图像清晰度识别方法和自动聚焦方法与流程

本发明涉及高通量基因测序领域，更具体地说，涉及一种图像清晰度识别方法和采用所述图像清晰度识别方法的自动聚焦方法。

背景技术

高通量基因测序仪中需要对样本进行图像拍摄，判断拍摄图像的清晰度后才能实现准确对焦，以获取符合要求的高通量基因测序图像，进而实现后续数据处理以识别样本的基因序列。一种现有技术图像清晰度识别的方法是通过高斯模板匹配后识别拍摄图像中的磁珠数量来确定拍摄图像的清晰度值的，这种方法计算较为复杂，且结果和高斯模板选择也有较大的关系，因此需要一种简单可靠的图像清晰度识别方法，用来实现准确识别图像的清晰度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种识别准确的图像清晰度识别方法。

本发明的另一目的在于提供一种使用准确图像清晰度识别方法的自动聚焦方法。

一种图像清晰度识别方法包括：提供包括背景像素和目标像素的待识别图像；预设背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值，两个灰度均值作为两个聚类中心对待识别图像的所有像素进行均值聚类分析，以获取均值聚类分析后的背景像素灰度均值和目标像素灰度均值；以及定义聚类分析后的背景像素灰度均值和聚类分析后的目标像素灰度均值的差值为待识别图像的清晰度值。

进一步地，所述待识别图像为高通量基因测序图像。

进一步地，所述高通量基因测序图像为明场图像或荧光图像。

进一步地，所述高通量基因测序图像为明场图像，所述背景像素的预设灰度均值大于待识别图像中预设区域内所有像素的灰度平均值，所述目标像素的预设灰度均值小于待识别图像中预设区域内所有像素的灰度平均值。

进一步地，所述高通量基因测序图像为荧光图，所述背景像素的预设灰度均值小于待识别图像中预设区域内所有像素的灰度平均值，所述目标像素的预设灰度均值大于待识别图像中预设区域内所有像素的灰度平均值。

进一步地，所述待识别图像包括多个磁珠，所述目标像素为多个磁珠对应的像素。

进一步地，所述清晰度值越大则待识别图像越清晰。

进一步地，所述对待识别图像的所有像素进行均值聚类分析包括：a.根据两个聚类中心，将待识别图像的所有像素归类为背景像素和目标像素；b.计算所有背景像素的灰度均值和所有目标像素的灰度均值作为两个新的聚类中心；以及c.执行a-b一次或多次直到两个新的聚类中心的变化值小于聚类阈值或两个新的聚类中心不再变化。

一种自动聚焦方法包括：控制成像装置在不同聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄，获得多个基因测序图像；采用权利要求1的方法计算每个基因测序图像的清晰度值，获取所述多个基因测序图像的清晰度值中的最大值，具有最大清晰度值的基因测序图像对应的聚焦位置定义为最佳聚焦位置，以及移动成像装置到最佳聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄。

进一步地，对基因测序目标样本的拍摄以预先选择的基因测序目标样本的中间矩形区域进行。

进一步地，所述矩形区域分割为多个适配成像装置的聚焦范围的小区域，成像装置分别对每个小区域进行拍摄。

一种自动聚焦方法包括：以固定步长同向移动成像装置并对基因测序目标样本进行拍摄，依次获得不同焦距成像的第一基因测序图像，采用权利要求1的方法计算第一基因测序图像的第一清晰度值，如果第一清晰度值递增，则重复执行本步骤；如果第一清晰度值减小，则反向以固定步长移动成像装置并对基因测序目标样本进行拍摄，依次获得不同焦距成像的第二基因测序图像，采用权利要求1的方法计算第二基因测序图像的第二清晰度值，如果第二清晰度值递增，则重复执行本步骤；如果第二清晰度值减小，则每次将步长折半后移动成像装置并对基因测序目标样本进行拍摄，依次获得不同焦距成像的第三基因测序图像，采用权利要求1的方法计算第三基因测序图像的第三清晰度值；获取第三清晰度值中的最大值，定义具有最大第三清晰度值的基因测序图像对应的焦距定义为最佳聚焦位置；以及移动成像装置到最佳聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄。

进一步地，对基因测序目标样本的拍摄以预先选择的基因测序目标样本的中间矩形区域进行。

进一步地，所述矩形区域分割为多个适配成像装置的聚焦范围的小区域，成像装置分别对每个小区域进行拍摄。

进一步地，对基因测序目标样本进行拍摄前进一步包括调平基因测序目标样本的承载平台的步骤。

进一步地，调平基因测序目标样本的承载平台的步骤包括将成像装置分别移动到矩形区域的四个角落，获得每个角落小区域具有最大清晰度值的基因测序图像对应的最佳聚焦位置，根据四个角落的小区域的最佳聚焦位置调平承载平台。

相对于现有技术，本发明的图像清晰度识别方法和测序仪利用均值聚类分析方法获取待识别图像的背景像素灰度均值和目标像素灰度均值；然后利用两个灰度均值的差值定义待识别图像的清晰度值，无需使用模板对待识别图像中的磁珠进行识别，计算量相对也比较少，因此计算速度较快，清晰度识别准确。

附图说明

图1是本发明第一实施例图像清晰度识别方法的流程图。

图2为本发明高通量基因测序图像的预设区域的示意图。

图3为本发明对待识别图像的所有像素进行均值聚类分析的方法流程图。

图4为第一实施例中图像清晰度识别方法获取的不同焦距下图像的清晰度值的曲线图。

图5为本发明第二实施方式自动聚焦方法的流程示意图。

图6为本发明第三实施方式自动聚焦方法的流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的.技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

请参阅图1，本发明第一实施例提出一种图像清晰度识别方法，其包括：

s11，提供包括背景像素和目标像素的待识别图像。本实施例中，所述待识别图像可以为测序仪的拍图装置对测序样本拍摄获取的高通量基因测序图像，所述高通量基因测序图像包括多个磁珠，所述目标像素为多个磁珠对应的像素。所述高通量基因测序图像可以为明场图像或荧光图像。明场图像为使用灯光照射样本的条件下拍摄的图像，荧光图像为样本在测序反应后自发光条件下拍摄的图像。

s12，预设背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值，两个灰度均值作为两个聚类中心对待识别图像的所有像素进行均值聚类分析，以获取均值聚类分析后的背景像素灰度均值和目标像素灰度均值。

请一并参考图2，以明场图像为例，在高通量基因测序图像的中心位置选取一预设区域201，对预设区域201内的所有像素的灰度值排序并计算平均值，选取预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最大值之间的灰度值，例如预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最大值的平均值作为预设的背景像素的灰度均值。选取预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最小值之间的灰度值，例如预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最小值的平均值作为预设的目标像素的灰度均值。以荧光图为例，在高通量基因测序图像的中心位置选取一预设区域201，对预设区域201内的所有像素的灰度值排序并计算平均值，选取预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最大值之间的灰度值，例如预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最大值的平均值作为预设的目标像素的灰度均值。选取预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最小值之间的灰度值，例如预设区域201像素灰度平均值与预设区域201像素灰度最小值的平均值作为预设的背景像素的灰度均值。

较佳实施例中，将待识别图像降低为预设级数的灰度图像，计算并选出像素数量最多的两个灰度级别，将选出的两个灰度级别对应的像素的灰度均值作为两个初始的聚类中心。具体地，所述预设级数可以为8级，本实施例中将待识别图像每个像素的灰度值除以预设参数可以以将待识别图像降低为预设级数的灰度图像，例如待识别图像本来是4096级数灰度的图像，将待识别图像每个像素的灰度值除以预设参数512将待识别图像降低为灰度级别为8级的图像。

替代实施例中，根据待识别图像的类型，也可根据经验预设背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值，例如待识别图像是荧光图，则预设的背景像素的灰度均值可以为200-500之间的数值，例如400；目标像素的灰度均值可分别为800-2000之间的数值，例如900。

请一并参阅图3，本实施例中，所述对待识别图像的所有像素进行均值聚类分析包括：

s31.根据两个聚类中心，将待识别图像的所有像素归类为背景像素和目标像素；

s32.计算所有背景像素的灰度均值和所有目标像素的灰度均值作为两个新的聚类中心；

s33.执行步骤s31-s32一次或多次直到两个新的聚类中心的变化值小于聚类阈值或两个新的聚类中心不再变化。

一实施例中，以荧光图为例，预设目标像素的灰度均值为1500，预设背景像素的灰度均值为380；第一次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值1500的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值380的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为1310.7，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为363.5，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

很明显，两个新的聚类中心都有较大的变化，因此根据两个新的聚类中心，第二次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值1310.7的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值363.5的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为1183.4，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为348.4，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第三次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值1183.4的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值348.4的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为1103.8，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为336.8，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第四次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值1103.8的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值336.8的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为1051.4，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为328.2，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第五次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值1051.4的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值328.2的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为1017.1，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为322.1，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第六次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值1017.1的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值322.1的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为994.5，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为317.8，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第七次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值994.5的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值317.8的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为978.7，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为314.6，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第八次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值978.7的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值314.6的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为967.4，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为312.3，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第九次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值967.4的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值312.3的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为960.7，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为311.0，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

两个新的聚类中心仍然有较大变化，因此根据两个新的聚类中心，第十次执行步骤s31-s32,将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值960.7的像素归类为目标像素，将待识别图像的所有像素中更接近灰度均值311.0的像素归类为背景像素，然后根据归类后的目标像素重新计算目标像素的灰度均值为958.0，根据归类后的背景像素重新计算背景像素的灰度均值为310.0，并将重新计算后的背景像素的灰度均值和目标像素的灰度均值定义为两个新的聚类中心。

如果设定的聚类阈值为5，则经过上述多次执行步骤s31-s32以后，两个新的聚类中心的变化值小于聚类阈值，开始执行下一步骤s13。替代实施例中，也可以继续循环执行步骤s31-s32，直到两个新的聚类中心不再变化才执行下一步骤s13。

s13，定义聚类分析后的背景像素灰度均值和聚类分析后的目标像素灰度均值的差值为待识别图像的清晰度值。本实施方式中，设聚类分析后的背景像素灰度均值和聚类分析后的目标像素灰度均值分别为958.0和310.0，则待识别图像的清晰度值计算为958.0-310.0=648.0。本实施方式中，所述清晰度值越大则待识别图像越清晰。请参考图4，在不同焦距下对样本进行图像拍摄后，用上述图像清晰度识别方法分别获取不同焦距图像的清晰度值，最大清晰度值的位置则对应实际最佳焦距的位置。

相对于现有技术，本发明的图像清晰度识别方法利用均值聚类分析方法获取待识别图像的背景像素灰度均值和目标像素灰度均值；然后利用两个灰度均值的差值定义待识别图像的清晰度值，无需使用模板对待识别图像中的磁珠进行识别，计算量相对也比较少，因此计算速度较快，实验验证本发明图像清晰度识别方法计算的最大清晰度值的位置正好对应实际最佳焦距的位置，因此本发明的图像清晰度识别方法可以非常准确地识别图像的清晰度值。

请参阅图5，本发明第二实施例提供一种自动聚焦方法，其包括步骤s51-s54。本实施例的自动聚焦方法可以用于控制成像装置对基因测序目标样本进行精确对焦。较佳实施例中，成像装置可以是显微镜和ccd的结合。

步骤s51,控制成像装置在不同聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄，获得多个基因测序图像。本实施例中，通过连续调节成像装置与基因测序目标样本之间的距离，控制成像装置依序在不同聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄，例如从远离基因测序目标样本的位置朝向基因测序目标样本以固定步长步进移动成像装置，每次移动后对基因测序目标样本进行一次拍摄，即可获得连续变化焦距的一组基因测序图像。较佳实施例中所述固定步长可以为0.5um，较佳实施例中一组基因测序图像的数量可以为20。

步骤s52,采用第一实施例的方法计算每个基因测序图像的清晰度值。

本实施例中，采用第一实施例的方法，以单个基因测序图像为例，先计算图像内每个像素的灰度差值，然后对图像的所有像素的灰度差值进行排序，按像素总量的预设比例保留排序后灰度差值较大的部分，滤除其他灰度差值较小的部分，将保留的灰度差值的平均值作为识别单个基因测序图像是否清晰的清晰度值。

步骤s53，获取所述多个基因测序图像的清晰度值中的最大值，具有最大清晰度值的基因测序图像对应的聚焦位置定义为最佳聚焦位置。

本实施例中，根据计算的多个基因测序图像的清晰度值及对应的焦距拟合焦距清晰图曲线，曲线最高点对应的焦距为最佳聚焦位置。

步骤s54，移动成像装置到最佳聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄。

一实施例中，成像装置的聚焦范围远小于基因测序目标样本的面积，对基因测序目标样本的拍摄以预先选择的成像效果较好的基因测序目标样本的中间矩形区域进行。实际拍摄时，将预先选好的基因测序目标样本中间的矩形区域分割为多个适配成像装置的聚焦范围的小区域，然后移动成像装置分别对每个小区域进行拍摄。

本实施例中还可进一步包括调平基因测序目标样本的承载平台的步骤。具体地，拍摄前为了调平基因测序目标样本的承载平台，保证矩形区域的四个角的小区域的最佳聚焦位置的最大误差不超过10um，即保证四个角处的小区域所在平面与成像装置的透镜平面之间的距离的最大差值不超过10um，承载平台将成像装置分别移动到矩形区域的四个角落，获得每个角落小区域具有最大清晰度值的基因测序图像对应的最佳聚焦位置，根据四个角落的最佳聚焦位置调平承载平台。

参考图6，本发明第三实施例提供一另种自动聚焦方法，其包括步骤s61-s65。相对于第二实施例，本实施例先采用固定步长将成像装置调整到最佳聚焦位置附近，然后折半步进查找最佳聚焦位置，聚焦比第二实施方式更快更准确。

步骤s61，以固定步长同向移动成像装置并对基因测序目标样本进行拍摄，依次获得不同焦距成像的第一基因测序图像，采用第一实施例的方法计算第一基因测序图像的第一清晰度值，如果第一清晰度值递增，则重复执行本步骤。较佳实施例中，成像装置可以是显微镜和ccd的结合。本实施例中，通过连续调节成像装置与基因测序目标样本之间的距离，控制成像装置依序在不同聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄，例如从远离基因测序目标样本的位置朝向基因测序目标样本以固定步长步进移动成像装置，每次移动后对基因测序目标样本进行一次拍摄，即可获得连续变化焦距的一组基因测序图像。较佳实施例中所述固定步长可以为2-5um，最佳为4um。

步骤s62，如果第一清晰度值减小，则反向以固定步长移动成像装置并对基因测序目标样本进行拍摄，依次获得不同焦距成像的第二基因测序图像，采用第一实施方式的方法计算第二基因测序图像的第二清晰度值，如果第二清晰度值递增，则重复执行本步骤。

步骤s63，如果第二清晰度值减小，则每次将步长折半后往返步进移动成像装置并对基因测序目标样本进行拍摄，依次获得不同焦距成像的第三基因测序图像，采用第一实施例的方法计算第三基因测序图像的第三清晰度值。本实施例中，经过步骤s31和步骤s32后，成像装置已经比较接近最佳焦距，当第二清晰度值减小时，开始往返步进移动成像装置且每次步进移动的距离减半，每次移动后对基因测序目标样本进行一次拍摄，即可获得连续变化焦距的一组第三基因测序图像。

步骤s64，获取第三清晰度值中的最大值，定义具有最大第三清晰度值的第三基因测序图像对应的焦距定义为最佳聚焦位置，以及

步骤s65，移动成像装置到最佳聚焦位置对基因测序目标样本进行拍摄。

一实施例中，成像装置的聚焦范围远小于基因测序目标样本的面积，对基因测序目标样本的拍摄以预先选择的成像效果较好的基因测序目标样本的中间矩形区域进行。实际拍摄时，将预先选好的基因测序目标样本中间的矩形区域分割为多个适配成像装置的聚焦范围的小区域，然后移动成像装置分别对每个小区域进行拍摄。

本实施例中还可进一步包括调平基因测序目标样本的承载平台的步骤。具体地，拍摄前为了调平基因测序目标样本的承载平台，保证矩形区域的四个角的小区域的最佳聚焦位置的最大误差不超过10um，即保证四个角处的小区域所在平面与成像装置的透镜平面之间的距离的最大差值不超过10um，承载平台分别移动到矩形区域的四个角落，获得每个角落具有最大清晰度值的基因测序图像对应的最佳聚焦位置，根据四个角落的最佳聚焦位置调平承载平台。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改.等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。