发明提供 的预测候选引物是否非特异性扩增的方法来预测PCR的结果，并用化Iiper Lab化ip GX仪 器来验证实际PCR实验的产物。在本次实验中，除使用iPCRess软件和In-SilicoPCR软件来 预测候选引物是否非特异性扩增外还使用NCBI Primer Blast和MFEPrimerf两款网页工具 作为对比，预测的结果请参见表5。
[0072] 表5:非特异性扩增的预测结果
[0073]
[0074] 从表5中能够看出，ATMe59_F7的PCR实验的电泳结果有多条带或无扩增;KL邸le6_ F12的PCR实验的电泳结果有多条带;L_301_F7的PCR实验的电泳结果有多条带或无扩增； 化rl-51-FOX虹1-69-R)的PCR实验的电泳结果只有单一条带，即出现特异扩增。
[00巧]使用化Iiper Lab化ip GX仪器来验证实际PCR实验的产物的结果如附图3-7,附图 3-7分别示出了PCR实验的电泳图和峰值图，其中，附图3中的17、18和19条分别表示ATMe59_ 巧、化邸166_。12和1_301_。7的电泳结果图，附图5中的G13和G14条分别表示Chrl-51-FO和 化r 1-69-F0的电泳结果图。从附图3-7中能够看出，ATMe59_巧的PCR产物无明显条带，而 1(1邸166_。12和1^_301_巧的PCR产物在1000 bpW下有多个主要条带，且主要产物条带的大小 和预测结果接近;Chrl-51-FO的PCR产物仅有一条微弱的66化P非特异性条带，有少量大片 段糊区，Chrl-69-FO的PCR产物扩增特异性好，存在少量二聚体，且两条引物的特异性都很 好，符合预期。由此，说明本发明实施例提供的非特异预测方法与实验结果的一致性较好， 进而能够表明本发明实施例提供的非特异预测方法能够有效预测PCR实验的特异性，并可 W有效指导引物选择。
[0076] 为说明本发明实施例提供的基于PrimerS的bPrimer批量PCR引物设计方法能够批 量设计PCR引物，本发明实施例还对6个乳腺癌相关基因全外显子测序的PCR引物进行了设 计，并W实际PCR实验的结果来验证引物设计的效果，目标基因的基本信息请参见表6。
[0077] 表6:目标基因的基本f目息
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[0079] 从表6中看出，6个基因一共包括123个外显子，一共设计了 133对候选引物，并且保 证每个外显子被一对或多对候选引物完整覆盖。在进行引物设计时，133对候选引物分别经 过4批次的设计得出，并按照本发明实施例提供的过滤标准筛选出来。从PCR实验结果来分 析，133对候选引物中有130对引物在进行PCR扩增后的电泳实验有大小正确的条带，并符合 PCR结果合格;未成功的3对候选引物中，有2对引物在设计时由于Tm值偏低而致使预测到的 结果是非特异扩增;仅有一条PCR不成功的引物无法用设计数据预测，本次实验的成功率高 于 97.7%。
[0080] 为说明本发明实施例提供的基于Primerf的bPrimer批量PCR引物设计方法能够运 用于祀向高通量测序中，本发明实施例设计了乳腺癌风险基因 BRCAl、BRCA2全外显子测序 所需要的祀向引物，并对应于运两个基因的48个编码外显子。经过Fluidigm Access Array 扩增目标片段，然后在Illumina MiSeq高通量测序平台上进行测序，最终信息分析得到的 深度分布图，该分布图请参考附图8。从附图8中能够看出，123个扩增子都成功扩增，其中最 低深度为67,最高深度为516,相差小于10倍。扩增子平均深度为155,所有扩增子都在5倍平 均深度内。可W认为各扩增子的测序深度均一，测序质量符合预期。
[0081] 本发明提供的基于Primerf的bPrimer批量PCR引物设计方法能够回避高频多态性 位点，进而减少因目标人群遗传多样性而导致的扩增失败。同时，本发明提供的引物设计方 法能够批量检测引物的特异性，进而减少非特异扩增、引物二聚体等原因导致的扩增失败， 并且能够用于评估现有引物的特异性。
[0082] W上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明 的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于，所述方法包括： SO 1:获取目标DNA序列的原始序列； S02:依据所述目标DNA序列的原始序列提取DNA多态性数据中的高频多态性位点； SO 3:对所述尚频多态性位点进彳丁标记； S04:输出标记高频多态性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基长度 相同； S05:读取所述注释序列，并计算解链温度和生成候选引物； S06:筛选候选引物，得到引物。2. 根据权利要求1所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 所述方法还包括:长目标片段的自动分割。3. 根据权利要求2所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 所述长目标片段的自动分割包括： 若所述目标DNA序列的原始序列未获得候选引物，则将所述目标DNA序列的原始序列平 均分为两个子序列，并分别设计引物； 若所述两个子序列未获得候选引物，则将所述两个子序列继续平分，直至所述目标DNA 序列的原始序列有候选引物或所分得子序列的长度小于预设最低产物的长度。4. 根据权利要求2所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 步骤S01中所述获取目标DNA序列的原始序列包括： 构建目标DNA序列的坐标文件，并使所述坐标文件的每一行包括一个基因组坐标。5. 根据权利要求2所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 所述基因组坐标的形式为chrA: B+C形式。6. 根据权利要求4所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 步骤S02中所述提取DNA多态性数据中的高频多态性位点包括:从所述DNA多态性数据中提 取与所述目标DNA序列的坐标文件相对应的高频多态性位点。7. 根据权利要求4所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 步骤S03中所述对所述高频多态性位点进行标记包括： 以IUPAC标准简并码、"〈>"和"[]"分别对所述高频多态性位点中的单核苷酸高频多态 性位点、插入缺失标记位点和目标DNA序列进行标注。8. 根据权利要求7所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 步骤S06中所述筛选候选引物包括： 筛除所述解链温度不在设定范围内的候选引物； 筛除单核苷酸高频多态性位点超过设定阈值的候选引物； 筛除3'端含有单核苷酸高频多态性位点的候选引物； 筛除3 '端含有插入缺失标记位点的候选引物； 筛除3'端5个碱基范围内含有简并碱基的候选引物； 筛除非特异性扩增的候选引物； 筛除存在风险的候选引物。9. 根据权利要求8所述的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，其特征在于， 所述筛除非特异性扩增的候选引物为使用iPCRess和In-silicoPCR预测候选引物是否非特 异性扩增，并将非特异性扩增的候选引物筛除。
【专利摘要】本发明提供了一种基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法，所述方法包括：获取目标DNA序列的原始序列；提取DNA多态性数据中的高频多态性位点；对所述高频多态性位点进行标记；输出标记高频多态性位点的注释序列，所述注释序列和所述原始序列的碱基长度相同；读取所述注释序列，并生成候选引物；筛选候选引物等。本发明提供的基于Primer3的bPrimer批量PCR引物设计方法能够回避高频多态性位点，减少因目标人群遗传多样性而导致的扩增失败；能够批量检测引物的特异性，减少非特异扩增、引物二聚体等原因导致的扩增失败；能够用于评估现有引物的特异性；能够对长目标片段进行自动分割。
【IPC分类】G06F19/20
【公开号】CN105718759
【申请号】CN201610089004
【发明人】戴立忠, 彭厘旻, 郭鑫武, 陈明, 王煜, 罗喜鹏
【申请人】湖南圣维基因科技有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年2月17日