用于产生校正图像的方法和设备与流程

1.本发明涉及根据独立权利要求的前序部分的用于产生校正图像的方法。此外，本发明涉及实行该方法的设备。


背景技术：

2.减少与系统相关的成像像差在许多成像方法中非常重要，特别是在显微术中。举例而言，这样的成像像差可能是由利用的光学元件在相应束路径中的影响以及由于利用的检测器的技术原因而产生的。此外，样品保持件，例如(盖)玻片、载玻片、(微)滴定板或培养皿的底部，可能会导致不是直接由待成像的物体(样品)引起的成像像差。
3.捕获的图像中的亮度差的校正(阴影；阴影校正)特别重要。举例而言，如果捕获多个图像片，这特别地有影响，该多个图像片被拼接在一起以形成整个图像。在该过程中，单独图像片彼此重叠特定面积(重叠区域；重叠)，使得可以基于其中包含的多次捕获的图像信息以位置准确度拼接图像片。如果图像片具有不同的亮度，则观看者将其感知为错误。
4.现有技术已经公开了多个用于校正亮度的方法。原理上，这些方法可以细分为两个类别：i)基于参考的方法，和ii)纯计算方法。
5.基于参考的方法是基于参考图像(也称为亮度校正图像，下面称为校正图像)，例如均匀样品的参考图像，这应该导致均匀信号。无论如何都会发生的成像像差被包含在参考图像中，因此可以借助于从其中减去参考图像来校正样品的捕获图像。已知有许多用于产生参考图像的过程(例如，de 10 2014 112 002 a1).
6.代替参考图像的纯计算方法使用样品的已捕获图像，其包含成像像差。basic工具(peng等人于2017年发表的)软件提供了这样的方法的一个示例。
7.下面旨在强调基于参考的校正方法。
8.例如，所谓的基于相机的亮度校正可以实现为整体校正。在该过程中，诸如载玻片的样品保持件例如被定位在束路径中，使得没有样品的区域被捕获。光学条件对应于样品捕获期间的光学条件。举例而言，所选区域包含与样品相同的盖玻片和嵌入介质。该区域的捕获图像随后可以用作参考图像。该过程特定于当前利用的物镜镜头，特别地用于透射光下的常规图像捕获。
9.例如，刚刚描述的校正可以在多色实验中对每个单独的通道实行，并且特别是找到在反射光荧光记录的校正下的应用。
10.可以以多种方式应用所描述的校正方法的修改。举例而言，可以捕获载玻片的无样品区域的多个图像片并且形成均值，例如以便消除图像中存在的样品污染或以便补偿图像片之间的方差。该过程可以以特定于通道的方式实现。
11.还可以捕获样品的多个图像片并从中确定参考图像。在这种情况下，假设的是，例如在形成均值的范围内图像结构被取消，并且仅保留关于亮度差的信息。该过程特别地应用于复杂化或复杂的荧光图像，并且需要许多图像片，通常多于200个片。这需要带有期望荧光团和样品的载玻片，该载玻片的尺寸允许捕获足够数量的图像片。在这种情况下，还可
以进行特定于通道的校正。
12.在另一变型中，聚焦在样品上，然后从束路径中移除载玻片。捕获“自由空间”的至少一个图像并且将其用作参考图像。
13.当校正荧光图像时会出现特殊的挑战，该荧光图像中要成像的样品由可激发荧光的分子(荧光团)标记。在这种情况下，应防止参考图像中的样品的固有结构在所述参考图像中体现。此外，如果可能的话，在产生参考图像期间应该不存在漂白，这可能导致在参考图像的创建与样品捕获之间的光学条件的偏差。


技术实现要素：

14.本发明基于提出用于产生参考图像的其他选项的目的，通过该选项减少现有技术的缺点。
15.该目的通过使用图像捕获的设备来产生校正图像的方法来实现。此外，本发明包括实行该方法的设备。在下文中还阐述了有利的发展例。
16.适合实行根据本发明的方法的设备包括带有检测器单元的检测束路径和用于生成控制命令的控制单元。在该方法的第一操作模式中，捕获样品室中存在的物体的多个图像片。在这种情况下，每个图像片被捕获为多个图像像素。因此，每个图像片由多个图像像素(图片元素)构成。此外，通过控制单元生成控制命令，从而捕获每个图像片使得它与至少一个其他捕获的图像片部分重叠在具有定义的最小尺寸的图像片重叠区域(重叠)中。通过拼接图像片产生合成图像或整体图像。在此，重叠区域的多次捕获的图像像素的图像数据用于将图像片布置在正确的位置处并且使图像片相对于彼此以正确的取向布置。捕获的图像片和/或合成图像通过亮度校正图像进行校正，其中图像片和/或合成图像的每个图像像素通过计算与来自亮度校正图像的对应像素的图像数据组合。
17.根据本发明的方法的特征在于，在第二操作模式中，通过在各个情况下将物体的多个图像捕获为多个图像像素来产生参考图像作为亮度校正图像，其中通过控制单元生成控制命令，使得物体相对于检测束路径移动，并且在该过程中，校正图像重叠区域的尺寸大于图像片重叠区域的最小尺寸。
18.可以通过可调节的样品台和/或通过枢转或位移检测束路径带来在物体与检测束路径之间的相对运动。有利地通过马达带来相对运动。
19.本发明至少出于创建亮度校正图像的目的利用了与图像片重叠区域的最小尺寸的偏离。以这种方式，与维持最小尺寸的情况相比，可以捕获样品的显著更多数量的不同图像片。
20.经常应用的重叠区域的最小尺寸是图像片在一个图像方向上的范围的10％。因此，方法的有利改进在于控制命令用于控制驱动单元，通过所述驱动单元可移动物体，并且校正图像重叠区域在一个图像方向上的尺寸被选择为大于图像在所述图像方向上的范围的10％。校正图像重叠区域可以是例如在一个图像方向上的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
21.为了获得实际使用的亮度校正图像的足够质量，可以分析当前可用的亮度校正图像，并且可以根据预先定义的质量准则进行评估。如果不满足质量准则，则可以通过计算将当前可用的亮度校正图像与物体的其他图像组合。可选地，可以重复该步骤，直到已经满足
质量准则。亮度校正图像的方差是一个可能的质量准则。目的是产生低方差的亮度校正图像，其中因此存在亮度强度值的均匀分布。
22.在这种情况下，基于质量准则的评估结果在各个情况下选择校正图像重叠区域的尺寸是有利的。以这种方式，可以产生很可能导致满足质量准则的其他亮度校正图像。
23.原理上，本发明可以用于利用对比度的任何显微术方法。因此，可以选择样品保持件作为物体，例如以减少与系统相关的成像像差。该方法可以特别有利地用于荧光显微术。在这种情况下，选择具有发射待捕获检测辐射的分子(例如荧光团)的样品作为物体。
24.图像片之间的相对位移可以增量地产生，例如通过适当地控制样品台的驱动。在该方法的进一步改进中，在物体和/或样品台连续移动时，用于产生亮度校正图像的图像还可以通过物体的时间受限的照明来捕获。在此可以在频闪照明的范围内实现时间受限的照明。
25.替代地，为了捕获图像，将物体移动特定路径长度到通过控制命令指定的位置并且停止在那里。在已经到达的该当前位置处，捕获用于产生亮度校正图像的其他图像。
26.用于实行根据本发明的方法的设备用于捕获样品室中的可调节样品台上存在的物体的图像，并且包括检测束路径、检测器单元和用于生成控制命令的控制单元。控制单元被配置为生成控制命令。控制命令可以用于执行第一操作模式和第二操作模式。
27.在第一操作模式中，检测单元和样品台通过控制命令来控制，以捕获物体的多个图像片，其中，在已经捕获图像片之后，将物体相对于检测束路径的光轴移动限定的路径长度，该限定的路径长度小于捕获的图像片在移动方向上的范围，使得每个片图像与至少一个其他捕获的片图像部分地重叠在定义的最小尺寸的片图像重叠区域中。
28.在第二操作模式中，样品台通过控制命令来控制，以在已经捕获图像片之后，将物体相对于检测束路径的光轴移动路径长度，该路径长度小于第一操作模式的限定的路径长度，使得校正图像重叠区域的最小尺寸大于图像片重叠区域的最小尺寸。
29.在其他实施例中，存在频闪照明，其同样是通过控制单元可控制的。
30.因此，该方法还可用于生成校正图像。在这种情况下，捕获物体的多个图像片，其中每个图像片被捕获作为多个图像像素，并且每个图像片与至少一个其他捕获的图像片重叠在定义的最小尺寸的图像片重叠区域中。通过拼接图像片来产生合成图像，其中重叠区域的多次捕获的图像像素的图像数据用于将片图像布置在正确的位置并且使片图像相对于彼此以正确的取向布置。每个捕获的图像片和/或合成图像通过亮度校正图像进行校正，其中图像片和/或合成图像的每个图像像素通过计算与来自亮度校正图像的对应像素的图像数据组合。这种方法的特征在于，亮度校正图像通过将物体的多个图像在各个情况下捕获为多个图像像素来产生，其中校正图像重叠区域的最小尺寸被选择为大于图像片重叠区域的最小尺寸。
31.本发明可以潜在地用于所有基于对比度的显微术方法，其中其特别地适用于荧光显微术和亮场显微术，特别是在透射光亮场中。
附图说明
32.下面基于附图更详细地解释本发明。附图中：
33.图1示出了根据现有技术的产生亮度校正图像的示意性示例；
34.图2示出了根据本发明的方法的改进的示意性表示；以及
35.图3示出了根据本发明的设备的示例性实施例的示意性表示。
具体实施方式
36.现有技术中已知的用于产生亮度校正图像kb(也简称为校正图像kb)的方法在图1中高度示意性地示出。捕获多个(校正)图像块tb1、tb2到tbn，通过应用可选地选择的不同数学方法(由特征序列表征：∑
37./n)、例如求平均，来组合图像片的各个像素，并且这用于创建校正图像kb。显而易见的是，与例如第一图像片tb1的情况相比，校正图像kb的亮度强度值的方差更小且呈现得更均匀。
38.图2图示了根据本发明的方法的改进。已经从多个图像片(未示出)拼接且图示样品2的合成图像rb仅出于解释性原因而示出。以示例的方式示出了第一个至第n个图像片tb1至tbn，它们以它们范围中在所示的情况下在水平图像方向上的一个范围彼此重叠。在此过程中出现的校正图像重叠区域ov(重叠)以示例的方式示出。校正图像重叠区域ov被选择为比出于产生结果图像rb而对样品2进行成像的情况更大，特别是大10％。校正图像kb通过数学方法从彼此部分重叠的图像片tb1至tbn产生。在这种情况下，每个校正图像片tb1至tbn的相应方差例如具有从18到80范围的值，而生成的校正图像kb的方差例如仅为3。
39.图3示意性地图示了用于实行根据本发明的方法的设备的示例性实施例。样品2可以布置在可控可调节样品台1上。所述样品通过光源3照明。从样品2发出的检测辐射(例如荧光辐射和/或照明辐射的反射分量)通过物镜镜头4捕获并且沿光轴(由间断线表示)成像在空间分辨检测器5上，例如ccd、cmos或scmos芯片、spad(单光子雪崩二极管)阵列或者多个pmt(光电倍增管)的阵列上。通过检测器5捕获的图像数据被发送到评估单元8并且在那里通过计算组合以形成合成图像rb或校正图像kb。
40.在设备的替代实施例中，照明可以利用透射光来实现，也就是说，例如在亮场中，通过适当定位的光源3(以示例性和可选方式使用间断线示出)来实现。
41.此外，存在控制单元6，其例如可以是计算机或fpga的形式并且被配置为生成控制命令。生成控制命令使得执行或可以执行上述两种操作模式。控制单元6在各个情况下以适合于数据传输的方式连接到样品台1的马达驱动运动的驱动单元7、检测器5和光源3。
42.评估单元8可以可选地连接到控制单元6，例如以促进基于所捕获的图像数据或基于选择的质量准则的满足程度来适应在那里生成的控制命令。
43.附图标记列表
44.1样品台
45.2 样品、物体
46.3 光源
47.4 物镜镜头
48.5 检测器
49.6 控制单元
50.7 驱动单元
51.8 评估单元
52.tb1,...,tbn第一个图像片、...、第n个图像片
53.ov(校正图像)重叠区域
54.rb合成图像/整体图像
55.kb亮度校正图像