一种具有产电特性的Tolumonas osonensis菌株及其在微生物燃料电池中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有产电能力的Tolumonas?osonensis?P2-A-1菌株，该菌株从污水处理厂的污泥经过富集、分离、纯化和筛选得到，属于甲苯单胞菌属(Tolumonas)的Tolumonas?osonensis种，命名为Tolumonas?osonensis?P2-A-1。该菌株已于2013年5月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.7562。该菌株具有以下特征：菌体形态呈短杆状，2.4-3.6μm(长)×0.9μm(宽)，单个或成对存在，周身无鞭毛，无芽孢；革兰氏阴性；能在厌氧和有氧条件下生长；22℃、在胰蛋白胨大豆肉汤平板培养基上培养48h，形成圆形、易挑取、不透明、边缘整齐的白色菌落，直径2-4mm；可利用葡萄糖和乙酸钠等多种底物。利用该菌株在微生物燃料电池中进行产电，表现出较高的产电能力，功率密度达到509mW/m2。这是首次对T.osonensisa种内微生物产电性能及其在微生物燃料电池中应用的报道。
【专利说明】—种具有产电特性的Tolumonas osonensis菌株及其在微生物燃料电池中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种Tolumonas osonensis菌株的产电特性及其在微生物燃料电池中的应用研究。
【背景技术】
[0002]随着社会与经济的不断发展，能源消耗将逐年增加。煤炭、石油、天然气等不可再生能源持续增长的大量消耗，不仅使人类面临资源枯竭的压力，同时也带来了地球变暖、酸雨增加等问题。因此，为了人类能源的稳定持久供应、实现经济的可持续增长，改变能源的生产和消费方式，开发新的、对环境无害的、非石油类的可再生能源供给方式是未来能源发展的主体思路。
[0003]微生物燃料电池(Microbial Fuel Cells，MFCs)是一种利用微生物做催化剂氧化有机物并直接将化学能转化成电能的新型装置。它结合燃料电池与生物学技术手段，实现了生物化学能与电能的直接转化，是一种清洁的可持续能源，已逐渐成为新能源开发的焦点。
[0004]MFCs的基本结构与其他类型燃料电池类似，由阳极室和阴极室组成。阳极室中的有机物在厌氧条件下通过微生物新陈代谢作用氧化为代谢产物并释放出电子和质子；电子由微生物传递到阳极表面 ， 再由阳极经外电路传导到阴极，同时质子通过质子膜到达阴极室；在阴极室中，电子、质子和电子受体(通常为空气或溶氧)发生还原反应，产物为&0。这样在阳极室中产生的电子被不断的传递、消耗，从而形成闭合回路产生持续电流，这样就同时实现了有机物的去除和电流的产生。
[0005]产电微生物(Electricigens)是指那些在厌氧条件下能够完全氧化有机物成CO2，然后把氧化过程中产生的电子通过电子传递链传递到电极上产生电流的微生物。目前已报道的能在无介体条件下运行MFCs产电的微生物包括细菌类和真菌类。其中，细菌类产电微生物主要包括希瓦氏菌属(Shewanella)、地杆菌属(Geobacter)Jg单胞菌菌属(Pseudomonas)、弓形菌属(Arcobacter)、产氢细菌家族的产电菌(如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、铁还原红螺菌(Rhodoferax ferrireducens)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、耐寒细菌(Geopsychrobacter electrodiphilus)、克雷伯氏月市炎菌(Klebsiella pneumoniae L17)等。真菌类的产电微生物主要包括异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonas palustris)、小球藻(Chlorellavulgaris)等。产电微生物是微生物燃料电池中重要的生物催化剂，直接影响产电效率。因此挖掘更多具有这种功能的微生物对于丰富产电微生物的多样性，提高产电效率具有重要意义。
[0006]Tolumonas osonensis是2011年发现的甲苯单胞菌属(Tolumonas)的一个新种。细胞染色为革兰氏阴性。兼性厌氧，最适生长温度和PH分别为22°C和7.5。目前，Tolumonasosonensis种内微生物的产电特性及其在微生物燃料电池方面的应用在国内外尚未发现相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种具有产电能力的新菌株---Tolumonas osonensis
P2-A-1及其在微生物燃料电池中的应用。
[0008]本发明通过对污水处理厂的污泥进行富集、分离、纯化和筛选，得到一株Tolumonas osonensis P2-A-1。该菌株可以作为微生物燃料电池的阳极催化剂,进行催化底物产电，从而实现了本发明的目的。
[0009]本发明得到的菌株命名为Tolumonas osonensis P2-A-1,已于2013年5月保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所)，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC7562。
[0010]本发明的Tolumonas osonensis P2-A-1经过菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特征性实验、细胞脂肪酸化学成分分析以及16S rDNA序列比对，鉴定为Tolumonas osonensis。具有以下特征:(I)菌体形态呈短杆状，
2.4-3.6μπι(长)Χ0.9μπι(宽)，单个或成对存在，周身无鞭毛，无芽孢；(2)革兰氏阴性；
(3)能在厌氧和有氧条件下生长；(4)在22°C、胰蛋白胨大豆肉汤平板培养基上培养48h，形成圆形、易挑取、不透明，边缘整齐的白色菌落，直径2-4mm; (5)过氧化氢酶、明胶液化实验、尿素酶实验结果均为阳性，硫化氢实验和吲哚实验结果均为阴性；(6)能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、丙酸钠、乙酸钠、乳酸钠、琥珀酸钠、乙醇、甘油、延胡索酸盐、丙酮酸盐作为底物；(7)该菌株的16S rDNA基因具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1425bp，将获得的16S rDNA基因序列输入GenBank，通过Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析。结果发现，本发明P2-A-1菌株的16S rDNA基因序列与甲苯单胞菌属(Tolumonas)的菌株Tolumonas osonensis 0CF7T具有较高的相似性(Genbank上的登录号为⑶370947),同源性达到99%。
[0011]根据上述形态、生理生化特性及其16S rDNA基因序列在GenBank中的检索结果，鉴定该菌株归属于Tolumonas osonensis。
[0012]本发明的菌株Tolumonas osonensis P2_A_1能利用葡萄糖和乙酸钠等多种底物直接用于微生物燃料电池中进行产电，这是该种内首次报道具有产电特性的菌株。同时该菌株在微生物燃料电池中具有很高的产电活性，具有重要的工业应用前景和理论研究价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明菌株Tolumonas osonensis P2-A-1的菌落形态图；
[0014]图2为本发明菌株Tolumonas osonensis P2-A-1的革兰氏染色结果；
[0015]图3为本发明菌株Tolumonas osonensis P2-A-1的菌体扫描电镜图；
[0016]图4为本发明菌株Tolumonas osonensis P2-A-1在微生物燃料电池中的功率密
度示意图。
【具体实施方式】[0017]实施例1:MFCs阳极生物膜上微生物的分离纯化
[0018]取天津泰达污水处理厂污泥浓缩间的污泥，经过简单的淘洗和沉淀处理后，去掉底层无机化的沉淀物和表层的清水，取中间含水率在95%左右的污泥作为接种物，和污泥营养液(污泥10mL、矿物质溶液625 μ L、维生素溶液250 μ LUOOmM PBS缓冲溶液5mL、葡萄糖0.05g，补蒸馏水至50mL。)一起加入单室MFCs的反应器中。反应器主体为一个长为2.0cm，横断面直径为3.0cm的有机玻璃柱体，有效容积为14mL，阴阳极的有效面积均为7cm2。阳极和阴极分别置于MFCs主体的两测，并用橡胶圈密封固定。阳极一端用有机玻璃盖盖住，阴极一端的盖子是开口的，且阴极碳布载钼，阴极和阳极都与钛丝连接将电子导出或导入，最后整个装置用螺丝和丝杠拧紧固定。反应器构建成功后密闭阳极室，系统于30°C下连续运行14d左右，负载电阻两端的电压逐渐稳定，阳极上形成肉眼可见的厚的生物膜。将该生物膜上的全部菌体用接种针刮取，并悬浮于无菌水中制备成均匀的菌悬液，采用10倍逐级稀释法将适宜稀释度的菌恳液涂布于加入柠檬酸铁作为电子供体(终浓度为5.0OOg/L)，葡萄糖作为底物(终浓度为1.000g/L)的PBBM固体培养基中，30°C厌氧条件下培养3d，将平板上长出来的形状不同的菌落在上述相同的培养基和培养条件下进行反复的划线分离，最后得到多个纯种的分离株，将其进行编号和命名。
[0019]实施例2 =MFCs阳极生物膜上纯种微生物的产电性能分析
[0020]挑取实施例1得到的各个分离株，分别接种到柠檬酸铁作为电子供体(终浓度为5.000g/L)、葡萄糖作为底物(终浓度为1.000g/L)的PBBM液体培养基中，22°C，有氧条件下静置培养48h。将各个分离株的培养液于4°C条件下，6000r/min离心20min后收集菌体。
[0021]分别将不同分离 株的相同质量的菌体接种于阳极液I (PBBM液体培养基中加入柠檬酸铁作为电子供体(终浓度为5.000g/L)，葡萄糖作为底物(终浓度为1.000g/L)，pH =7.2，电导率为7.8mS/cm。)，得到的接种液注入MFCs反应器中，反应器分别和外电阻1000 Ω和数据采集装置连接好，室温下运行。运行过程中需要定期更换接种液(即接种了对应分离株菌体的阳极液)，一般24h更换一次，每次更换时先将MFCs内的原接种液取出，然后加入新鲜的接种液，待反应器出现连续三个的稳定电压即可认为启动成功。启动成功后进入正式运行期，当监测的输出电压低于50mV时，只需要更换阳极液，当输出电压再次达到最高并趋于稳定时进行极化曲线和功率密度曲线的测定，之后停止MFCs运行。整个过程中利用PIS0-813型数据采集系统对电压进行实时的在线数据监测和记录，分析数据时取30min内的平均值，采样精度为0.001V。各个分离株在MFCs中的产电性能结果见表1。
[0022]表1
【权利要求】
1.具有产电能力的菌株Tolumonasosonensis P2-A-1,其特征在于:该菌株的16SrDNA基因具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1425bp，在Genbank上的登录号为GU370947，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7562。
2.根据权利要求1所述的菌株Tolumonasosonensis P2-A-1,其特征在于:该菌株从污水处理厂的污泥经过富集、分离、纯化和筛选得到一株革兰氏阴性细菌。
3.根据权利要求1所述的菌株Tolumonasosonensis P2-A-1,其特征在于:能在厌氧和有氧条件下生长；在22 °C、胰蛋白胨大豆肉汤平板培养基上培养48h，形成圆形、易挑取、不透明，边缘整齐的白色菌落，直径2-4mm;菌体形态呈短杆状，2.4-3.6μmι(长)Χ0.9μm,(宽)，单个或成对存在,周身无鞭毛，无芽孢。
4.根据权利要求1所述的菌株Tolumonasosonensis P2-A-1,其特征在于:过氧化氢酶、明胶液化实验、尿素酶实验结果均为阳性，硫化氢实验和吲哚实验结果均为阴性，能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、丙酸钠、乙酸钠、乳酸钠、琥珀酸钠、乙醇、甘油、延胡索酸盐、丙酮酸盐作为底物。
5.如以上所述的菌株Tolumonasosonensis P2-A-1在微生物燃料电池中的应用,其特征在于:所述菌株能利用葡萄糖和乙酸钠等多种底物直接用于微生物燃料电池中进行产电。
【文档编号】H01M8/16GK103509735SQ201310244780
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年6月20日 优先权日:2013年6月20日
【发明者】骆健美, 周明华, 杨佳, 王敏 申请人:天津科技大学