一种斑马鱼有氧运动能力测评方法

1.本发明属于运动能力测评技术领域，具体地说，涉及一种斑马鱼有氧运动能力测评方法。


背景技术：

2.有氧运动能力作为评价斑马鱼运动能力的方面之一，其测评方案的确定尤为重要。目前国内外尚无关于评价斑马鱼有氧运动能力方法的文章或者专利，斑马鱼作为经典的模式生物，被广泛应用于多个科研领域，其中包括体育学和运动医学领域。对斑马鱼进行运动的有关方面研究在国内属于前沿领域，因此构建斑马鱼有氧运动能力测评的方法体系至关重要。本发明经过反复实验，找到了一套较为完善的适合国内斑马鱼有氧运动能力的测评方法，能够为其他科研工作者测量斑马鱼有氧运动能力提供参考。


技术实现要素：

3.1、要解决的问题
4.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种斑马鱼有氧运动能力测评方法，具体来说，通过测量斑马鱼最大耗氧量(mo2max)、临界游泳速度(u
crit
)及血乳酸阈等指标，实现斑马鱼有氧运动能力的评价。
5.2、技术方案
6.一种斑马鱼有氧运动能力测评方法，其步骤包括：
7.(1)准备斑马鱼，并进行编号标记，测量斑马鱼的参数，随后禁食处理；
8.(2)将禁食处理后的斑马鱼转移至呼吸仪的泳道内，并进行适应性训练；
9.(3)设置呼吸仪的泳道的自动三阶段模式：冲水模式、等待模式及测量模式；
10.(4)接着逐渐增加呼吸仪的泳道内水的流速，直至斑马鱼达到力竭状态，并记录实时耗氧量数据以及终止时的最大游泳速度，求得斑马鱼的最大耗氧量和临界游泳速度；
11.(5)根据斑马鱼的临界游泳速度设置梯度运动强度节点，在每个运动强度节点运动后，通过微量取血进行血乳酸的检测，求得斑马鱼的血乳酸阈。
12.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(1)中斑马鱼放置到独立的鱼缸内；
13.步骤(1)中斑马鱼参数包括体长和体重；
14.步骤(1)中禁食处理的时间为24h。
15.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(2)中适应性训练为斑马鱼以0.8bl/s的速度适应2h。
16.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(3)中冲水模式的时间为90s；
17.步骤(3)中等待模式的时间为30s；
18.步骤(3)中测量模式的时间为5min。
19.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(4)中呼吸仪的泳道内水的流速增加模式为每14min递增2.7bl/s；
20.步骤(4)中斑马鱼的力竭状态的评判标准为斑马鱼停在泳道尾部20s以上；
21.步骤(4)中临界游泳速度的计算公式为
22.u
crit
＝u+(t/δt)*δu；
23.其中u为实验鱼在测试中所达到的最大游泳速度(cm/s)；其中δu为速度增量(2.7bl/s)；其中δt为时间间隔(14min)；其中t为在最大速度下坚持的时间(min)。
24.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(1)中测量体长和体重前的处理方法如下，将斑马鱼放入麻醉剂中进行麻醉，捞出后放在湿润的毛巾上，用游标卡尺测量体长，测量部位为斑马鱼的头部至其尾前，擦干水后放进电子天平内称量体重，记录数值。
25.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，所述的麻醉剂的质量浓度为40mg/l，其制作步骤为将1000ml的水中加入0.04g三卡因，将其混匀。
26.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(5)中梯度运动强度节点为临界游泳速度的0％、20％、40％、60％、80％、100％；
27.步骤(5)中每个运动强度节点运动为5min。
28.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(5)中微量取血的方法为用微量采血针从斑马鱼的背动脉或后主静脉部取血。
29.上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(5)中斑马鱼的血乳酸阈通过绘制血乳酸随运动强度改变的递增曲线得出。
30.3、有益效果
31.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
32.综上所述，本发明首次将最大耗氧量、临界游泳速度及血乳酸阈作为斑马鱼有氧运动能力的检测指标，为测量斑马鱼有氧运动能力提供较为统一的测量标准，经检测方法科学合理。本发明所选用的模式生物斑马鱼，具有活体动物有氧运动验证的优势，有助于提高实验效率和降低实验成本。
附图说明
33.图1为斑马鱼血管解剖图；图中左侧为斑马鱼的全观图，图中右侧为斑马鱼的横截面；
34.图2为斑马鱼取血动作图；
35.图3为斑马鱼取血后使用德国ekf公司的微量血乳酸检测仪进行的检测图；
36.图4为实施例1测得出斑马鱼耗氧量mo2图；
37.图5为实施例1测得出斑马鱼乳酸阈值图；
38.图6为实施例1人类血乳酸浓度与相对运动强度关系趋势图；其中图6来源于如下文献(王瑞元，苏全生.运动生理学[m].人民体育出版社:北京,2012:321)；
[0039]
图7为改良方案1测得出斑马鱼耗氧量mo2图；
[0040]
图8为改良方案1鱼类耗氧率与游泳速度关系图；其中图8来源于如下文献(郝文超,王从锋,刘慧杰等.不同运动模式下鲢幼鱼游泳特性研究[j].淡水渔业,2018,48(2):3
‑
9.)；
[0041]
图9为改良方案2测得出3月龄斑马鱼耗氧量mo2图；
[0042]
图10为改良方案2测得出23月龄斑马鱼耗氧量mo2图；
[0043]
图11为改良方案2测得出3月龄与23月龄斑马鱼耗氧量mo2图；
[0044]
图12为改良方案2测得出3月龄与23月龄斑马鱼最大耗氧量关系图；
[0045]
图13为改良方案2测得出3月龄与23月龄斑马鱼相对临界游泳速度关系图。
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0047]
实验动物：采用成年野生型斑马鱼，购自于国家斑马鱼资源中心。雌雄斑马鱼在照明12h黑暗12h、28℃的标准条件下分开饲养，定时定量喂以丰年虾。选取实验鱼时，取正常性成熟的雄性斑马鱼。注意：bl为斑马鱼的体长。注意：三卡因的cas登记号为886
‑
86
‑
2，其中文名为3
‑
乙氧酰基苯胺甲磺酸盐。
[0048]
在正式进行实施例1前，进行了如下的测试：
[0049]
(本发明中斑马鱼有氧运动能力的探索主要依靠国外文献中报导的关于鱼类临界游泳速度检测方案进行改良，探寻适合评价国内斑马鱼的有氧运动能力的方案。)
[0050]
测试方案1：该方案测量临界游泳速度与最大耗氧量，原本最大耗氧量的数值应上升，结果发现，最大耗氧量先升高后降低，所以该方案不适合。具体如下：(1)测试过斑马鱼的体长体重后，将斑马鱼放入泳道5cm/s的速度适应30min以消除胁胁迫感；(2)游泳隧道自动设置为在10min内完成三个阶段：flash时间为90s、wait时间为30s、measure时间为8min；(3)测试以每10min递增5cm/s开始，不断增加水流速度，速度增量(δu)始终为5cm/s，每次时间间隔(δt)为10min，直至实验鱼达到力竭状态，评判标准为实验鱼停在泳道尾部20s以上。
[0051]
测试方案2：继续查找文献，找到了方案二，该方案先测量临界游泳速度，根据临界游泳速度分成25％、50％、75％、100％的运动速度，测量运动20min的耗氧量，原方案中斑马鱼最大耗氧量数值上升，但经过我们实验测量发现，数值下降。具体如下：(1)挑选3个月大的雄性野生斑马鱼，在引入游泳隧道之前，用三卡因(40mg/l)将斑马鱼麻醉，并测量标准长度(bl，cm)和体重(bw，g)；(2)将单条斑马鱼放入斑马鱼游泳呼吸测量仪，测定的斑马鱼起始速度为5cms
‑1，随着每隔10min增加0.05ms
‑1的增量，直到斑马鱼疲劳，疲劳被确定为鱼无法再保持对流的位置，并被扫向隧道下游的筛网且无法在三秒钟内自行移动的时间；视觉观察确保在游泳试验期间没有出现不稳定的游泳行为或过早疲劳；根据以下公式计算u
crit
：
[0052]
u
crit
＝ui+[uii(ti/tii)]
[0053]
ui是整个层段保持的最高速度时，uii为速度增量(此处为0.05ms
‑1)，ti为从疲劳速度增量开始所需的时间，tii则为间隔时间(此处设置10min)；绝对值(ms
‑1)被转换成以标准体长每秒(bls
‑1)为单位的相对游泳速度；(3)从u
crit
实验中将鱼以0.05ms
‑1的速度在循环的水中游泳2h；第二天早晨进行呼吸测量；在5％u
crit
的最小流量下运动20min测定氧气消耗量，以测量rmr，常规代谢率，即随后随机测量了25％、50％、75％和100％u
crit
运动20min的氧气消耗量；以一种速度恒定20min后，将呼吸器重新连接到连续的水流中，使水充满空
气，并给斑马鱼30min进行恢复；随后，以不同的游泳速度重复测量vo2。
[0054]
测试方案3：通过新查找到的文献，测量了方案三，发现数值未达到理想值。在测量前先将实验鱼进行24h的禁食处理；将鱼放入泳道以0.8bl/s的速度适应1
‑
1.5h以消除转移过程和新环境对实验鱼的胁迫影响；测试以每20min递增2.7bl/s开始，不断增加水流速度，速度增量(δu)始终为2.7bl/s，每次时间间隔(δt)为20min。直至实验鱼达到力竭状态，评判标准为实验鱼停在泳道尾部20s以上；其中flash时间为4min、wait时间为1min、measure时间为5min；然后再进行无鱼空测，来检测水中微生物的氧耗量(单位：mg o
2 kg
‑1h
‑1)；
[0055]
公式为：smr＝sa
‑
sb
[0056]
其中sa为斑马鱼测得的氧耗量；sb为无斑马鱼空测的微生物氧耗量；
[0057]
测试方案4：在测试方案3的基础上，进行方案改进，该方案对同一批鱼进行了两次测量，以及空测，结果发现，空测的最大耗氧量数值与第一、二次数值相差不大，并且第二次较第一次运动能力有所下降。具体如下：(1)在测试前将鱼进行24h禁食处理，放入泳道0.8bl/s的速度适应2h以消除胁胁迫感；(2)游泳隧道自动设置为在10min内完成三个阶段：flash时间为4min、wait时间为1min、measure时间为5min；(3)测试以每20min递增2.7bl/s开始，不断增加水流速度，速度增量(δu)始终为2.7bl/s，每次时间间隔(δt)为20min，直至实验鱼达到力竭状态，评判标准为实验鱼停在泳道尾部20s以上；(4)以0.8bl/s的速度进行恢复，60min休息后进行第二次测量；(5)第二次测量后进行空测。(要求数据可用，可测几次)。
[0058]
实施例1
[0059]
通过测试方案4的结果发现，尽管总体结果有所偏差，但有些实验鱼的耗氧量随着运动强度的增加呈上升趋势，所以在它的基础上进行改进，对实验鱼进行方案五测试，发现其结果符合预期，最终确定了该方案。
[0060]
本实施例斑马鱼有氧运动能力测评方法，其步骤包括：
[0061]
(1)准备斑马鱼，并进行编号标记(例如带有编号的鱼缸)，测量斑马鱼的参数，随后禁食处理；
[0062]
(2)将禁食处理后的斑马鱼转移至呼吸仪的泳道内，并进行适应性训练；其中呼吸仪利用丹麦loligo system斑马鱼泳道呼吸系统；
[0063]
(3)设置呼吸仪的泳道的自动三阶段模式：冲水模式、等待模式及测量模式；
[0064]
(4)接着逐渐增加呼吸仪的泳道内水的流速，直至斑马鱼达到力竭状态，并记录实时耗氧量数据以及终止时的最大游泳速度，求得斑马鱼的最大耗氧量和临界游泳速度；
[0065]
(5)如图1、图2及图3所示，根据斑马鱼的临界游泳速度设置梯度运动强度节点，在每个运动强度节点运动后，通过微量取血进行血乳酸的检测，求得斑马鱼的血乳酸阈。
[0066]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(1)中斑马鱼放置到独立的鱼缸内；
[0067]
步骤(1)中斑马鱼参数包括体长和体重；
[0068]
步骤(1)中禁食处理的时间为24h。
[0069]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(2)中适应性训练为斑马鱼以0.8bl/s的速度适应2h。
[0070]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(3)中冲水模式的时间为
90s；
[0071]
步骤(3)中等待模式的时间为30s；
[0072]
步骤(3)中测量模式的时间为5min。
[0073]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(4)中呼吸仪的泳道内水的流速增加模式为每14min递增2.7bl/s；
[0074]
步骤(4)中斑马鱼的力竭状态的评判标准为斑马鱼停在泳道尾部20s以上；
[0075]
步骤(4)中临界游泳速度的计算公式为
[0076]
u
crit
＝u+(t/δt)*δu；
[0077]
其中u为实验鱼在测试中所达到的最大游泳速度(cm/s)；其中δu为速度增量(2.7bl/s)；其中δt为时间间隔(14min)；其中t为在最大速度下坚持的时间(min)。
[0078]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(1)中测量体长和体重前的处理方法如下，将斑马鱼放入麻醉剂中进行麻醉，捞出后放在湿润的毛巾上，用游标卡尺测量体长，测量部位为斑马鱼的头部至其尾前，擦干水后放进电子天平内称量体重，记录数值。
[0079]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，所述的麻醉剂的质量浓度为40mg/l，其制作步骤为将1000ml的水中加入0.04g三卡因，将其混匀。
[0080]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(5)中梯度运动强度节点为临界游泳速度的0％、20％、40％、60％、80％、100％；
[0081]
步骤(5)中每个运动强度节点运动为5min。
[0082]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(5)中微量取血的方法为用微量采血针从斑马鱼的背动脉或后主静脉部取血。需要注意的是，微量取血前将斑马鱼放入质量浓度为200mg/l的快速麻醉剂溶液(跟前述的麻醉剂的制备方法一致，麻醉剂质量增加5倍)中麻醉，接着取出斑马鱼放入湿润的毛巾上，采用自制简易取血针，扎入部位为背动脉或后主静脉部，最后采用德国ekf公司的微量血乳酸检测仪进行检测。
[0083]
上述所述的一种斑马鱼有氧运动能力测评方法中，步骤(5)中斑马鱼的血乳酸阈通过绘制血乳酸随运动强度改变的递增曲线得出。
[0084]
经检索，国内外暂无运用血乳酸来检测斑马鱼运动能力的具体方法相关文章和专利。人体在渐增负荷运动中，血乳酸浓度随运动负荷的渐增而增加，当运动强度达到某一负荷时，血乳酸浓度急剧上升的开始起点，称为乳酸阈。在国内外都没有描述关于鱼类血乳酸的测量方法，本实验对于斑马鱼的血乳酸测量方法进行了大量的试验，做出了关于鱼类的血乳酸曲线，对斑马鱼作为模式生物应用于运动医学领域的研究具有重大意义研究。斑马鱼采血方式的创新。斑马鱼体积较小，血量极少，且取血部位也极为难找，因此，在保证鱼体避免不可逆的创伤同时并可持续完成乳酸域实验方案的检测过程是该检测技术的关键难题。首先，为了实现微创采血，我们经过多次试验尝试，采用自制毛细血管针，用橡胶挂管套住针头，用压力将肝素钠(5mg/ml)浸润毛细血管针，达到抗凝作用，之后将针头插入经麻醉的斑马鱼后主静脉中，用压力将血液吸取出来，随后将取出来的血液放置于膜纸上，使用德国ekf公司的微量血乳酸检测仪进行检测，得到斑马鱼血乳酸数值。其次，为了实现运动乳酸阈各个运动强度节点的检测，我们经过多次实验确定了运动检测乳酸阈的检测方案。首先根据斑马鱼临界游泳速度的测量方案测得临界游泳速度u
crit
，并将斑马鱼的递增梯度划
分为0％、20％、40％、60％、80％、100％的u
crit
六个梯度的运动强度节点，在每个运动强度节点运动5min后，通过微量取血，用德国ekf公司的微量血乳酸检测仪进行检测，得出各运动强度节点血乳酸浓度值，如图4所示。斑马鱼血乳酸阈测量方法包括如下步骤：(1)先测量鱼的体长体重，并测得临界游泳速度u
crit
；(2)采用微量采血法测量鱼安静状态时的血乳酸值，将鱼放入麻醉剂溶液中麻醉，取出鱼放入湿润的毛巾上，采用自制简易取血针，扎入部位为背动脉或后主静脉，采用德国ekf公司的微量血乳酸检测仪进行检测，由于斑马鱼在首次采血后需要一定时间修复伤口，同时由于斑马鱼与人类不同，其个体含有的血量不足以完成连续六个检测点的采血，我们在每一次采血后将斑马鱼放置于含亚甲基蓝的e3水中恢复2天；(3)待鱼完成2天恢复期后，将鱼放入泳道中进行20％u
crit
运动强度节点的水流中运动5min后取出采用上述微量采血方法检测血乳酸并进行2天恢复；(4)随后依次完成40％、60％、80％、100％u
crit
运动强度节点的血乳酸检测；(5)绘制血乳酸随运动强度改变的递增曲线，得出血乳酸阈，如图5所示。
[0085]
此外，运用我们的检测方法测得的斑马鱼血乳酸结果和人类所测得的结果趋势(图6)，一致，试验中检测斑马鱼的乳酸阈在相对运动强度的80％u
crit
左右，意味着在相对运动强度的80％u
crit
以后，斑马鱼将进入高强度的无氧运动。以上结果表明本发明中斑马鱼乳酸阈的检测方法是科学有效的，运用本发明通过判断不同斑马鱼乳酸阈的拐点从而判定斑马鱼的运动能力，对于利用经典模式动物斑马鱼研究运动科学领域相关问题奠定了坚实基础。
[0086]
其他改良方案1：(1)在测试前将鱼进行24h禁食处理，放入泳道0.8bl/s的速度适应2h以消除胁胁迫感；(2)游泳隧道自动设置为在10min内完成三个阶段：冲水(flash)时间为4min、等待(wait)时间为1min、测量(measure)时间为5min；(3)测试以每20min递增2.7bl/s开始，不断增加水流速度，速度增量(δu)始终为2.7bl/s，每次时间间隔(δt)为20min，直至实验鱼达到力竭状态，评判标准为实验鱼停在泳道尾部20s以上；(4)以0.8bl/s的速度进行恢复，60min休息后进行第二次测量；(5)第二次测量后进行空测。结果显示，测试的斑马鱼耗氧量曲线(图7)与文献报导的普通鱼类的耗氧量曲线的趋势(图8)并不相符，同时测得的多条斑马鱼的耗氧量曲线基本都是先增大后减小，这种情况的出现显示此方案并不适于国内斑马鱼的耗氧量测量；查阅大量文献发现，尽管品系相同，但由于环境因素，国内的斑马鱼体长与体重均小于国外斑马鱼。所以为探究适合测评国内斑马鱼有氧运动能力的方案，经过反复测验，将原本测试的斑马鱼递增时间20min逐步缩减至14min。同时为减少体型较小的国内斑马鱼在冲水换氧过程中的水流影响，将试验方案1中冲水换氧的时间由4min缩短为90s，等待的时间由1min缩短为30s。
[0087]
其他改良方案2：(1)在测试前将鱼进行24h禁食处理，放入泳道0.8bl/s的速度适应2h以消除胁胁迫感；(2)游泳隧道自动设置为在7min内完成三个阶段：冲水(flash)时间为90s、等待(wait)时间为30s、测量(measure)时间为5min；(3)测试以每14min递增2.7bl/s开始，不断增加水流速度，速度增量(δu)始终为2.7bl/s，每次时间间隔(δt)为14min，直至实验鱼达到力竭状态，评判标准为实验鱼停在泳道尾部20s以上。如图9、图10、图11、图12及图13所示，结果显示：3月龄斑马鱼的耗氧量曲线和23月龄的耗氧量曲线符合鱼类的耗氧量曲线趋势，且3月龄斑马鱼的最大耗氧量与23月龄斑马鱼的最大耗氧量存在极显著性差异，3月龄斑马鱼的最大耗氧量高于23月龄最大耗氧量。3月龄斑马鱼的相对临界游泳速度
较23月龄斑马鱼高，统计分析具有显著差异性。说明斑马鱼随着年龄的增长，最大耗氧量逐渐降低，相对临界游泳速度逐渐降低，有氧运动能力逐渐降低。此结果符合有氧运动能力随年龄的增长而降低的发育规律，由此进一步证明用此方案测评斑马鱼有氧运动能力的科学性与可行性。
[0088]
综上所述，本发明首次将最大耗氧量、临界游泳速度及血乳酸阈作为斑马鱼有氧运动能力的检测指标，为测量斑马鱼有氧运动能力提供较为统一的测量标准，经检测方法科学合理。本发明所选用的模式生物斑马鱼，具有活体动物有氧运动验证的优势，有助于提高实验效率和降低实验成本。
[0089]
其他说明：
[0090]
1、斑马鱼的最大耗氧量测试结果曲线与人类最大摄氧量测试结果曲线不同，没有最大耗氧量平台的出现，判定鱼类的最大耗氧量只是仅仅以递增运动力竭时所测的氧量为最大耗氧量，但是在最新对于人类的测试最大摄氧量的研究中，递增负荷力竭时所测得的摄氧量认定为最大摄氧量并不准确。现阶段测试斑马鱼最大耗氧量最先进的基本上就是来自丹麦的斑马鱼泳道呼吸系统，只是测量运动过程中一个时期水中氧气的消耗量，无法测定水中二氧化碳的生成量，确定呼吸商。由于技术的限制，所以需要采用判定最大摄氧量的二级指标乳酸阈，以乳酸阈的指标反映最大摄氧量的值，最终精准判定斑马鱼的有氧运动能力的指标。
[0091]
2、评定斑马鱼的氧量运动能力是对没有经过运动训练的斑马鱼进行相应的指标测试，但是斑马鱼由于个体差异性问题，有点斑马鱼出现个体差异性较差的情况是正常的，在人的评定氧量运动能力的测试中，没有哪一种测试方案适应于所有人，斑马鱼也是一种，现阶段斑马鱼有氧运动强弱没有一个准确的参考值，存在年龄的问题个体差异的问题，所以评价斑马鱼有氧运动能力强弱的标志只有相对值没有绝对值，现阶段，以次级指标乳酸阈的指标反映最大摄氧量还需要进一步探索，但是运动方案所测试的乳酸阈值是没有问题的，斑马鱼静息状态下的乳酸阈值与人类静息状态下的乳酸阈值相当，测试的乳酸阈结果曲线也与人类的乳酸阈结果曲线一致，所以测试乳酸阈的运动方案可以使用。
[0092]
3、测量有氧运动能力的指标分为临界游泳速度，最大耗氧量和血乳酸，所以血乳酸和最大含氧量是平行关系的，也是评价有氧运动能力。
[0093]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0094]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术专利，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术专利也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。