一种不用缫丝的茧丝细度直接测定方法及其应用与流程

本发明属于蚕茧质量性状测定领域，具体涉及一种能在不缫丝、不损伤蚕蛹的基础上测定茧丝细度的方法，还涉及到测试得到的茧丝细度在计算茧丝纤度方面的应用。

背景技术：

蚕丝作为重要的天然蛋白纤维，有“人体第二肌肤”、“纤维皇后”的美称。随着人们生活水平的日益提高，市场对丝绸制品的要求也变得高级化、多样化，粗纤度茧丝可缫制粗规格生丝，适合于做西服等有一定挺括度要求的纺织服装及饰品；细纤度茧丝其织物具有更突出的舒适度和吸湿性等优点，对皮肤有更佳的保健作用，还能满足开发新型丝绸薄型织物及高附加值复合纤维如医用内脏手术缝合线、降落伞和航天器绝缘材料等的需要，具有更高的经济价值。而中国多是生产普通纤度茧丝，大多用来缫制4a级20/22d生丝，其需求量相对稳定，价格不高，市场竞争力不强。为此，有必要了解纤度遗传规律，并用分子生物学方法辅助选育高品质特殊用途蚕品种。茧丝纤度是受微效多基因控制的数量性状，受蚕品种、饲养条件、叶质、饲育期、茧层部位等因素的影响。纤度是家蚕品种审定时的一个重要经济指标，也是家蚕遗传育种和缫丝工艺重要的理论依据。目前茧丝细度以纤度表示，通过单位长度(m)茧丝的质量(g)来度量，1dtex＝1g/10000m，1tex＝1g/1000m，1tex＝10dtex＝9d。纤度数据需要缫丝后测定获得，但缫丝工艺复杂，对茧质要求高，并且缫丝时一些极细纤度的茧丝易切断。同时，缫丝后测定不具有预判功能，在需要保留活蛹的选种及有关研究中，因缫丝难以保全活蛹或会对蛹体造成一定的伤害，使对应个体的茧丝纤度性状的表型数据难以获得，以至于家蚕中对茧丝纤度的深入研究鲜见报道。因此，开发更高效、更准确并不损伤蚕蛹的能够直接反映茧丝细度特征的测定方法，对于推动茧丝细度性状的遗传基础和调控机制解析十分必要，同时在生产实践中具有更广泛的应用价值。

陈玉银等用扫描电镜观察纤度有极显著差异的3个蚕品种的茧丝表面及断面结构,发现这三个品种的显微结构也存在极显著差异。中山贤三等切取茧的一部分，通过镜检进行微茸调查的同时，测定茧丝粗细，结果表明只要测定最粗的和最细两个点的茧丝得到的平均值就与缫丝所得的茧丝纤度之间呈显著的相关性，并认为这种方法在进行遗传育种时用于初步的个体选拔是可行的，但并不能准确的测定茧丝纤度。杨彦波等的译作中应用分辨力为1μm的ccd线型感知器测量生丝直径，开发了在运行中即时测量生丝纤度的装置及其测试方法。该装置运行中丝径值与纤度值呈直线相关，相关系数为0.785，因此有可能通过测定丝径来计算纤度值。盛井龙等运用现代光电传感器、自动测量与控制和虚拟仪器技术，研制出了一套茧丝细度连续测量装置，有利于提高纤维的细度及相关指标的检测水平和检验效率，并能提高纤度的检测准确性，但用此装置检测茧丝纤度需在缫丝的基础上进行，无法检测平板茧、薄头茧等的茧丝细度，也不能测定茧片以及由于融茧酶或其它因素遭到破坏的不完整茧壳的丝细度。

因此，需要研究一种对样品要求不高、适用范围广、不用缫丝并能满足鲜茧活蛹不受伤害的高效、准确、直接的茧丝细度测定方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不用缫丝的茧丝细度直接测定方法；本发明的目的之二在于茧丝细度在计算茧丝纤度方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种不用缫丝的茧丝细度直接测定方法，所述方法包括如下步骤：

(1)茧丝脱胶：从茧壳中切取面积为0.5～1.5cm²的样品，进行脱胶处理后得到脱胶茧丝；

(2)冷冻切片：将步骤(1)中脱胶的茧丝经过包埋处理后在-20℃下进行切片处理，得到厚度为2μm的切片；

(3)拍照保存：将步骤(2)中得到的切片置于显微镜下放大不小于20倍，拍照并保存图片；

(4)计算茧丝细度：用imagej软件计算步骤(3)中保存的图片的横截面积即为茧丝的细度。

优选的，步骤(1)中所述脱胶处理的具体方法为：将所述样品置于95～100℃的碳酸钠溶液中，搅拌5min，用去离子水反复洗涤后放置在温度为18～22℃、相对湿度为60～70％的环境中平衡24h以上即可得到脱胶茧丝。

进一步优选的，所述碳酸钠溶液中碳酸钠的质量分数为0.5％。

优选的，步骤(2)中所述包埋处理的具体方法为：将所述脱胶茧丝排列粘在中央有小孔的纸片上，然后将纸片固定于模具上，倒入包埋剂，置于-20℃的条件下使包埋剂凝固即可。

进一步优选的，所述包埋剂为樱花包埋剂。

优选的，步骤(2)中所述计算过程中还包括以下处理步骤：阀值分割方法来实现茧丝显微图像的二值分割、手动处理去掉不理想图像、孔洞填充和流域分割除去背景噪声；所述不理想图像包括有明显厚度的无规则图像、边界处有部分不完整的图像或噪声点形成的图像。

2、上述测定方法测定得到的茧丝细度在计算茧丝纤度方面的应用。

优选的，所述计算茧丝纤度的过程采用的计算公式为：

y＝61.15*x+3.868(1)；

其中y为茧丝细度，单位为μm²；x为茧丝纤度，单位为d。

进一步优选的，公式(1)中y为n个茧丝横截面的平均值。

进一步优选的，所述n为≥300的整数。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种不用缫丝的茧丝细度直接测定方法，通过在茧壳中切取面积约为0.5～1.5cm²的样品，依次进行脱胶、平衡、包埋处理后进行切冷冻片，然后用imagej软件计算经过显微镜放大的茧丝的横截面积。本发明的测量方法是在不必缫丝、不影响蛹体健康的基础上进行的高效、准确、直接的测定茧丝细度的方法；用imagej软件自动计算每张切片中的众多茧丝横截面的面积，可以排除人为选择截面的误差。另外还可以根据y＝61.15*x+3.868的计算公式将本发明测定得到的茧丝细度用于计算茧丝的纤度。本发明的方法及应用对于蚕遗传育种以及解析丝细度的遗传规律极为重要，且因对茧样的形态和质量没有特殊要求，适用更广，由于使用的仪器较为常见，测试方法简便，也能用于其他纤维的细度测定。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为蚕茧脱胶前和脱胶后的图片，其中a为未脱胶的茧壳，b为切取成小块的茧壳，c为茧壳脱胶后的样品；

图2为冷冻切片后的茧丝截面sem图；

图3为imagej软件处理图像的步骤(a：茧丝横截面灰度图像；b：边界清晰完整的茧丝横截面二值分割图像；c：去除部分不理想截面后的图像；d：截面填充及流域分割得到分散的茧丝截面)；

图4为茧壳脱胶不同时间的冷冻切片结果图(a～h分别指脱胶3、5、10、15、20、30、45、60min)；

图5为脱胶后茧丝的平均横截面积值随分析的茧丝数量的变化图；

图6为同一粒茧不同茧壳部位的测定结果；

图7为苏秀和871两种品系蚕茧的茧丝横截面积(细度)的频率分布图；

图8为茧丝平均横截面积(细度)与纤度数据的相关性分析结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的情况下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

按照以下方法测定茧丝的平均横截面积即平均茧丝细度：

1、茧丝横截面显微图像采集

茧壳脱胶：取一粒未脱胶的茧壳(如图1中a所示)，根据茧壳大小切取其中面积为0.5～1.5cm²的一小块(如图1中b所示)，置于95～100℃的质量分数为0.5％的碳酸钠溶液中进行脱胶，脱胶过程中不断用玻璃棒搅拌样品，脱胶完成后用40℃的去离子水反复洗涤3次；将茧丝放置在温度为20(±2)℃、相对湿度为65(±5)％的标准温湿度环境中，平衡24h以上后得到脱胶后的样品(如图1中c所示)。

(2)冷冻切片：取步骤(1)中得到的一小束约5mm长的脱胶茧丝，尽量使每根纤维平行排列粘在中央有小孔的纸片上，然后将纸片固定于模具上，倒入樱花包埋剂(otc)，置于-20℃条件下使包埋剂凝固约20分钟，待包埋剂完全凝固后取出样品，用冷冻切片机切片，切片温度为-20℃，得到的切片厚度为2μm。切片时要保持用力均匀，尽量减少刀痕，由于树脂硬度较大，对刀片磨损严重，应及时调整刀口位置，保证切片的质量。

(3)显微镜观察采集图像：将步骤(2)中得到的切片置于单晶硅片上，用扫描电镜观察切片后的茧丝截面性状，放大3000倍以后的茧丝截面如图2所示，说明通过冷冻切片的方法能够得到完整清晰的茧丝截面，其挤压变形小。

为提高检测效率，将切片用olympusdp80显微镜放大20倍后采集印有标尺的茧丝横截面图像，得到的图片如图3中a所示，放大20倍以后的图像能清晰看到每段茧丝的截面边缘，可用于测定面积，且每张图像约包括100个横截面。

2、图像处理统计茧丝平均横截面积

用imagej软件将由olympusdp80显微镜所拍得的彩色图像处理成8位数的灰度图像，以便于后续的图像处理。图片中能清晰的看到茧丝纤维的横截面边缘，且各茧丝纤维对象分布较为离散，挤压变形小，截面之间的粘连少，能够满足图像分析的要求(如图3中a所示)。图片中各截面大小不一，这是因为在一粒茧壳中，茧丝的粗细不均，总的来说，茧丝的细度是从茧壳外层到中层逐渐变粗，由中层到内层逐渐变细，所以切片得到的茧丝横截面大小不一。由于包埋时某些茧丝可能没有拉直，或者刀片可能损伤茧丝使其边缘破裂，此时无法得到类似于钝三角形的茧丝截面图像，而是一些有明显厚度的无规则图形，如图3中a的横截面1和2。由于拍照时图片大小的限制，会在图片边界处有部分不完整的截面，如横截面3和4。因此，有必要对图像进行一定的处理：

(1)阀值分割：采用阀值分割方法来实现茧丝显微图像的二值分割。图3中a经过阀值分割后的二值图像如图3中b所示，可以看出，绝大部分背景被去除，而需要的对象部分—茧丝截面的边界被很好的保留。但是一般情况下，仅经过这一步操作得到的二值图像中的目标和背景，对应于原始灰度图像中的目标和背景并非完全正确。例如许多噪声点(如图3中a的图像5和6)被误当作了目标，所以还需进行图像后处理；

(2)分割后处理：经过阀值分割得到的二值图像中存在一些不完整或不准确的截面，也有一些噪声点被当作了目标，因此需通过手动去除这些不理想或不正确的目标，只留下完整准确的茧丝截面(如图3中c所示)；

(3)孔洞填充和流域分割：利用imagej软件通过统计像素值计算面积的功能，将分割后处理的二值图像进行孔洞填充，使每个茧丝横截面由边缘图像变成实心图像。但由于部分截面之间有粘连，因此采用流域分割将粘连的两个或多个横截面分割开(如图3中d所示)。经处理后的图像，目标分割正确，背景噪声去除干净，茧丝纤维的边界具有很好的连续性，且每个试样片中的有效纤维根数多。这表明这种图像分割方法是有效的，能用于计算茧丝的横截面积；

(4)测量横截面积即为茧丝细度：将纤维图像中的标尺值转化为imagej软件中的像素值后，一键测量整张图片中的各个横截面的面积，然后将结果导出到excel表，用于计算横截面积的平均值。

实施例2

研究不同的脱胶时间对得到的显微镜图片的影响：

按照实施例1中的处理方法，将一粒茧壳平均切成12个小块，每次取其中一小块放入浴比为1：50，质量分数为0.5％碳酸钠溶液中脱胶，脱胶温度为95℃左右，分别脱胶3、5、10、15、20、30、45、60min，脱胶茧丝放置在温度(20±2)℃，相对湿度(65±5)％的标准温湿度环境中，平衡24h后用冷冻切片机切片，切片厚度为2μm。然后用显微镜观察，放大20倍后拍照保存图片，结果如图4所示，其中a～h分别为脱胶3、5、10、15、20、30、45、60min后得到的图片，从中可以看出脱胶5min时，绝大部分由丝胶粘结在一起的两根丝素经脱胶后已成为分散开的两根丝素(每根丝素上可能有部分残留丝胶)，综合考虑茧壳厚度、时间以及脱胶程度，最终选择将茧壳脱胶5min用于后续实验。

实施例3

研究平均横截面积随分析截面数的变化：

按照实施例1中的处理方法，茧壳脱胶5min后统计50、100、150……1150个截面积的平均面积，图5显示了平均横截面积随着分析的截面数量(n)变化的情况。从图5中可以看出，在分析的截面数量较小的情况下，得到的平均横截面积的值波动较大；当分析的截面数量超过300个统计数目后，其得到的平均横截面积的值的波动范围很小(±0.3)。因此，要获得准确可信的结果，最好采用分析的截面数量≥300。

实施例4

研究茧壳中取样部位对平均横截面积结果的影响：

将一粒茧壳平均切成12个小块，任取其中不同的三块(a、b和c)用实施例1中的方法条件进行冷冻切片，统计各小块茧壳实验所得的平均横截面积，其结果如图6所示。从图6中可以看出，对茧壳进行平均切割后，取样部位对平均横截面积的结果无显著影响。

实施例5

研究分析茧丝纤度与茧丝横截面积的相关性：

从家蚕基因组生物学国家重点实验室基因资源库选取六个纤度不同的品系，分别为苏秀(sx)、932、芙蓉(fr)、皓月(hy)、871和夏芳(xf)，分别测定各品系的纤度和平均横截面积。

(1)纤度检验样丝缫制：用一粒缫的方法测定这六个品系的纤度，每个品系雌雄分开缫丝，各品系雌或雄缫丝有效数据为6～17个，结果如表1所示。

表1一粒缫的方法测定得到的各品系蚕茧的纤度

(2)不同品系蚕茧冷冻切片：按照实施例1、2、3、4的方法进行冷冻切片并统计各品系茧丝的平均横截面积，各品系有效数据为6个，结果如表2所示。图7是苏秀和871两个品系的蚕茧冷冻切片后横截面积的频率分布图，从图中可看出茧丝的横截面积大小不一，这与一粒茧壳中茧丝的粗细不均这一特性相符合，说明了这种切片方法能统计到茧壳的不同部位，结果可靠。

表2各品系蚕茧的平均横截面积

(3)纤度与平均横截面积的相关性分析：通过联合分析这六个品系的纤度数据与平均横截面积，结果如图8，表明平均横截面积值与茧丝纤度值呈直线相关，且平均横截面积值(y)与纤度值(x)的换算式为y＝61.15*x+3.868，其中相关系数r为0.9746，决定系数r平方值为0.9498，p值为0.0010。平均横截面积与纤度值两者间呈高度正相关，因此可通过测定茧丝的平均横截面积(平均细度)来计算茧丝的纤度值。

表3通过本发明的方法测定得到的各品系蚕茧的纤度

通过表1和表3中不同方法测试得到的各品系蚕茧的纤度对比可以看出，本发明的方法测试得到的纤度值与一粒缫得到的纤度值差别很小，能满足区分粗纤度与细纤度茧丝的需求。本发明通过在茧壳中切取面积约为1cm²的样品，依次进行脱胶、平衡、包埋处理后进行冷冻切片，然后用imagej软件计算经过显微镜放大的茧丝的横截面积即为茧丝细度，本发明的测量方法是在不必缫丝、不影响蛹体健康的基础上高效、准确、直接测定茧丝细度的方法；用imagej软件自动计算每张切片中的众多茧丝横截面的面积，可以排除人为选择截面的误差。并且本发明测量得到的茧丝细度可以应用于计算茧丝的纤度，计算公式为：y＝61.15*x+3.868，其中y为通过本发明测量得到的茧丝细度，单位为μm²；x茧丝纤度，单位为d。

该方法对于蚕遗传育种以及解析丝细度的遗传规律极为重要，且因对茧样的形态和质量没有特殊要求，可以检测平板茧、薄头茧、茧片以及由于融茧酶或其它因素遭到破坏的不完整茧壳的茧丝细度，适用更广。由于使用的仪器较为常见，测试方法简便，也能用于其他纤维的细度测定。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。