细胞流动检测方法与流程

本发明涉及生物领域，特别涉及细胞计数中细胞流动检测方法及装置。
背景技术：
：在细胞培养功能工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别、细胞计数等。传统方法是利用计数板进行人工计数，计数的过程中数计数池的细胞需要比较长的时间，且不同人员的平行检测偏差较大。细胞计数仪是一种对细胞进行分析和统计的仪器，减少了人工操作的繁冗步骤，可以自动保存所有检测结果，确保数据的客观真实性，并可以进行后期数据分析和处理。市场上各种自动细胞计数的设备越来越多。常见的主要分为两类：基于图像的细胞计数仪和基于库尔特电阻抗原理的细胞计数仪。库尔特电阻抗原理根据细胞通过小孔引起电位变化来计算细胞个数，因此其不能区分大小相近的细胞，而图像原理通过扫描仪器视野内图像，依靠设定的上下限细胞大小来进行图像识别，有效解决了大小相近细胞不能识别的问题。但，该类分析技术仍具有不足，如：1.若需要准确的分析细胞，首先要确定耗材卡吸取了细胞悬浮液。若细胞样板卡未成功吸入细胞悬浮液、悬浮液中无细胞或者悬浮液未充满整个成像区域，会影响计数结果。2.由于没有在样板卡吸取细胞悬浮液过程中没有检测控制方法，使得计数系统缺乏重复性。技术实现要素：为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种提高计数精度及重复性的细胞流动检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种细胞流动检测方法，所述细胞流动检测方法包括步骤：(a1)光源为流通池提供照明；(a2)检测单元获得所述流通池的进样图像i1(x,y)；(a3)进样图像预处理，获得图像i(x,y)＝i1(x,y)-i0(x,y)，i0(x,y)为背景；(a4)分割图像i(x,y)，获得多个检测区，至少部分检测区远离图像i(x,y)的中心区域；(a5)获得所述检测区的每一行或每一列数组中的峰值，所述峰值超过灰度阈值；(a6)利用分类算法和分类阈值处理所述峰值，获得所述流通池的进样状态，所述进样状态包括空白样、水样和细胞样。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明申请的核心在于：有效解决了现有细胞计数仪悬浮液中无细胞或者悬浮液未充满整个成像区域影响计数结果的技术障碍，发挥了细胞计数仪和细胞流动检测的技术优势，取得了明显的优势：1.计数精度高；扣除背景，消除本身灰尘、指纹原有因素的干扰，提高了细胞技术精度；通过设定检测区的图像的判断来识别是否是空白样品板、是否进了细胞样品、是否进了非颗粒或细胞的水样；2.重复性高；确定了分类阈值，建立了进样状态的标准：先利用图像识别和所述标准确定是否进入细胞样状态，如果进入细胞进样状态，再进行细胞计数，提高了重复性。附图说明参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：图1是根据本发明实施例的细胞流动检测方法的流程图；图2是根据本发明实施例的检测区划分图；图3是根据本发明实施例的图像信息一维图像信息；图4是根据本发明实施例的空白样品板示意图；图5是根据本发明实施例的水样样品板示意图；图6是根据本发明实施例的细胞样品板示意图。具体实施方式图1-6和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。实施例1：图1示意性地给出了本发明实施例1的细胞流动检测方法的流程图，如图1所示，所述细胞流动检测方法包括以下步骤：(a1)光源为流通池提供照明；(a2)检测单元获得所述流通池的进样图像i1(x,y)；按照光行进方向，光源、流通池、滤光器、透镜组和检测单元依次设置，所述流通池的上端和下端分别具有开口，适于细胞的流过；(a3)进样图像预处理，获得图像i(x,y)＝i1(x,y)-i0(x,y)，i0(x,y)为背景，也即在进样前后，灰尘等附着在流通池或透镜组上，流通池或透镜组上还可能存在指纹，这些均需作为背景扣除，具体扣除方式是本领域现有技术；(a4)分割图像i(x,y)，获得多个检测区，至少部分检测区远离图像i(x,y)的中心区域，如多个图像的边缘区，角落，如图2所示；(a5)获得所述检测区的每一行或每一列数组中的峰值，所述峰值超过灰度阈值，如灰度值的倍数；(a6)利用分类算法和分类阈值处理所述峰值，获得所述流通池的进样状态，所述进样状态包括空白样、水样和细胞样。为了准确地确定进样状态，需要建立统一的分类标准，进一步地所述分类阈值的获取方式为：(b1)光源为流通池提供照明；(b2)检测单元获得所述流通池的实验进样图像i1(x,y)；(b3)实验进样图像预处理，获得实验图像i(x,y)＝i1(x,y)-i0(x,y)，i0(x,y)为背景，也即在进样前后，灰尘等附着在流通池或透镜组上，流通池或透镜组上还可能存在指纹，这些均需作为背景扣除，具体扣除方式是本领域现有技术；(b4)分割实验图像i(x,y)，获得多个检测区，至少部分检测区远离实验图像i(x,y)的中心区域；(b5)获得检测区的每一行或每一列数组中的峰值，峰值超过灰度阈值；每一行或每一列数组的图，如图3所示；(b6)利用峰值和svm算法确定超线段，令超线段为：其中ω1＝ω2＝1；利用拉格朗日乘法或凸优化得出b1、b2的最优解，从而获得分类阈值|b1|、|b2|，拉格朗日乘法和凸优化是现有算法。为了进一步地提高检测准确度，超线段的确定具有学习模式和非学习模式。实施例2：根据发明实施例1的细胞流动检测方法在细胞计数中的应用例。本应用例中，细胞流动检测方法的步骤为：获得分类阈值，具体方式为：(b1)光源为流通池提供照明；(b2)检测单元获得所述流通池的实验进样图像i1(x,y)；(b3)实验进样图像预处理，获得实验图像i(x,y)＝i1(x,y)-i0(x,y)，i0(x,y)为背景，背景包括指纹、灰尘等；(b4)分割实验图像i(x,y)，获得4个检测区10，4个检测区均远离实验图像i(x,y)的中心区域，处于图像的四个角落，如图2所示；(b5)获得检测区的每一行或每一列数组中的峰值，峰值超过5个灰度值；每一行或每一列数组的图，如图3所示；如果峰高高于5个灰度值，认为一次峰检测事件成立，计算得到每一个检测区的所有峰事件，表格1表示空白样峰事件实验数据，表格2表示水样峰事件实验数据，表格3表示细胞样峰事件实验数据：表格1空白样左上角右上角左下角右下角pic125735.2526353.9425898.2224679.65pic225767.5826384.9625924.2524702.84pic325763.826378.4525947.3324723.81pic425778.9626395.8425959.2924733.63pic525782.4326402.6425968.6824744.22pic625788.5726407.8325960.7824738.32pic725797.1626416.625966.6424744pic825753.6326371.8125906.724684.93pic925701.6226320.9225863.2324645.27pic1025745.3526364.9225922.0424700.09pic1125768.9526389.3925934.9724713.94pic1225844.5126466.8526026.2824797.37pic1325915.3326538.2626081.0824853.8pic1425886.226510.1126059.7924834.61pic1525901.8226523.6626044.4824819.26pic1625885.3726507.4326035.5724811.1pic1725907.5926532.3226056.8424832.22pic1825887.0426510.9526048.5524823.98pic1925827.0226450.3625994.7724772.41pic2025948.9326575.4926119.3824891.73pic2125696.826316.9425915.1524697.59pic2225852.0926479.326010.8124788.61pic2325833.1626457.425971.3324752.14pic2425865.5826493.5826004.0924785.64pic2525865.5826491.1126031.1124811.37pic2625867.5126492.5626029.324809.17pic2725866.926493.3726034.0724814.68pic2825882.9426510.2726037.5924815.35pic2925890.5626516.5126056.0624833.55pic3025895.0926520.9526033.0424811.56pic3125867.9926494.2226000.9424782.66pic3226962.8927615.6328270.6826947.1max：28270.68表格2水样左上角右上角左下角右下角pic127503.5228943.0927105.5326809.86pic227486.7128922.5527084.826787.25pic327465.4728901.2427086.6926787.78pic427454.2328888.7327076.1826777.53pic527423.6628859.3327053.5726754pic627451.6928889.0727061.0626763.23pic727458.3428898.0227079.1726780.55pic827451.428890.2527041.4226745.85pic927462.728904.9827064.1126769.53pic1027517.528962.5127120.4626825.93pic1127523.5728971.3327144.2726850.66pic1227598.7929052.3827223.9426927.33pic1327615.8729066.6527232.1726937.39pic1427628.1829081.8927246.5326949.4pic1527632.8129087.5627233.4826938.34pic1627625.8129079.9927223.2126928.01pic1727612.329067.2727198.2626904.87pic1827597.3829050.2727213.1526920.56pic1927599.1929053.9527211.7326917.87pic2027599.5629052.8727215.626920.52pic2128181.6530068.0633922.0827400.24pic2226587.9236955.526774.4525415.08pic2325654.5327424.425404.6724753.54pic2425539.227370.2925344.5424696.5pic2525477.0427309.5825344.9124668.6pic2625248.4127065.0325154.2624482.31pic2725224.4427037.7625121.9624455.16pic282523427048.0225116.1824450.21pic2925256.627073.3725139.4124472.64pic3025243.727058.9125092.1324419.18pic3125200.4127010.8225041.3824371.62pic3226379.2328268.4627275.2126553.19max：36955.5表格3新细胞左上角右上角左下角右下角pic124790.4125738.4725576.2525236.11pic224805.0825753.682558925247.09pic324781.6925731.9525597.5725255.14pic424757.7925707.625563.7925223.87pic524686.8625634.0525507.5625166.76pic624820.1725772.425602.8825263.87pic724728.1125677.582553425193.72pic824762.825714.4625524.0925184.44pic924786.0625740.7525577.1425236.83pic1024887.7725845.6425686.4925346.01pic1124872.325829.7825653.7125315.08pic1224834.5525789.5425668.6825327.08pic1324839.3625796.4925644.3125304.35pic1424935.9525896.8725747.7425407.17pic1524924.6725882.5825703.2525362.37pic1624963.6725923.5825759.1325420.67pic1724964.3825928.1925744.2425406.16pic1824838.8725798.6525658.0225318.04pic1924860.8625822.4125664.8625327.59pic2024917.4625880.3425709.9225372.81pic2125042.0626011.8425849.1125506.77pic2226235.7127516.8726570.5226398.34pic2332455.9733589.5436627.0138479.49pic2430933.331686.8731954.5132001.25pic2528807.6730873.2230216.9631173.46pic2628458.7229377.0329948.529485.72pic2728549.4329514.1530102.7829645.34pic2828653.0829663.6130211.4729790.82pic2928661.4429686.7430239.9329833.1pic3028663.6929704.6530218.6829820.75pic3128708.9629756.9130284.0929891.61pic3229897.2931000.1632944.6932536.03max：38479.49(b6)利用峰值和svm算法确定超线段，令超线段为：其中ω1＝ω2＝1；利用拉格朗日乘法或凸优化得出b1、b2的最优解，从而获得分类阈值|b1|＝285、|b2|＝370：即n＝285、n＝370为空白样、水样、细胞样的超线段划分阈值，因此：当n<285时，认是空白板到空白板的过程，为k1事件；当370>n>285时，认是空白板到非颗粒或非细胞的水样进样的过程，为k2事件；当n≥370时，认为是空白板到细胞样品进样的过程，为k3事件。然后，任何一个单独的设定检测区，在整个进样的过程中，都只能经历k1事件到k3事件的过程；任何一个其他的事件的组合，如k1事件到k2事件，k1事件到k3事件再到k2事件，k2事件到k3事件等，都认为进样过程无效。从而保证检测的准确性和有效性；正式检测过程，如图1所示，包括以下步骤：(a1)光源为流通池提供照明；(a2)检测单元获得所述流通池的进样图像i1(x,y)；按照光行进方向，光源、流通池、滤光器、透镜组和检测单元依次设置，所述流通池的上端和下端分别具有开口，适于细胞的流过；(a3)进样图像预处理，获得图像i(x,y)＝i1(x,y)-i0(x,y)，i0(x,y)为背景，也即在进样前后，灰尘等附着在流通池或透镜组上，流通池或透镜组上还可能存在指纹，这些均需作为背景扣除；(a4)分割图像i(x,y)，获得4个检测区10，4个检测区均远离图像i(x,y)的中心区域，处于图像的4个角落，如图2所示；(a5)获得所述检测区的每一行或每一列数组中的峰值，所述峰值超过5个灰度值；(a6)利用svm算法和分类阈值处理所述峰值，获得所述流通池的进样状态，所述进样状态包括空白样、水样和细胞样。结果表明，细胞流动检测效果完全满足要求，如图4所示，检测到空白板到空白板的过程；如图5所示，为空白板到非颗粒或非细胞的水样进样的过程；如图6所示，为白板到细胞样品进样的过程。当前第1页12