检测样本的来源为体细胞，优选外周血。本发明提供了一种用于鉴别染色体平衡易位携带胚胎的系统，所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件，其特征在于，1)所述系统还包含储存有染色体平衡易位携带者夫妇双方、至少一名携带者亲属和染色体平衡易位携带者夫妇体外受精胚胎进行大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件；携带者亲属可为与携带者具有相同平衡易位的亲属，也可为染色体正常的亲属；将染色体平衡易位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本，携带者夫妇体外受精胚胎称为待定样本；2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点：信息SNPs的选择标准为：在染色体平衡易位携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点；选择覆盖染色体易位断裂点、易位染色体和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs，染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP；在覆盖断裂点区域，信息SNPs从断裂点上下游1‐5Mb范围内选择；3)所述软件依照下述原则构建家系单体型：每条染色体上依照上述标准选取的信息SNPs位点，通过家系连锁分析得到覆盖两处断裂区域、易位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型；4)所述软件将待定样本中染色体易位断裂点区域的单体型信息和参照样本的染色体单体型信息进行比对，通过整条染色体的单体型判断染色体易位断裂点区域是否发生了同源重组：i)当以与携带者具有相同平衡易位的亲属为参照时：a.若待定样本染色体易位断裂点区域没有发生重组，当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体平衡易位携带者以及与携带者具有相同平衡易位的亲属的单体型信息一致时，则为平衡易位携带胚胎；当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体平衡易位携带者单体型信息一致，但与携带相同平衡易位的携带者亲属的单体型信息不一致时，则为染色体完全正常的胚胎；b.若待定样本染色体易位断裂点区域发生了同源重组，则平衡易位携带或染色体完全正常胚胎的判断标准与a相反；ii)当以染色体正常的亲属为参照时：a.若待定样本染色体易位断裂点区域没有发生重组，当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体平衡易位携带者以及与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时，则为染色体完全正常的胚胎；当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体平衡易位携带者单体型信息一致，但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时，则为平衡易位携带胚胎；b.若待定样本染色体易位断裂点区域发生了同源重组，则平衡易位携带或染色体完全正常胚胎的判断标准与a相反。本发明所述鉴别染色体平衡易位携带胚胎和染色体完全正常胚胎的PGH方法具有如下优势：1)可以对胚胎中染色体状态进行预测的同时，对23对染色体的进行筛查；2)除了断裂点区域的单体型，可以同时建立涉及易位的整条染色体和对应的正常同源染色体的整条染色体的单体型，这可以显示病人的两条同源染色体在断裂点区域的重组情况，PGH的预测可以包含断点区域到整个染色体；3)适用于所有遗传性的染色体平衡易位家系(包括相互易位和罗伯逊易位)；4)方法相对简单，需时较短，整个鉴别过程可以在48h内完成，适用于常规临床工作。附图说明图1.携带染色体平衡易位的家系图谱示意图2.3号家系外周血核型图图3.3号家系单体型图具体实施方式实施例1：患者及患者亲代的参照样本收集募集了9个将接受辅助生殖的染色体平衡易位携带家庭，入选者均来自上海集爱遗传与辅助生殖研究所。每个家庭都需要签署书面知情同意书，研究方案由复旦大学妇产科医院人类受试者伦理委员会批准。从2014年6月到2016年3月，所有9个家庭都有复发性自然流产史或者染色体异常的历史，染色体平衡易位携带的夫妇一方在后文中简称为“患者”，另一方简称“患者配偶”，携带染色体平衡易位的家系图谱示意请见图1。在募集的同时抽取每对患者夫妇和患者亲属(患者父母优先考虑，也可为其他亲属)的外周血10ml。一部分外周血用于淋巴细胞培养，进行染色体核型分析；另一部分外周血按照本领域常规方式提取DNA，已备后续SNPs分型使用。外周血染色体制备方法如下：1、细胞培养1).采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血，将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30-40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。2).培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。3).秋水仙素处理：终止培养前2-4小时，在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml)。以上步骤均需无菌操作2、染色体制备1).收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8-10分钟，弃上清液。2).低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟。3).预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。4).一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。5).二固定、三固定：同一固定。6).制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。7).滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。8).染色：1:10Giemsa染色5-10分钟，细水洗去多余染液，气干。9).镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。如果患者的外周血细胞核型与其母亲相同，则患者的平衡易位遗传自母方；与父亲相同，则患者的平衡易位遗传自父亲。当患者父母无法取血(如去逝)或不同意取血时，患者的兄弟姐妹或其他亲属也可取外周血做核型分析，也可以作为构建家系单体型时的参照样本。1-9号家系的易位染色体核型请见表1。图2展示了3号家系的外周血核型图。表1.1-9号家系易位染色体核型表家系编号染色体数目携带者易位染色体核型146XYt(5；22)(q33；q12)mat246XXt(16；18)(q22；q21.1)pat346XXt(12；22)(p12；q13)pat446XXt(11；16)(p11.2；p12.3)pat546XYt(1；19)(q12；p13)mat645XXrob(14；21)(q10；q10)mat745XYrob(14；21)(q10；q10)pat845XXrob(14；15)(q10；q10)pat946XYt(6；9)(q27；q22)mat/pat实施例2：囊胚活检和全基因组扩增(WGA)1、体外受精对募集的9个家庭进行体外受精(IVF)，体外受精方法遵循本领域常规方法进行；这些家庭的母本/父本年龄、表型，排卵结果、受精卵数量和最终用于活检的囊胚数量列于表2。通过上述体外受精，9个家庭共获得44个囊胚进行后续的活检和单体型分析研究。表2.1-9号家系基本情况和体外受精情况2、囊胚活检及全基因组扩增取上述处于囊胚阶段的胚胎，在胚胎发育的第5或6天从滋养外胚层中移出3至10个细胞。将活检细胞置于装有碱性变性缓冲液(KOH)的PCR管中进行细胞裂解。再通过多重置换扩增(MDA)方法进行全基因组扩增(WGA)。依照试剂盒说明书中所述方法，用phi29DNA聚合酶进行等温DNA扩增(Repli-g单细胞全基因组扩增试剂盒，QIAGENGmbH，Hilden，Germany)，具体操作流程如下：1)预处理：BufferDLB重悬BufferDLB加入500μlH2Osc混匀离心保存于–20℃，6个月；2)bufferD2配制DTT，1M3μlBufferDLB(reconstituted)33μlTotalvolume36μlBufferD2冻存于–20℃不超过3个月；3)取4μl活检细胞裂解样品与3μlbufferD2混匀，65℃反应10min；4)在步骤3)反应液中加入3μl终止液终止反应；5)Mastermix配制6)在步骤4)获得的每个反应中加入40μlMastermix，总反应体系共50μl；7)将步骤6)所述反应体系置于30℃反应8h，65℃、3min终止反应；8)反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，于-20℃保存。实施例3：SNP基因型分型和单体型(haplotypes)分析1、SNP基因型检测使用IlluminahumanKaryomap-12V1.0微阵列进行SNP基因型检测。每个Karyomap-12芯片包含近300,000个SNPs，可全面覆盖人23对染色体。将实施例2中进行囊胚活检和全基因组扩增获得的44个样本按照家系分组，分别与该家系患者夫妇、患者亲属的全基因组扩增样本3份编为一组，进行微阵列SNP基因型检测和分析，分组情况如表3所示。具体实验方法参照说明书进行，在此不再赘述。表3.1-9号家系SNP阵列实验分组注：F代表女性，M代表男性2、单体型分析获得芯片检测的全部SNPs信息后，构建胚胎分子核型和家系单体型，分别用于鉴定胚胎染色体拷贝数状况和鉴别胚胎染色体平衡易位携带状态。具体操作方法如下：A.家系单体型构建：1)样本基因分型：将患者夫妇双方、患者亲属、和胚胎(囊胚)进行SNP基因分型；2)确定信息SNPs位点：信息SNPs的选择标准为：在染色体平衡易位携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在患者亲属中也是纯合型的SNP位点；选择覆盖染色体易位断裂点、易位染色体和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs，染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP；在覆盖断裂点区域，信息SNPs从断裂点上下游2Mb范围内选择；3)构建家系单体型：集合步骤2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖两处断裂区域、易位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型。1-9号家系部分胚胎家系单体型构建信息如表4所示，图3展示了3号家系的家系单体型图：表4.1-9号家系部分胚胎家系单体型构建信息1断裂点通过不平衡胚胎的分子核型确定2患者的哥哥作为参照3患者的姐姐作为参照4因为该处缺少信息SNPs，所以该区域不能构建单体型B.区分携带平衡易位或正常染色体的胚胎的方法：将胚胎(囊胚)细胞中断裂点区域的单体型信息和参照样本的染色体单体型信息进行比对，通过整条染色体的单体型信息判断染色体易位断裂点区域是否发生了同源重组：i)当以与携带者具有相同平衡易位的亲属为参照时：a.若待定样本染色体易位断裂点区域没有发生重组，当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体平衡易位携带者以及与携带者具有相同平衡易位的亲属的单体型信息一致时，则为平衡易位携带胚胎；当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体平衡易位携带者单体型信息一致，但与携带相同平衡易位的携带者亲属的单体型信息不一致时，则为染色体完全正常的胚胎；b.若待定样本染色体易位断裂点区域发生了同源重组，则平衡易位携带或染色体完全正常胚胎的判断标准与a相反；ii)当以染色体正常的亲属为参照时：a.若待定样本染色体易位断裂点区域没有发生重组，当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体平衡易位携带者以及携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时，则为染色体完全正常的胚胎，当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体平衡易位携带者单体型信息一致，但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时，则为平衡易位携带胚胎；b.若待定样本染色体易位断裂点区域发生了同源重组，则平衡易位携带或染色体完全正常胚胎的判断标准与a相反。3、1-9号家系胚胎染色体平衡易位筛查结果经过家系单体型连锁分析，对44个待移植胚胎进行诊断，20个是平衡易位或者正常的染色体的整倍体，11个是易位相关的变异，13个显示和易位无关的变异；分别使用与携带者具有相同平衡易位的亲属或携带者的染色体正常的亲属为参照，分析上述20例平衡易位或者正常胚胎，采用上述Bi)或Bii)所述的区分方法分别对每个胚胎进行预测，预测结果一致：9例是染色体易位胚胎，其余的12例是完全正常胚胎。并且每个胚胎不同易位断裂点区域的预测结果之间具有一致性。实施例4：胚胎移植及胚胎染色体平衡易位单体型筛查方法效果验证1、胚胎移植按照本领域常规方法将上述实施例3表4中涉及的胚胎用于胚胎移植。9个冷冻囊胚融化后均成活，一共经过了9个移植周期，均在第一次移植后成功受孕。2、妊娠中期行羊水穿刺进行细胞遗传学分析验证胚胎移植成功后，通过与妊娠中期常规羊水核型的比较来验证本发明所述鉴别染色体平衡易位携带胚胎和染色体完全正常胚胎的PGH方法的预测准确性。羊水细胞染色体制备方法(原位法)A.细胞培养1).将羊水(约20ml)转移到无菌的离心管中，1000rpm离心10分钟；2).去除上清液，用于其它分析，保留细胞悬液约0.5～1ml，用培养基混匀到2～2.5ml左右；3).将细胞悬液平分到2～4只Chromslide培养皿中；4).培养24/48小时后，向每只Chromslide培养皿中加入约2.5ml羊水培养基；5).培养第5～6天后，对细胞生长状况进行观察，更换新的培养基；6).1～2天后观察细胞的生长状况，如果细胞克隆数足够，向培养皿中加入秋水仙素，收获细胞，处理时间根据秋水溶液浓度确定。B.染色体制备1).倾斜Chromslide细胞培养皿，完全去除培养基；2).加入3～4ml低渗液到每个培养皿中，室温处理10分钟；3).直接向低渗液中加入0.5～0.7ml固定液，室温处理5分钟；4).去除上清液，加入3～4ml新鲜的固定液，室温处理；5).重复第四步1～2次；6).去除固定液，在Maxchrome染色体分散仪(设定适当的参数)中进行染色体分散过程；7).玻片干燥后，老化，显带。表5显示了已成功移植的胚胎中使用本发明所述鉴别染色体平衡易位携带胚胎或染色体正常胚胎方法所获得的诊断结果与羊水穿刺进行细胞遗传学分析验证的结果的具体信息。表5.PGH预测结果与羊水穿刺细胞遗传学验证结果对比由表5可知，经过验证，家系单体型的预测结果和羊水穿刺术中细胞的遗传学分析结果完全一致，证明本发明所述鉴别染色体平衡易位携带胚胎或正常胚胎的PGH方法的灵敏度和特异性均为100％。当前第1页1 2 3