进行训 练，以提供全体参数集一血管周参数集、桥样联结参数集、小叶纤维化参数集。
[0165] 这些全体参数集一血管周参数集、桥样联结参数集、小叶纤维化参数集共同从步 骤210输出，作为代表训练模型的参数集。
[0166]步骤110
[0167] 在这一例子中，基于在步骤108中对试验肝组织样本及其上述提及的在步骤210 中获取的相应训练模型获取的PC生成代表每个试验肝组织样本中纤维化程度的统计数 据。这些统计数据包括肝组织样本处于特定纤维化分期的概率、血管周指标、桥样联结指 标、小叶纤维化指标和qFibrosis指标。
[0168] 图15示出了步骤1502-1508,以在这一例子中获取qFibrosis指标。特别地，在 步骤1502中，首先使用全体参数集通过将所有的PC输入到多项逻辑回归模型中预测一系 列概率值仏。每个概率值 Pi表明试验肝组织样本处于特定纤维化分期i的概率。然后使 用上述方程（1)和子步骤1502的概率值Pi获取qFibrosis指标。更具体地，在步骤1504 中，将每个概率值 Pl首先与期望值E i (设定为i)相乘以获取乘积。在步骤1506中，随后将 在步骤1504中获取的乘积加和以获取E pjEi，随后在步骤1508中，通过a = 1/4归一化 这一加和E pjEi以产生qFibrosis指标。产生的qFibrosis指标为从0到1范围内的连 续变量。
[0169] 以与上述获得qFibrosis指标相似的方式获取血管周指标、桥样联结指标、小叶 纤维化指标。然而，为获取血管周指标，在步骤1502中只输入血管周PC，并且多项逻辑回归 模型使用血管周参数集而不是全体参数集。为获取桥样联结指标，在步骤1502中只输入桥 样联结PC，并且多项逻辑回归模型使用桥样联结参数集。为获取小叶纤维化指标，在步骤 1502中只输入小叶纤维化PC，并且多项逻辑回归模型使用小叶纤维化参数集。
[0170]图16(a)_(c)分别示出了这一例子中为所有采集的图像获取的血管周指标、桥 样联结指标、小叶纤维化指标。以这些指标对与从中获取指标的图像有关的纤维化分期 (Metabir评分）进行绘图。如图16 (a)-(c)所示，血管周指标在纤维化分期1和分期2之 间改变最大，而桥样联结指标在纤维化分期2和分期3之间改变最大。这与血管周扩张出 现在桥样联结胶原蛋白形成之前并且在纤维化进展中扩张的组织-病理学知识相一致。
[0171] 方法100的示例件实施的可替代方案
[0172] 在由权利要求所限定的本发明的保护范围内，上述方法100的示例性实施的多种 变型都是可能的。下文给出一些这种变型的例子。
[0173] 例如，方法100可以在人活检肝组织样本或其他类型的动物肝组织样本上以同样 的方式进行实施。根据方法100的改变，对本领域技术人员显然的是，方法100还可以用于 评估除肝外的其他组织的纤维化。例如，上述示例性实施可以用于评估诸如慢性肾小球肾 炎等的器官系统的纤维化。
[0174] 而且，不使用用于在步骤102和202中识别胶原蛋白区域和内腔区域的像素的强 度值，可以使用与像素有关的颜色值、纹理值或任何其他值。可以根据成像过程中所使用的 造影剂选择待用值的类型。
[0175] 此外，在步骤704中，可以以不同方式计算截断距离。例如，截断距离可以设置为 胶原蛋白减少至最大胶原蛋白百分比的不同比例处的距离。这一不同比例可以是40%到 60%之间的百分比。此外，在步骤708中，方向轮廓可以包括任意数量方向的方向百分比。 以手动识别的桥样联结胶原蛋白作为参照，使用多个R0I可以调整方向的数量以及各方向 之间的间隔（可以不需要是常量）。还可以以同样的方式调整步骤710中使用的预定百分 比阈值。
[0176] 也可以改变方法100的示例性实施例中所用的其他阈值。例如，这些阈值包括：当 在步骤102或202中从TPEF图像中识别内腔时，用于定义小区域和具有不规则形状的区域 的阈值；在步骤1110中用于确定局部最小方向的阈值；以及在步骤1110中用于确定是否 主轴的像素定向接近局部最小方向的定向的阈值。
[0177] 而且，尽管在上述例子中使用平行计算同时执行子步骤902-906,但它们还可以按 序执行。
[0178] 此外，使用不同于图像腐蚀的其他方式可以执行步骤1104中去除像素以提取每 个胶原蛋白片段的骨架，前提是仍要满足约束条件（对于所有的胶原蛋白片段，在停止条 件成立之前，去除最新生成的骨架的边界像素不会导致具有两个或多个不相连的像素组的 结构）。
[0179] 此外，步骤108和208中，可以使用诸如偏最小二乘（PLS)技术的其他转换技术转 化量化值。
[0180]训练模型也可以不使用多项逻辑回归模型，尽管这样的模型是优选的，因为它可 以为每个试验图像产生多个例如5个或7个结果（或者更具体地，概率）。
[0181] 此外，尽管上述方法100的示例性实施例使用了 Metavir评分系统，但它也可调整 为使用Ishak评分系统。
[0182] 用于实施方法100和200的系统
[0183] 图17示出了用于实施根据本发明实施例的方法100和200的系统1700。
[0184] 特别地，此系统1700包括用于采集试验图像和训练图像的成像系统1702。这一成 像系统1702可以为显微镜或者全切片扫描仪。
[0185] 系统1700还包括用于接收对方法100和200的输入（包括成像系统1702的图像 和人工操作员的用户输入）的输入装置1704。人工操作员的用户输入可以包括：诸如是否 所采集的图像用于训练模型或者用于输入至方法100等指令，或者与训练图像有关的真实 数据。
[0186] 系统1700进一步包括计算平台或数据处理平台，该平台又包括处理器1706、存储 装置1708、输出装置1710和记忆装置1712。处理器1706被配置为执行方法100和200,而 且可以为本地（如本地计算机）或者远程（例如远程服务器）。记忆装置1712被配置为暂 时存储实施方法100和200期间所采集的图像和任何所采集的数据。存储装置1708也可 以是本地的或者远程的，而且被配置为存储代表训练模型的参数。方法100生成的统计数 据和为所采集的图像计算的量化值也可以存储于存储装置1708。方法100生成的统计数据 还可以进一步转移到输出装置1710以显示。
[0187]方法100的应用
[0188] 方法100可以用于许多应用。例如，方法100可以用于在基础研究和医疗实践中 精确分析肝纤维化，如上述示例性实施所证。方法100也可以是极好的互补工具，用于传 统半定量组织病理学肝纤维化评估方法、以及用于当前的肝活检纤维化评估的黄金标准惯 例。例如，病理医师通常在确定质量差的试验活检组织样本（例如短于15_的较小的试验 活检组织样本）的纤维化分期时面临多种困难。在这一情况中，通过使用质量良好（即样 本长于15mm)的活检组织样本训练的模型，方法100能够用作良好的互补工具以辅助病理 医师确定并调整他们对质量差的试验活检组织样本的纤维化分期。此外，方法100可以用 作教导工具以训练没有经验的病理医师。特别地，首先可以使用有经验的病理医师的知识 (例如，通过有经验的病理医师决定每个训练图像中组织的纤维化分期）训练模型，然后将 该模型用于方法100中以获取一系列试验图像的结果。可以应用这些结果以辅助没有经验 的病理医师决定试验图像中组织的纤维化分期，因此，这些结果可以有助于教导没有经验 的病理医师。
[0189] 此外，方法100为用于评价增量处理功效的有效工具。这样的评价对于抗纤维化 药物的开发和慢性肝疾病的相关研究是有用的。除了肝纤维化，方法100也可以应用于肿 瘤学领域，即，评估这一领域中的肿瘤结缔组织和对治疗的响应（例如可以由后处理瘢痕 的量来表示）。
[0190] 具体地，方法100中生成的统计数据可以用于许多应用。这种应用的三个例子为 对患者（试验图像是从该患者中获取的）的诊断、对患者的治疗疗效的评价和对其他诊断 工具的验证。例如，根据示例性实施中生成的概率可以预估患者的肝的纤维化分期。此外， 在该示例性实施中，由于所生成的指标对患者的肝的小改变是敏感的，可以每隔一段时期 从经历了特定处理的患者采集试验图像，并且可以为每个试验图像生成指标以评价治疗的 疗效。此外，为每隔一段时期所采集的试验图像生成的指标可以与通过新开发的工具为这 些试验图像所生成的测量结果相对比，以验证这些新开发的工具的性能。指标也可以用于 替代组织学标记并用于需要组织-病理学评价的任何应用中。
[0191]方法100的优势
[0192] 下文描述了方法100的一些优势。
[0193]方法100不需要对组织样本讲行染色
[0194] 方法100可以使用用免染成像技术（即，不需要对样本染色的成像技术）获取的 图像。例如，方法100可以使用用SHG显微镜[14-16]和TPEF显微镜获取的图像。上文在 方法100的示例性实施中对此进行了解释说明。
[0195] 不需要对组织样本进行染色能够完全避免染色的人为影响，这转而有助于实现同 时精确评估例如组织样本的胶原蛋白含量和形态学信息[17]。不需要对组织样本进行染色 和消化吸收也使得易于在不干涉现存协议、或者不需要额外信息或材料的情况下在各种研 究中使用方法100。此外，在方法100中使用SHG技术是尤其有利的，因为SHG技术可以在 不对组织样本染色的情况下为厚的组织样本提供3D可视化能力[18]，因此能够使组织样 本的实时3D检测降低到细胞水平。
[0196] 方法100为全自动
[0197] 此外，方法100为全自动。"自动"意味着，尽管可能用人机交互开启算法，但在算 法的执行过程中不需要人机交互（尽管可选地，方法100可以半自动执行，其中，在处理期 间存在人与计算机的交互作用）。
[0198] 方法100为全宙量
[0199] 方法100的另一优势为它是全定量的且几乎不依赖用户的观察，而由于观察者内 部和外在偏差，用户的观察通常是高度主观的。
[0200] 方法100的示例件实施伸用了三种不同类铟的胶原蛋白冈域的特征的量化倌
[0201] 特别地，方法100的示例性实施是有利的，因为它使用了三种不同类型的胶原蛋 白区域（血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域）的特 征的量化值去评估肝纤维化。这与慢性病毒感染和慢性胆汁郁积失调症的许多当前的分期 和评分系统形成了对照，即在慢性病毒感染和慢性胆汁郁积失调症中，纤维化胶原蛋白一 即细胞外周/窦周隙内的胶原蛋白一的改变没有被详述[23-25]。此外，因为血管周胶原蛋 白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域是病理相关的，因而使用这三 种不同类型的胶原蛋白区域的特征的量化值要比使用并不病理相关的其他区域的特征更 有利。
[0202] 要注意，尽管本发明人在前述专利申请PCT/SG2011/000133的方法中也是识别了 两种不同类型的胶原蛋白区域，即正常胶原蛋白区域和非正常胶原蛋白区域，并为这两种 类型的胶原蛋白区域的每一个计算了 CPA，但这一方法不同于方法100,因为它没有识别血 管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域和小叶纤维化胶原蛋白区域。
[0203] 因为使用了三种不同类型胶原蛋白区域的特征的量化值，在示例性实施中，通过 获取患者的肝随时间的图像，所生成的统计数据可以用于精确地追踪患者的肝形态改变。 具体地，使用血管周指标可以追踪患者的肝中血管周扩张的量；使用桥样联结指标可以追 踪患者的肝中纤维化桥联结的量；使用小叶纤维化指标可以追踪患者的整个肝中微细胶原 蛋白的一般分散。在纤维化进展的动态过程期间，已经观察到了这些改变[20]，因此，通过 追踪这些改变，可以确定患者的肝随时间的纤维化分期。
[0204] 从所有三种类型的胶原蛋白结构获取特征，从这些特征生成qFibrosis指标，因 此，在某种意义上，qFibrosis指标为其他三种指标：血管周指标、桥样联结指标和小叶纤 维化指标的组合。虽然通常期望这三种指标会随着纤维化进展而增加，但发现的是，每种指 标在检测纤维化进展的不同分期时的有效性是不同的（例如，某种指标可能在检测分期2 纤维化时更加敏感）。因此，作为所有三种指标的组合的qFibrosis指标可以检测肝中随时 间的微细增量的纤维化改变，并且可以用于研究肝硬化中衰退模式。因此，qFibrosis指标 在预后应用中非常有利。
[0205] 方法100根据三种类型的胶原蛋白结构生成统计数据的能力其实是由于在方法 1〇〇中所用的算法精确地且自动地区分不同类型的胶原蛋白的能力。
[0206] 例如，从图8可以看出，使用方法100不管组织样本中纤维化分期如何，都可以有 效地辨识出不同类型的胶原蛋白区域。
[0207] 方法100的示例件实施伸用了聚集胶原蛋白纤维和分散胶原蛋白纤维的特征的 量化倌
[0208] 在示例性实施中，方法100将每种类型的胶原蛋白区域的纤维均分为聚集胶原蛋 白纤维和分散胶原蛋白纤维，并使用这两种类型中的每一种的纤维的特征的量化值。这还 有助于追踪患者的肝的形态改变。
[0209] 例如，诸如"聚集CPA/CPA"和"分散CPA/CPA"等特征能够反映聚集血管周胶原蛋 白和分散血管周胶原蛋白随纤维化进展的动态改变，使用这些特征可以有助于追踪与这些 动态改变有关的形态改变。
[0210] 方法100的示例件实施伸用了对成像的这部分组织稳宙的特征
[0211] 图18示出了在方法100的示例性实施中使用的一些特征与CPA测量结果之间的 量化对比。使用如上所述方法100的示例性实施中所采集的、晚期纤维化（F4)的大鼠肝组 织样本的三个不同切片1802、1804和1806的图像执行图18所示的对比。
[0212] 如图18所示，为不同切片1802-1806所获取的CPA测量结果从11. 47 %到20. 79% 显著变化，这表明了 CPA方法对成像的这部分组织样本的敏感性。在现有技术中已经报道 了关于CPA的这种敏感性的类似发现。事实上，斯坦迪仕（Standish)等人[21]在它们的 综述中已经声明CPA和组织学评分是完全不同的肝纤维化评估方法。
[0213] 另一方面，如图18所示，为三个切片1802-1806所获取的血管周CPA百分比（血 管周CPA/CPA)、桥样联结CPA百分比（桥样联结CPA/CPA)和小叶纤维化CPA百分比（小 叶纤维化CPA/CPA)的变化非常小。具体地，这些百分比的变异系数（定义为标准偏差除以 平均值）要远远小于CPA测量结果的变异系数。换言之，与CPA测量结果相比，这些百分比 (血管周CPA/CPA、桥样联结CPA/CPA、小叶纤维化CPA/CPA)对成像的这部分组织样本非常 不敏感。这同样应用于对结构测量，例如血管周胶原蛋白的厚度（即"截断宽度"）和桥样 联结胶原蛋白的厚度（即"桥样联结宽度"）。这证明了在肝纤维化评估中，相对于只使用 CPA测量结果，表征胶原蛋白结构改变的优势。
[0214]即伸用小的组织样本仍可以自好地执行方法100的示例件实施
[0215] 不适当的活检尺寸已经被引用为在众多临床实践中能够影响纤维化评估的精确 性的一个主要因子[26]。已经提出建议，为评估慢性病毒性肝炎，组织样本的最小长度应该 为20_[27]。然而，斯坦迪仕等人的系统性综述示出，在实践中组织样本的平均活检长度只 有13. 5mm[21]。因此，希望具有一种不管活检样本的尺寸是否可用均能有效工作的方法。
[0216] 与CPA方法相比，因为方法100的示例性实施使用了对组织样本的尺寸的敏感性 较低（于CPA测量结果相比）的形态特征，所以它对试验组织样本的尺寸更加稳定，并且用 小的组织样本也能够较好地执行。
[0217] 特别地，表4示出了对于不同尺寸的图像，CPA测量结果与qFibrosis指标之间的 对比。如上所述在示例性实施中采集大鼠肝组织样本，从这些样本中采集图像，将这些采集 的样本的图像裁剪到原尺寸的一半、四分之一、八分之一和十六分之一，从而获取不同尺寸 的图像。这些图像的最终尺寸在1mm 2到16mm 2的范围内。
[0218]
[0219] 表 4
[0220] 具体地，表4示出了对不同尺寸的图像获取的CPA测量结果及qFibrosis指标的 曲线下面积（Area Under Curve，AUC)值。如表4所示，CPA测量结果以及qFibrosis指 标的AUC值都随着输入图像的减小而减小。然而，可以看出，不管输入图像的尺寸如何， qFibrosis指标在区分肝组织样本的不同纤维化分期时都比CPA测量结果表现地更好。事 实上，已经发现，当输入图像为1mm 2大小时qFibrosis指标的表现与输入图像为8mm 2大小 时CPA测量结果的表现相似。即使在最小的试验图像尺寸（即1mm2)中，对qFibrosis指标 获取的AUC值对于早期纤维化检测可以达到大约0. 75,对于晚期纤维化检测可以达到0. 85 以上。另一方面，用最小的图像尺寸时CPA对早期纤维化检测不能有效执行（特别地，其 AUC值小于0. 65)。此外，与对CPA方法获取的AUC值相比，对方法100获取的AUC值在整 个不同图像中变化较小。
[0221] 方法100的示例件实施要比CPA方法与组织病理学