一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法与流程

本发明涉及基因调控网络技术领域，特别涉及一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法。

背景技术：

随着全球气候变暖，热应激对畜牧业的影响越来越严重。而我国幅员辽阔，每年夏季大片区域受热应激影响，导致畜禽代谢紊乱、生产性能和繁殖性能降低，造成严重的经济损失。热应激反应是动物机体一种自我保护机制，相关基因和蛋白质表达发生改变。研究表明，热应激对奶牛的多数免疫指标有重要影响。多数有关缓解热应激发生的研究措施主要是从营养角度出发。关于体外分子诊断的研究方法却较少。

微小RNA(microRNA，即miRNA)通过与靶mRNA特异性的碱基配对，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而发挥基因转录后调节功能。miRNA分子广泛参与到调控细胞生长、发育、分化及凋亡的各个环节，并与动物生理状态的改变以及疾病的发生、发展密切相关。miRNA在哺乳动物泌乳过程中也起着重要的作用。

miRNAs作为一种转录后水平的调控因子，在哺乳动物基因的转录水平中只有1％～5％被编码，却调控超过60％的基因。miRNAs作为一种转录后调控机制，在细胞生长、凋亡，机体免疫和抗应激反应、生长性能和繁殖性能等多方面发挥重要的调控作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法。

一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、热应激奶牛与非热应激奶牛乳腺组织样本采集；

步骤二、Solexa高通量测序鉴定参与奶牛热应激反应的miRNA，寻找差异表达miRNA；

步骤三、差异表达显著的miRNA靶基因预测；

步骤四、差异表达显著的miRNA调控网络构建。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤一中，热应激奶牛与非热应激奶牛乳腺组织样本采集，根据系谱资料、奶牛生产性能测定体系DHI数据和牛场记录数据，选取性别相同，饲养环境、年龄及胎次相近的4头热应激奶牛和4头非热应激奶牛作为实验牛，采集乳腺组织样本放入液氮中，到实验室转入-70℃冰箱保存备用。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二包括如下步骤：

(a)用Trizol试剂提取热应激期和非热应激期奶牛乳腺组织总RNA并鉴定；

(b)采用TA克隆和传统Sanger测序对所提总RNA鉴定是否可用于Solexa测序，建立小RNA文库，并进行测序分析验证；

(c)分离长度18-30nt范围的小RNA，两端分别加上特定接头后体外反转录成cDNA，经RT-PCR扩增后用Solexa测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序；

(d)对所测的原始序列进行处理与统计；

(e)将步骤(d)处理过的序列与已知库中序列进行比对分析并分类注释；

(f)鉴定已知miRNA和预测新miRNA；

(g)寻找差异表达miRNA。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二第(a)条包括以下内容：

①取-70℃冻存组织约100mg在液氮中研磨后加入1ml Trizol试剂混匀；

②样品中加入Trizol试剂后反复吹打几次，使样本充分裂解，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离；

③向以上溶液中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟；

④4℃12000rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μl)转移到一个新的RNase-Free离心管中；

⑤在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；

⑥4℃12000rpm离心10分钟，弃上清；

⑦加入1ml 75％乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀；

⑧4℃12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀；

⑨室温放置2-3分钟，晾干。加入30μL无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解；

⑩由1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA提取结果，用生物分析仪分析RNA的完整性和浓度。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二第(d)条包括以下内容：

通过去接头、去污染、统计序列长度分布等过程，获得去杂质的“干净”序列(Clean序列)。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二第(e)条包括以下内容：

将Clean序列通过与NCBI Genbank(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)中rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeat、exon、intron和miRNA等库中序列进行比对分析并分类注释。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二第(f)条包括以下内容：

根据牛、人、猪、犬、大猩猩和老鼠等哺乳动物已经注册的miRNA分子信息，用同源搜索的计算分析方法预测牛新的候选miRNA，通过碱基错配、二级结构、A+U含量、自由能大小等分析候选序列特征，鉴定已知miRNA和预测新miRNA。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤二第(g)条包括以下内容：

将测序样品测序量归一化到同一个量级，使用标准化后的结果统计倍数变化和P值，定义差异表达miRNA的P值＜0.01、FDR＜0.05，寻找差异表达miRNA。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤三包括以下内容：

对差异表达显著的miRNA，通过应用含有预编译的Miranda算法结果的数据库MicroCosm(http:www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)以及预测软件TargetScan 6.0(http://www.Targetscan.org/)分别获得2个预测软件的靶基因集，并求取2个靶基因集的交集作为差异miRNA调控的全体靶基因。

进一步的，所述的热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法，步骤四包括以下内容：

应用DAVID(database for annotation,visualization and integrated discovery)网站(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)对差异miRNA调控的差异靶基因进行GO分析和Pathway分析，确定预测靶基因参与的生物过程及最主要生化代谢途径和信号转导途径等生物学功能，构建基因调控网络，以P＜0.01、FDR＜0.05为筛选标准。

本发明以热应激奶牛乳腺和正常奶牛乳腺为试验材料，采用高通量测序技术筛选出两种乳腺中差异表达的miRNA，并对差异表达的miRNAs进一步验证分析，利用生物信息学方法预测奶牛热应激反应中差异表达miRNA靶基因并分析其信号通路，构建miRNA介导的调控网络。揭示高温环境下miRNA的调控作用及其机制，为调控或减弱奶牛的热应激反应，以及提高产奶量提供新的试验数据。同时，对开发热应激蛋白质饲料、调控奶牛环境等方面也具有非常重要的意义。

附图说明

图1为RNA的Agilent 2100生物分析仪检测结果

图2为差异表达的已知miRNA的靶基因位点统计图

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。

一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达miRNAs基因调控网络构建，包括如下步骤：

步骤一、热应激奶牛与非热应激奶牛乳腺组织样本采集。

根据系谱资料、DHI数据和牛场记录数据，选取性别相同，饲养环境、年龄及胎次相近的4头热应激奶牛(夏季，8月)和4头非热应激奶牛(春季，3月)作为实验牛，采集乳腺组织样本放入液氮中，到实验室转入-70℃冰箱保存备用。

步骤二、Solexa高通量测序鉴定参与奶牛热应激反应的miRNA，寻找差异表达miRNA。

(a)用Trizol试剂提取热应激和非热应激期奶牛乳腺组织总RNA并鉴定。提取步骤如下：

①取-70℃冻存组织约100mg在液氮中研磨后加入1ml Trizol试剂混匀。

②样品中加入Trizol试剂后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

③向以上溶液中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟。

④4℃12000rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相(约600μl)转移到一个新的RNase-Free离心管中。

⑤在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。

⑥4℃12000rpm离心10分钟，弃上清。

⑦加入1ml 75％乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀。

⑧4℃12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。

⑨室温放置2-3分钟，晾干。加入30μL无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

⑩由1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA提取结果，用生物分析仪分析RNA的完整性和浓度。由图1可知，样品总RNA浓度为235ng/μL，28S:18S约为2.0，RNA完整性(RIN)为8.4，达到了文库构建的要求，可以进行后续的试验。

(b)建立小RNA文库，并进行测序分析验证。

采用TA克隆和传统Sanger测序对所提总RNA鉴定是否可用于Solexa测序。建立了小RNA文库，并进行了测序分析。

(c)用Solexa测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。

分离长度18-30nt范围的小RNA，两端分别加上特定接头后体外反转录成cDNA，经RT-PCR扩增后用Solexa测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。

(d)对所测的原始序列进行处理与统计；

共获得21,684,303个高质量序列，通过去接头、去污染、统计序列长度分布等过程，获得去杂质的“干净”序列(Clean序列)21,042,828个，占所有小RNA的97.04％。

(e)将步骤(d)处理过的序列与已知库中序列进行比对分析并分类注释；

将Clean序列通过与NCBI Genbank(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/)中rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeat、exon、intron和miRNA等库进行比对和分类注释。87.62％为已知的miRNA，只有3.73％为tRNAs、snRNAs、rRNA和snoRNAs。

(f)鉴定已知miRNA和预测新miRNA。

根据牛、人、猪、犬、大猩猩和老鼠等哺乳动物已经注册的miRNA分子信息，用同源搜索的计算分析方法预测牛新的候选miRNA，通过碱基错配、二级结构、A+U含量、自由能大小等分析候选序列特征。发现已知miRNAs 483个，新miRNAs 139个。

(g)寻找差异表达miRNA。

将测序样品测序量归一化到同一个量级，使用标准化后的结果统计倍数变化和P值。定义差异表达miRNA的P值＜0.01、FDR＜0.05。发现差异表达miRNA27个，其中已知miRNA 24个，新miRNA 3个(如表1所示)；上调miRNA20个，下调miRNA7个，丰富了奶牛miRNA数据库。

表1 差异表达新miRNA

步骤三、差异表达显著的miRNA靶基因预测。

对差异表达显著的miRNA，通过应用含有预编译的miRanda算法结果的数据库MicroCosm(http:www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)以及预测软件TargetScan 6.0(http://www.Targetscan.org/)分别获得2个预测软件的靶基因集，并求取2个靶基因集的交集作为差异miRNA调控的全体靶基因，24个差异表达的miRNA共有65625个靶基因，靶基因位点数为293949个，如图2所示。

新发现的novel-miR-278在热应激组奶牛乳腺组织中表达下降，其预测靶基因HSP40作为HSP70蛋白的一种共伴侣分子，调节HSP70的ATP酶活性促进HSP70蛋白完成许多细胞过程，包括新生蛋白质的折叠、错误折叠蛋白质的解折叠、蛋白质的转运、组装和解离过程。novel-miR-278靶向调节的另一个基因是IFNAR2(干扰素α/β受体β链)。干扰素(Interferon,IFN)是一种具有抑制细胞分裂、调节免疫和促进细胞凋亡等多种生物学活性的细胞因子。干扰素受体与之结合可转换成细胞内信号,从而启动细胞核内基因的转录。以上结果表明，这个新发现的miRNAs在热应激条件下可能通过调控靶基因表达，参与机体免疫和抗应激反应。

步骤四、差异表达显著的miRNA调控网络构建。

为了进一步研究组织差异表达miRNAs的生物学功能，应用DAVID(database for annotation,visualization and integrated discovery)网站(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)对差异miRNA调控的差异靶基因进行GO分析和Pathway分析，确定预测靶基因参与的生物过程及最主要生化代谢途径和信号转导途径等生物学功能。以P＜0.01、FDR＜0.05为筛选标准。

表2 miRNA差异表达靶基因GO富集分析(靶基因数>6000)

表3 miRNA靶基因的KEGG通路分析

通过对奶牛热应激基因的调控网络分析发现，Wnt、TGF-β、MAPK、Notch和JAK-STAT信号通路等广泛参与了奶牛热应激。大多情况下MAPK通常作为执行者发挥主要调控作用，TGF-β作为激活其他信号通路的领导者，Wnt信号通路起协调作用，而Notch和JAK-STAT信号通路起微调作用。我们对预测的靶基因进行KEGG分析中这六个信号通路都有发现，其中MAPK信号通路中相关的预测的靶基因占0.23％，Wnt信号通路占1.65％，TGF-β信号通路占0.71％，Notch信号通路占0.58％，JAK-STAT信号通路占1.22％。这些靶基因所对应的miRNA是研究奶牛热应激反应中的重要候选miRNA。

SEQUENCE LISTING

<110> 廊坊师范学院

<120> 一种热应激条件下奶牛乳腺差异表达基因调控网络的构建方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> novel-miR-278

<400> 1

aacaggcggg ugcugauacg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> novel-miR-383

<400> 2

gaggcggggg ucgcucucuu u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> novel-miR-504

<400> 3

ucacugggca uccucugcuu u 21