一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及PCR引物设计技术领域，更为具体地说，设及一种基于Primer3的 bPr imer批量PCR引物设计方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)作为最基础的分子生物学实 验手段之一，能够在体外成百万倍地扩增目标DNA的拷贝数，因而被广泛应用于基因工程、 诊断试剂等领域。
[0003] PCR实验成败的一个关键因素是PCR引物设计的好坏，因此，为设计出更好的引物， 发明了种类众多的PCR引物设计软件。最早且最基础的PCR引物设计软件是PrimerO.5,而后 又在PrimerO. 5的基础上设计了现在被广泛使用的Primerf开源PCR引物设计软件。Primerf 最基本的功能包括设计PCR引物和设计杂交探针，并且具有免费、开源、跨平台等优点。随后 研究者在Primer3的基础上进行二次开发，形成了诸如NCBI Primer BLAST,BatchPrimerS 等等衍生的引物设计软件，进一步扩展了 Primerf的影响力。
[0004] 虽然Primer3和其衍生软件得到了广泛应用，然而却仍不能完全满足实际项目中 用户的个性化需求，存在很大的改进空间。Primer3及其衍生的引物设计软件存在如表1所 示的问题：
[0005] 表l:Primer3及其衍生的引物设计软件存在的问题
[0006]
[0007]由上表能够看出，PrimerS-次只能输入一个片段，无法批量操作；BatchPrimerS 着重改进了批量操作，但是它不能预防遗传多样性或同源基因引起的扩增失败，也不能直 接处理较长的目标序列;NCBI Primer BLAST主要通过BLAST技术(Basic Local Alignment Search Tool ,BLAST)预测非特异扩增，但是它不支持批量操作;MPRIM邸着重改进了非特异 扩增预测和二级结构检测，但是同样不能直接处理较长的目标序列。
[000引同时，引物设计领域还存在着众多商业软件，例如Primer Premiere.0，LIG0 7、 Primer Analysis Software。尽管在人性化和易用度方面商业软件有明显优势，适合不熟 悉生物信息学的实验人员使用;但是它们作为商业软件，源代码均不透明，无法自行开发扩 展功能，也无法自行排除程序错误，难W和其他开源软件交互，跨平台状况不佳，并且还需 要支付授权费。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，W解决
【背景技术】所述的现有PCR引物设计方法在设计PCR引物时因没有预防遗传多样性而导致引 物设计失败的问题。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0011 ] -种基于PrimerS的bPrimer批量PCR引物设计方法，所述方法包括：
[001 ^ SOI:获取目标DNA序列的原始序列；
[001引S02:依据所述目标DNA序列的原始序列提取DNA多态性数据中的高频多态性位点；
[0014] S03:对所述高频多态性位点进行标记；
[0015] S04:输出标记高频多态性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基 长度相同；
[0016] S05:读取所述注释序列，并计算解链溫度和生成候选引物；
[0017] S06:筛选候选引物，得到引物。
[0018] 优选地，所述方法还包括:长目标片段的自动分割。
[0019] 优选地，所述长目标片段的自动分割包括:若所述目标DNA序列的原始序列未获得 候选引物，则将所述目标DNA序列的原始序列平均分为两个子序列，并分别设计引物;若所 述两个子序列未获得候选引物，则将所述两个子序列继续平分，直至所述目标DNA序列的原 始序列有候选引物或所分得子序列的长度小于预设最低产物的长度。
[0020] 优选地，步骤SOl中所述获取目标DNA序列的原始序列包括:构建目标DNA序列的坐 标文件，并使所述坐标文件的每一行包括一个基因组坐标。
[0021] 优选地，所述基因组坐标的形式为C虹A:B+C形式。
[0022] 优选地，步骤S02中所述提取DNA多态性数据中的高频多态性位点包括:从所述DNA 多态性数据中提取与所述目标DNA序列的坐标文件相对应的高频多态性位点。
[0023] 优选地，步骤S03中所述对所述高频多态性位点进行标记包括：WlUPAC标准简并 码、"<〉"和"[r分别对所述高频多态性位点中的单核巧酸高频多态性位点、插入缺失标记 位点和目标DNA序列进行标注。
[0024] 优选地，步骤S06中所述筛选候选引物包括：
[0025] 筛除所述解链溫度不在设定范围内的候选引物；
[0026] 筛除单核巧酸高频多态性位点超过设定阔值的候选引物；
[0027] 筛除3'端含有单核巧酸高频多态性位点的候选引物；
[002引筛除3'端含有插入缺失标记位点的候选引物；
[0029]筛除3'端5个碱基范围内含有简并碱基的候选引物；
[0030] 筛除非特异性扩增的候选引物；
[0031] 筛除存在风险的候选引物。
[0032] 优选地，所述筛除非特异性扩增的候选引物为使用iPCRess和In-SilicoPCR预测 候选引物是否非特异性扩增，并将非特异性扩增的候选引物筛除。
[0033] 本发明提供了一种基于Primer 3的bPrimer批量PCR引物设计方法，所述方法包括： SOl:获取目标DNA序列的原始序列；S02:依据所述目标DNA序列的原始序列提取DNA多态性 数据中的高频多态性位点；S03:对所述高频多态性位点进行标记;S04:输出标记高频多态 性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基长度相同；S05:读取所述注释序 列，并计算解链溫度和生成候选引物；S06:筛选候选引物，得到引物。本发明提供的基于 PrimerS的bPrimer批量PCR引物设计方法能够回避高频多态性位点，进而减少因目标人群 遗传多样性而导致的扩增失败。同时，本发明提供的引物设计方法能够批量检测引物的特 异性，进而减少非特异扩增、引物二聚体等原因导致的扩增失败，并且能够用于评估现有引 物的特异性。
【附图说明】
[0034] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动 的前提下，还可W根据运些附图获得其它的附图。
[0035] 图1是本发明实施例提供的基于PrimerS的bPrimer批量PCR引物设计方法的流程 图；
[0036] 图2是本发明实施例提供的基于PrimerS的bPrimer批量PCR引物设计方法中长目 标片段自动分割的示意图；
[0037] 图3是本发明实施例提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法设计的 ATMe59_F7、KL 邸 166_。12和1_301_。7 进行 PCR 实验的电泳图；
[0038] 图4是本发明实施例提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法设计的 L_301_巧进行PCR实验的峰值图；
[0039] 图5是本发明实施例提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法设计的 C虹1 -51-FO、C虹1-69-F0进行PCR实验的电泳图；
[0040] 图6是本发明实施例提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法设计的 化rl-51-R)进行PCR实验的峰值图；
[0041] 图7是本发明实施例提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法设计的 化rl-69-R)进行PCR实验的峰值图；
[0042] 图8是本发明实施例提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法设计的 乳腺癌风险基因 BRCAl、BRCA2全部外显子测序深度图。
【具体实施方式】
[0043] 本发明实施例提供的批量设计祀向PC