整合的混合NEMS质谱测定法的制作方法
相关申请
本申请要求2015年1月23日递交的美国临时申请序列号为62/107,254的优先权，该临时申请在此通过引用以其整体并入。
背景
纳机电系统(nems)谐振器是可用于对分析物的异常灵敏的质量检测的电子地和光学地可控的亚微米级机械悬臂。在吸附到nems谐振器上时，分析物可以急速降低谐振器的谐振频率，谐振频率由专用电子电路连续监测。诱导的频率变化与分子的质量成比例，并且取决于谐振器上的着陆位置。实现该技术的技术解决方案可以在例如美国专利号6,722,200、7,302,856、7,330,795、7,552,645、7,555,938、7,617,736、7,724,103、8,044,556、8,329,452、8,350,578和9,016,125中找到。
这些发展已经被应用于生物分子(包括单分子)的超灵敏质量检测，如例如美国专利号6,722,200、8,227,747和美国专利公布2014/156,224中所述的。通过仅仅从几百个分子吸附事件的统计分析以及在最新实施例中使用单独的分子来组合简单的谱。
对单分子分析解决的问题之一是，由分析物吸附引起的谐振频率偏移取决于分析物的质量和其在nems谐振器上的吸附的精确位置。如在美国专利公布2014/156,224中所述的，通过激发和检测谐振器的多个振动模式以确定这两个未知量来解决该问题。使用当技术进一步发展时预期的显著改进来证明50-100kda的质量分辨率。参见例如yang，y.t.等人的zeptogram-scalenanomechanicalmasssensing，nanoletters6,583-586(2006)。
纳米喷雾离子源和ms大气至真空接口与在美国专利公布2014/156,224中的nems检测以及基质辅助激光解吸和电离源一起被使用。使到达的分析物在设备的表面上的nems增强的非特定物理吸附冷却。通过单独地测量顺序到达的分析物微粒的质量，在美国专利公布2014/156,224中构建表示整个异质样本的质谱。
通过连续监测多种振动模式，随后在美国专利公布2014/244,180中将该方法扩展到在单独分析物实体吸附到纳米机械谐振器上时，逐一检测它们的质量分布的空间矩。
因此，nems已经成为可行的质谱测定方法(ms、nems-ms)。特别重要的是，nems-ms可用于评估中性分子物质，以及还有分辨能力和灵敏度随着质量的增加而提高。
质谱测定法在传统上通过首先向分析物提供在离子源中的电荷且然后使用电磁场测量分析物质荷比来处理对分析物的识别。近年来，质谱测定法在生命科学和医学中承担越来越重要的角色，并成为蛋白质组学分析的主要技术。现代质量分析仪的增加的分辨率和质量范围允许人们在天然条件下(即在接近生理的ph下)使用纳米喷雾法测量蛋白质复合物和甚至高到1-50mda的病毒衣壳。例如，在美国专利号8,791,409中显示，轨道静电阱质谱测定法可以用数千计的质量分辨能力检测蛋白质复合物的单独离子。然而，基于质荷比的ms通常在较高的质量下显示降低的性能，特别是由于mda分析物的重叠的电荷分布。
尽管有在技术上的进步，但是仍然存在继续改进和更多方面地使用质谱测定法的能力的需要，特别是用于解决关于在生命科学中发现的大的和复杂的生物分子结构、复合物和甚至细胞器的复杂分析问题。需要更好的方法来确定范围从基本序列确定到蛋白质和复合物的高阶结构和动力学的可用的大量信息。电荷状态分配对于较大的、不足地去溶剂化的蛋白质复合物可能是困难的。
概述
在本文描述和/或要求保护的方面和实施例包括例如质谱仪装置、系统和仪器、使用方法及制造其的方法。还描述了子系统和子部件。特别是，描述了与nems-ms相关的新设备和方法。
一方面，提供一种质谱仪装置，其包括：至少一个混合质谱仪，其包括：用于从样本产生离子的离子源；包括纳机电质谱(nems-ms)系统的第一质谱系统；第二质谱系统，其包括适于根据带电粒子的质荷比分离带电粒子的至少一个质量分析器；以及将第一质谱系统和第二质谱系统耦合的整合区，整合区包括用于可控地将离子按规定路线发送到第一质谱系统和第二质谱系统中的选定的一个或两个以由此分析的至少一个定向设备。
在一个实施例中，整合区包括至少一个四极、至少一个孔以及至少一个静电透镜和可选地一个或更多个偏转器、中性物质过滤器或隔离阀。
在一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统进一步使用具有至少一个涡轮泵的顺序级的差动泵浦被整合。
在一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统进一步与包括传递室和离子光学器件的系统接口整合。
在一个实施例中，第一质谱系统与第二质谱系统相比适于在更高的真空、更低的压力下操作。
在一个实施例中，第二质谱系统包括开放或封闭静电阱(est)，其包括轨道类型的est、飞行时间(tof)、傅立叶变换离子回旋共振(fticr)、四极、离子阱、磁性和电磁或混合质谱系统。在一个实施例中，tof被排除。在这里，第二质谱系统可以包括开放或封闭静电阱(est)，其包括轨道类型的est、傅立叶变换离子回旋共振(fticr)、四极、离子阱、磁性和电磁或混合质谱系统。
在一个实施例中，第二质谱系统或整合区包括至少一个解离或碰撞池。
在一个实施例中，第二质谱系统或整合区包括至少一个表面诱导解离元件。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，其中谐振器的适于接收离子束和样本的表面面向第二质谱系统。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括多个微机械和/或纳米机械谐振器。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个制冷子系统，其允许将nems-ms系统冷却到环境温度之下。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，该谐振器包括谐振器表面，其适于使得当分析物被吸附到谐振器表面时避免分析物碎裂。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，该谐振器包括适于使分析物软着陆的谐振器表面。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，该至少一个芯片包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，其包括谐振器表面，该谐振器表面适于使得当分析物被吸附到谐振器表面时分析物可以从谐振器表面被解吸以用于进一步分析。
在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，其中nems-ms系统进一步适于在分析物被吸附到至少一个微机械和/或纳米机械谐振器时，对分析物进行分析。
在一个实施例中，质谱仪适于将外部样本引入到第一质谱系统内和/或将外部样本引入到第二质谱系统内。
在一个实施例中，第一质谱系统适于逐像素解吸。
在一个实施例中，第一质谱系统适于从第一质谱系统解吸，其中通过热、静电、声学、光学、震动或压电-机械方法实现解吸。
在一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用电气定向设备被进一步整合，该电气定向设备将离子束电气地引导到第一质谱系统和/或第二质谱系统，其中定向设备是hcd碰撞池，其中第二质谱系统包括c阱和轨道静电阱质量分析器，并且其中nems-ms系统包括至少一个芯片，其包括多个微机械和/或纳米机械谐振器。
还提供了使用在本文描述和/或要求保护的装置的方法。例如，另一方面是用于使用如在本文所述和/或要求保护的装置的方法，其中样本被引入到装置中并在第一质谱系统和/或第二质谱系统中受到分析。
在一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中并行地受到分析。
在一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中顺序地受到分析。
在一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中在全质量范围模式中并行地受到分析。
在一个实施例中，一个质谱系统的操作模式根据从另一系统获得的数据来选择。
在一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中用质量过滤器逐步通过不同m/z比并行地受到分析。
在一个实施例中，样本经受碎裂。
在一个实施例中，该方法用于测量分子的溶剂化的程度和/或完整的分子质量、电荷状态确定或任何其它参数。
在一个实施例中，样本在存在于nems-ms系统的谐振器上时受到另外的分析。
在一个实施例中，分析包括单分子分析。
在一个实施例中，分析是天然单分子分析。
在一个实施例中，在天然条件下引入样本。
在一个实施例中，分析包括用于提供对质量的空间分布的测量的惯性成像。
在一个实施例中，在软着陆的条件下分析样本。
在一个实施例中，样本分析包括解吸。
在一个实施例中，样本分析包括解吸，其中通过热、静电或光学方法实现解吸。
在一个实施例中，样本受到解离sid、cid、uvpd或基于声学的解离。
在一个实施例中，样本受到蛋白质测序。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在微机械或纳米机械系统阵列上，使得覆盖≤每质量感测像素1个分析物。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在微机械或纳米机械系统阵列上，使得覆盖>每质量感测像素1个分析物，并且>1个分析物的群体的识别被确定。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在微机械或纳米机械系统阵列上，使得覆盖>每质量感测像素1个分析物，并且>1个分析物的群体的识别通过惯性成像确定。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在微机械或纳米机械系统阵列上，使得覆盖≤每质量感测像素1个分析物，其中每个所吸附的物质受到程序性解吸，后面是对所解吸的物质的进一步分析。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在微机械或纳米机械系统阵列上，使得覆盖>每质量感测像素1个分析物，其中每个所吸附的物质受到程序性解吸，后面是对所解吸的物质的进一步分析。
另一方面是分析分子的方法，其包括：根据待分析的分子的样本来在离子源中产生离子；在质量分析器中根据离子的质荷比来分析所述离子中的至少一些；获得所分析的离子的谱；其中质量分析通过下列操作来补充：将至少一些离子从离子源转移到机电设备，其在吸附待分析的单个离子时可测量地改变其特性之一；在一大批所吸附的离子吸附时测量所述特性的变化，并将它的振幅转换成在每个离子内的质量分布的特性；其中来自多个测量结果的统计分布用于分配在由质量分析器获得的质谱中的峰的电荷状态和质量。
在一个实施例中，质量分析器是轨道静电阱质量分析器。在另一个实施例中，机电设备包括一个或更多个微机械和/或纳米机械谐振器。
可以从本文所述的一个或更多个仪器和方法实施例中找到各种优点。这些优点涵盖了分析应用的许多领域，且并不仅限于生命科学应用，尽管生命科学是主要的焦点。在例子中：仪器和方法还可以允许对纳米粒子的敏感分析，例如表征物种的异质群体中的稀有物种；它们还可以提供对纳米传感器例如基于例如超薄半导体和石墨烯的传感器的进一步测试。
例如，在一些实施例中，本文所描述的仪器和方法可以实现对包括总体结构以及子组分的结构的高质量大分子复合物的定量分析。例如，可以分析分子大小和形状、密度和物理性质，并且可以实现高分辨率。
此外，在一些实施例中，对单分子和物质的测量是可能的，而不仅仅是对单分子和物质的统计分布的测量。
此外，在一些实施例中，天然质谱分析是可能的。
此外，在复杂生物样本中存在的在分子组成方面不同的亚群体的分析中可以实现分层，该分析提供例如优异的结构/功能信息。
在许多实施例中，可以实现对预选择的生物分子物质的精确、高通量递送及其解离后分析。
至少一些实施例的许多其他优点在整个本申请中被提到。
附图简述
图1a(顶部)和图1b(底部)图示了混合nems轨道静电阱质谱仪的一个实施例的概念和功能示意图。示意图在碰撞池和传输光学器件之后的差动泵浦室中组合大气压离子源、大气至真空接口、四极质量过滤器、轨道静电阱质量分析器和nems设备。
图2图示了在图1a和图1b所示的轨道静电阱分析器中观察到的groel离子的m/z谱。分配电荷状态以便最小化所计算的质量的标准偏差。所计算的质量为801,105da，证实了完整的groel复合物可以在系统内被转移。
图3示出了用安装在图1a和图1b所示的nems室中的xyz定位器上的定制静电计(未示出)检测到groel离子。可以通过打开或关闭传输四极rf来传输或阻挡离子。
图4图示了xyz定位器被扫描以确定图1a和图1b所示的仪器的最大束强度的位置。轮廓的非圆形外观是由于电极几何形状。
图5是由于使用图1a和图1b所示的仪器对groel分子的吸附而引起的频移的示例。
图6示出在暴露于离子束的nems芯片上，50％的离子在0.05mm直径束斑内。
图7示出了冷却pcb。
详细描述
引言
2015年1月23日提交的优先美国临时申请序列号62/107,254在此通过引用以其整体(包括附图、背景和所引用的参考文献)被并入。
本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文，并且没有承认这些参考文献中的任一个是现有技术。
一个广泛的方面提供一种质谱仪装置，其包括：适于利用包括至少一个样本的至少一个离子束起作用的至少一个混合质谱仪，该谱仪包括：至少一个第一质谱系统和与第一质谱系统整合的至少一个第二不同的质谱系统，其中第一质谱系统包括至少一个纳机电质谱(nems-ms)系统，而第二质谱系统测量质荷比。这两个系统的整合可以用如本文所描述和/或要求保护的各种实施例实现。
例如，另一方面提供一种质谱仪装置，其包括：适于利用包括至少一个样本的至少一个离子束起作用的至少一个混合质谱仪，该谱仪包括：至少一个第一质谱系统和使用整合区来与第一质谱系统整合的至少一个第二不同的质谱系统，该整合区使第一质谱系统和第二质谱系统分离并包含离子光学元件，其中第一质谱系统包括至少一个纳机电质谱(nems-ms)系统，而第二质谱系统测量质荷比，且离子束可以通过电气地切换离子光学元件被引导到第一质谱系统或第二质谱系统。
在另一示例性方面中，提供一种质谱仪装置，其包括：至少一个混合质谱仪，其包括：用于从样本产生离子的离子源；包括纳机电质谱(nems-ms)系统的第一质谱系统；包括适于根据带电粒子的质荷比来分离带电粒子的至少一个质量分析器的第二不同的质谱系统；以及耦合第一质谱系统和第二质谱系统的整合区，所述整合区包括用于可控地将离子按规定路线发送到第一质谱系统和第二质谱系统中的选定的一个或两个以用于由此分析的至少一个定向设备。
在本文为这些和其它方面提供了另外的详细描述，其中描述了混合仪器，后面是使用这些仪器的方法。还提供了仪器的另外的实施例和工作演示。
质谱仪装置和混合质谱仪
各种类型的质谱仪装置是在本领域中已知的且在市场上可买到的。参见例如massspectrometry:principlesandapplications(第三版.ed.，e.dehoffmann和u.stroobert，2007)。本书描述了例如离子源、不同类型的质量分析器、检测器和计算机、串联式质谱测定法、分析信息、碎裂反应和生物分子的分析连同其它主题。各种类型的质量分析器包括例如四极、离子阱(3d和2d)、静电阱、飞行时间(tof)、磁性和电磁、离子回旋共振和傅立叶变换(icrft)以及混合物。质谱仪器和方法的基本原理是众所周知的，包括例如样本入口、电离源、质量分析器、离子光学器件、检测器和数据处理。
在大多数情况下，质谱仪基于质荷比来测量样本或分析物的质量(如在本文中所使用的，“样本”是广义术语，并且可以包括用于电离和分析的初始样本对象以及碎裂产物样本或预先选择的样本；样本可以是简单的或复杂的、同质的或异质的)。然而，nems-ms方法还能够以非常低的荷质比来测量中性样本或离子。离子束通常用于使用质荷比来分析电离样本。计算机可以控制仪器的输入和输出，且方法和反馈过程可用于仪器和方法控制。
将多个质谱分析组合到单个分析过程中在本领域中也是已知的。例如，串联式质谱测定法或混合质谱仪是已知的。例如，在串联过程中，前体离子可以首先受到分析，且然后它被解离成片段，并且片段可以进一步被分析。在这种情况下，串联或混合质谱仪的不同部分必须被整合以一起起作用。整合可以通过根据第一原理构建新的仪器来实现，或者它可以通过使已知的质谱系统(其可能是市场上可买到的)适合于与另一个不同的质谱系统一起起作用来实现。
在这里，提供了包含第一质谱系统和不同于第一质谱系统的第二质谱系统的混合质谱仪。第一质谱系统基于nems-ms系统，而第二质谱系统基于不是nems-ms系统而是测量质荷比的不同系统。两个质谱系统需要被整合，以允许它们一起起作用。还存在整合区以组合单独的质谱系统。第一质谱系统不能简单地与第二质谱系统组合而没有具有在空间中的机械结构和体积的离散整合区。
在系统整合后，可以将一个或更多个样本引入到两个系统中以用于分析，并且可以将两组分析组合以提供单独地使用每个质谱系统不能找到的结果。整合区有助于实现在许多情况下提供协同结果的这种整合方法。
图1a和图1b示意性地图示了混合仪器的实施例，并在下文中被进一步描述。在这些图中，第一质谱系统(nems-ms)在左侧上，第二质谱系统在右侧上。这两个系统在这些图中通过整合区在中间整合。
nems-ms系统可以从在现有技术中单独地被使用而没有整合的第二质谱系统的已知的nems-ms系统得到。描述这种第一质谱系统的参考文献包括美国专利号6,722,200、7,302,856、7,330,795、7,552,645、7,555,938、7,617,736、7,724,103、8,044,556、8,329,452、8,350,578和9,016,125以及在本文引用的其它参考文献。
nems系统可以基于一个或更多个微尺度和/或纳米尺度机械谐振器(微机械和/或纳米机械谐振器)，其在受到质量变化时经历频移。这些单独的谐振器也可以被称为质量感测像素，并且可以使用单独的机械谐振器(一个质量感测像素)或这样的像素的阵列或多个这样的像素。芯片或nems芯片可以包括微机械和/或纳米机械谐振器，并且物理地和电子地与仪器的其余部分整合。特别是，在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片，其包括至少一个微机械或纳米机械谐振器(或像素)。在另一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片，其包括多个微机械或纳米机械谐振器(或像素)。可以使用谐振器阵列。
nems-ms系统可以具有低温容量或制冷以提高分辨率。各种低温冷却系统在本领域中是已知的并且是市场上可买到的。它们可以适合于与较大的仪器一起起作用。参见图1a和图1b以及下面的工作示例。在一个实施例中，nems-ms系统包括容许从300k(或更高)降至氮液化78k的温度的简单的流通低温恒温器。在另一个实施例中，可以使用容许从300k(或更高)降至4.2k的温度的液氦流通低温恒温器。可以采用用于低温冷却的上面提到的系统的变型，包括液氮、氦或其他冷冻剂的液体储存器，如提供进入类似温度范围的密闭循环系统。在另一个实施例中，可以使用至少一个稀释制冷子系统。这可以是无冷冻剂的稀释制冷机，或者可以基于使用需要定期更新的冷冻剂的储存器的早期稀释制冷系统。在另一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片、低温定位台和稀释制冷机。典型的温度范围可以范围从高于室温(约300k)降到低至2mk。使用的其他温度范围包括例如从约100mk至约室温(25℃)，或从约1k、4k、50k、78k或100k升至室温。在许多情况下，离子可以在例如约150k至250k的温度下解吸，因此有接近该温度状况的特殊重要性。在另一个实施例中，nems-ms系统包括制冷系统，其提供无载时的约8mk的基本温度和有离子负载的约15mk或更小的基本温度。
nems系统和谐振器可以适于更好地执行如本文所述的方法。例如，一个或更多个谐振器可适于分析吸附到谐振器的物质或者一个或更多个仪器子系统可被添加以用于分析吸附到谐振器的物质。在下面的第二部分中，描述了在一些情况下也可以包括对仪器的描述的各种方法。
在一个实施例中，谐振器可以适于包括至少一个表面膜，其控制例如分析物或样本的相互作用、粘附促进、粘附减少、吸附、解吸、减少电荷中和、减少表面扩散等。膜可以是薄膜，例如具有单层的厚度或例如0.5nm至1000nm、1nm至1000nm、2nm至500nm或2nm至100nm的厚度的膜。该膜可以是无机膜或有机膜。膜可以包括例如自组装单层。该膜可以从油墨的溶液沉积，或者可以被蒸汽沉积。优选的实施例可以包括富含卤素的物质，包括氟化烃，或者可选地，可以是任选地取代的烷烃硫醇单层、基于硅烷化学性质的单层，或者可选地，通过原子层沉积方法或其变形沉积的单层或多层。特别优选的实施例是任选地取代的烷烃硫醇单层。
一个实施例是多层膜，其中每个层具有不同的功能。例如，一层可以保留分析物的电荷。另一层可以提供粘附。进入的离子的电荷状态的保持和对nems的粘附力的控制可以被称为钝化。
例如，在一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片，其包括至少一个纳米机械和/或微机械谐振器，该谐振器包括适于使得当分析物被吸附到谐振器表面时避免分析物(或样本)碎裂的谐振器表面。在另一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片，芯片包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，其包括适于使分析物软着陆的谐振器表面。软着陆是本领域中已知的术语，并且在下文中使用所引用的参考文献被更多地描述。
在另一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，该谐振器包括适于使得当分析物被吸附到谐振器表面时分析物可以从谐振器表面被解吸以用于进一步分析的谐振器表面。例如，可以用第二质谱系统执行进一步的分析。在另一个实施例中，nems-ms系统适于包括与nems阵列相对的收集容器，其用于收集从nems阵列解吸的分析物。
可以通过包括热、静电或光学的各种方法来执行解吸，如下面更多地描述的。
在另一个实施例中，nems-ms系统包括至少一个nems芯片，其包括至少一个微机械和/或纳米机械谐振器，其中nems-ms系统进一步适于在分析物被吸附到至少一个微机械和/或纳米机械谐振器时对分析物进行分析。可以通过一种或多种方法来执行分析，如下面更多地描述的。更大的仪器可以包括需要在分析物存在于谐振器上时对其进行这样的进一步分析的设备。例如，如果要进行热量测定，则量热计可以被添加到更大的仪器且在第一质谱系统中。如果进行ir分析，则ir仪器可以被包括在第一质谱系统中。当谐振器仅具有吸附到它的一种物质时，该实施例是特别有意义的。
如上所述，第一质谱系统与第二不同的质谱系统整合。测量质荷比的第二质谱系统可以从已知的质谱系统得到，已知的质谱系统常常在现有技术中单独使用而没有整合的第一质谱系统。第二质谱系统的例子包括例如静电阱(开放或封闭)、四极、离子阱(3d和2d)、飞行时间、磁性和电磁、icrft和甚至可以与第一质谱系统整合的混合系统。特别是，第二质谱系统可以包括开放或封闭静电阱(est)，其包括轨道类型的est、飞行时间(tof)、傅立叶变换离子回旋共振(fticr)、四极、离子阱、磁性和电磁或混合质谱系统。
在优选实施例中，第二质谱系统是离子阱质谱系统或静电阱质谱系统，或者更优选地，第二质谱系统是轨道静电阱质谱系统。
如在本领域中已知的，捕获质量分析器是指在质量分析期间离子被电场或(在icr的情况下)电场和磁场的组合约束的质量分析器。捕获质量分析器的最常见类型是四极离子阱，其利用通过将rf电压施加到阱电极而建立的用于离子约束的实质上四极场，以及静电阱(特别是轨道静电阱)，其利用用于离子约束的静态场。
在一个实施例中，第二质谱系统包括c阱和轨道静电阱质量分析器。在一个实施例中，第二质谱系统包括四极质量过滤器。在一个实施例中，第二质谱系统包括至少一个碰撞池。在一个实施例中，第二质谱系统包括至少一个更高能量的碰撞解离(hcd)池。
描述轨道静电阱质谱系统的代表性技术文献包括例如美国专利号5,886,346、6,998,609、7,399,962、7,511,267、7,714,283、7,728,290、7,767,960、7,985,950、8,940,546和9,117,647。轨道静电阱方法和仪器提供了许多优点，包括例如良好的灵敏度、高分辨率、质量精度、空间电荷容量、线性动态范围以及相对小的尺寸和成本。它尤其依赖于特别成形的中心和外部电极。通过经由离子的移动在检测器电极上产生的瞬态信号的傅立叶变换(ft)分析来进行质量分析。虽然它以脉冲方式操作，但它可以耦合到连续的离子源。离子存储设备使这种耦合成为可能。
在一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用将离子束电气地引导到第一质谱系统和/或第二质谱系统的电气定向设备被整合在一起。使用电气定向设备的这种方法不同于例如限制的系统，其中离子束被引导到nems-ms设备，其包括谐振器以用于分析，并且如果需要，nems谐振器可以物理地远离束的路径移动，使得该束然后进入第二质谱系统。这种限制的方法在sage等人的参考文献naturecommunications(2015，doi：10.1038/ncomms7482)中被描述。在这种可选方案(限制的方法)中，离子束不使用在两个系统当中的定向或切换的选项被电气地引导，所以方法非常有限。在多功能电气定向设备方法中，根据要进行的实验，离子束可以在整个仪器中移动(如在本文所使用的，术语“离子束”表示在空间上分散的离子组，并且不应被解释为将操作限制到连续或准连续的束)。因此，sage等人的方法在束被发送到tof分析或nems分析时不允许并行或级联分析，使得tof和nems单独地进行分析。一般而言，在所获得的信息方面，在该系统与两个单独系统之间没有区别。另一个区别是，在面向波束的谐振器表面背离tof系统的情况下，sage基准受到限制。这使与谐振器相互作用的物质也由tof系统分析变得更加困难。
可以通过在本领域中已知的方法例如通过产生可用于引导束的电场来控制离子束的路径。如果需要，束通路甚至可以被反转。可以使用各种定向设备、开关设备或电气定向设备。通常描述的这样的设备包括可控(振荡和/或静态)电压被施加到其的一个或更多个电极，并且可以采取透镜、导向器和偏转器的形式。对离子运动的控制也可以通过其它方法(包括选择性地物理地阻挡离子路径的快门)来实现。定向设备在控制/数据系统的控制下操作，以使在电离源中产生的离子按规定路线被发送到第一质谱系统和第二质谱系统中的选定的一个或两个以用于根据期望技术进行分析。例如，可以操作定向设备以同时将离子按规定路线发送到第一质谱系统和第二质谱系统，使得离子群体的部分同时通过nems和常规质谱测定法进行分析。在其他例子中，可以操作定向设备，使得在第一质谱系统和第二质谱系统中例如首先在nems分析器中且然后在轨道静电离子阱(或其他质量分析器)中串联地分析离子。定向设备还可以被操作以将(例如，通过对选定物质的程序性解吸)从nems分析器返回的离子按规定路线发送到轨道静电离子阱以用于分析，或者发送到碰撞池或其它解离区以用于产生产物离子。在某些实施例中，定向设备可以执行质量选择性或质量鉴别功能，使得具有第一范围的m/z值的离子按规定路线被发送到第一(nems)质谱系统，而另一范围的m/z值的离子按规定路线被发送到第二(轨道静电阱)质谱系统。可选地，定向设备可以适于基于不同的离子特性或性质例如迁移率来执行鉴别或分离功能。定向设备可以以数据相关的方式操作，其中它的操作的状态由在一个或两个质谱系统处实质上实时地获得的结果确定，其中nems可以用于不仅测量质量而且还有形状和如下所述的其他特性。
可以通过允许离子束进入质谱系统中的一个或两个的各种方法和设备进一步实现两个质谱系统的整合，其包括整合区和电气定向设备，但是在一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用离子光学器件被进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用至少一个四极、至少一个孔和至少一个离子透镜被进一步整合。在另一个实施例中，整合区包括至少一个四极、至少一个孔以及至少一个静电透镜和可选地一个或更多个偏转器、中性物质过滤器或隔离阀。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用至少一个z透镜的堆叠被进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用至少一个静电束快门被进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用至少一个中性物质过滤器被进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统使用顺序级的差动泵浦被进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统与包括传递室和离子光学器件的系统接口进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统与包括至少一个传递四极和至少一个静电透镜组件的系统接口进一步整合。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统与适于在两个系统之间引导离子束的系统接口进一步整合，该接口包括至少一个四极、至少一个孔和至少一个离子透镜。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统与适于在两个系统之间引导离子束的系统接口进一步整合，该接口包括用作静电束快门和中性物质过滤器的中间z透镜堆叠。
在另一个实施例中，第一质谱系统和第二质谱系统适于操作并且在不同的真空和压力下进行操作。例如，第一质谱系统与第二质谱系统相比可以适于操作并且在更高的真空、更低的压力下进行操作。
在另一个实施例中，第一和第二质谱系统进一步与至少一个涡轮泵整合。
在另一个实施例中，第一和第二质谱系统进一步与至少一个系统隔离闸阀整合。
最后，提供了对本文所述的新型混合仪器背后的基本原理和需要的额外描述，其中nems-ms(第一质谱系统)与第二质谱系统整合，如在美国临时申请62/107,254中所述的。
质谱测定法的现有技术通常导致质量分辨率随着分析物质量m的增加而降低。因此，对大的复合物(例如，大于200kda)的测量需要广泛的系统修改，并且仅在定制的系统中实现。然而，即使在这些系统上，基于电荷的测量也会随着分析物大小的增加而导致质荷比的增加的扩展(参见图4、美国临时62/107,254和参考文献6)。相比之下，nems-ms容易适用于具有高于几百kda的质量的分析物。重要的是，纳米机械系统的质量分辨率δm仅取决于频率噪声，因此，质量分辨率m/δm实际上随着分析物质量的增加而增加[4]。
利用现有的方法和仪器，在复杂样本中对物质的识别可能很困难[62-64]。由基于电荷的方法产生问题，常规质谱测定法用于分析物运输、分离和检测。去卷积多个电荷状态常常需要使用高度提纯的样本[65-67]。与加合物形成相关的问题[67]也导致峰加宽，这降低了质量分辨率。nems-ms是中性分析技术[68]；因此，它可以避免与电荷状态去卷积有关的问题。纳米机械质谱测定法分析复杂样本的能力仅受到技术的质量分辨率限制，该技术本身与分析物的电荷无关。因此，nems-ms可以提供复杂混合物的增强的辨别。直接从细胞裂解物获得蛋白质组谱(在生命科学和医疗应用中很重要)(例如参见下面的应用4)将通过对纳米机械设备技术的持续改进来增强，使质量和尺寸分辨率的越来越高的水平成为可能。
常常与质谱测定法结合的用于尺寸测量的最常用的技术之一是离子迁移谱测定法(ims)。参见例如lanucara等人的nat.chem.(6,281-294(2014))。ims提供了如从它们的迁移率推断的分析物大小的度量，其通过与背景气体的碰撞来设定[69-71]。虽然强大的技术产生关于蛋白质复合物的旋转平均结构信息[72]，但ims并没有按比例缩小到单分子分析。在这个背景下，对分析物的异质整体的测量可能使有关特定实体的详细信息模糊。另外，常常用于这种测量的串联系统与由基于芯片的纳米机械技术提供的高吞吐量方法不太兼容，其中每秒最终可以测量数千个分析物。虽然ims可以与本文描述的实施例整合，但nems-ms惯性成像方法可以提供优于ims的优点。
纳米机械分子分析在其测量分析物质量、大小和分子形状的新方法中是独一无二的。该技术通过对粒子质量、大小和形状的直接的基于惯性的测量来操作，与如在常规方法中的从质荷比或碰撞横截面间接推断质量或大小相反。特别重要的是，本方法独特地实现了单分子测量，当实体顺序地吸附在nems上时，上述分析物属性被实时地测量。
在优选实施例中(参见下面的工作示例)，低温冷却的nems-ms系统(第一质谱系统)与例如混合四极轨道静电离子阱质谱仪(第二质谱系统)整合。在这种新的混合仪器中，质量分辨率、质量动态范围、分子信息和分析物吞吐量将大大提高。该系统的基础温度(其在一个实施例中可以在降至液氮或液氦温度下操作，或者在另一个实施例中可以在降至低毫开尔文状况(无载时<8mk；有离子负载时约15mk)下操作)对于提高新仪器的质量分辨率很重要，如下所述，尽管nems也可以在室温一直到环境温度及之上使用。
nems-ms和例如轨道静电阱ms的整合不仅仅是市售仪器的级联。需要定制离子光学器件的系统以允许带电的蛋白质复合物在这些系统之间被改组(而没有损失)从而允许多个连续的分析阶段。在图1a和图1b中，显示了整合的nems轨道静电阱系统的概念和功能示意图。
在优选实施例中，新仪器有四个主要部件：i)轨道静电阱质谱仪，ii)系统接口，iii)低温冷却的nems阵列分析台，以及iv)低温冷却系统(其可以是基于冷冻剂的或无冷冻的冷却系统，包括基于稀释制冷的冷却系统)。
在优选实施例中，轨道静电阱质谱仪在与系统接口和低温冷却的nems-ms子系统整合之后将保持独立的、完全可操作的质谱仪。轨道静电阱质谱仪能够通过hcd(更高能量碰撞解离)池发送和接收电离的蛋白质和其他生物复合物。通常描述的轨道静电阱质谱仪包括用于从样本产生离子的电离源、用于将离子传递到四极质量过滤器的一组光学器件、用于通过解离由四极质量过滤器选择的前体离子产生产物离子的碰撞池和轨道静电阱(由thermofisherscientific在商标“orbitrap”下销售)，其用于根据前体和/或产物离子的质荷比(m/z)来分离前体和/或产物离子并获得代表在不同值的m/z下的离子丰度的质谱。由朝着静电阱入口凹陷地弯曲的电极形成的离子阱(被称为“c-阱”)起作用以从四极质量过滤器或碰撞池收集离子，并将累积的离子注入到静电阱中用于分析。具有上述结构的仪器在商标“qexactive”下在市场上从thermofisherscientific可得到。
系统接口被设计成实现这种分子交换；这通过约1mm直径的离子束促进，该离子束允许在轨道静电阱质谱仪和nems阵列级之间使生物分子离子穿梭来回移动。分析物在第一质谱系统和第二质谱系统之间由系统接口中的离子光学器件引导，该离子光学器件包括例如四极、孔和离子透镜。另外，具有弯曲离子轨迹的中间透镜堆叠(z-透镜)可以用作静电束快门和中性物质过滤器；后者对于最小化nems传感器的不需要的污染尤为重要。
在优选的实施例中，hcd池在约10-4托的相当高的压力下操作。系统接口提供顺序级的差动泵浦，以在低温端处保持<10-9托的极限真空。类似地，系统接口内的冷却部件减少进入冰箱的热辐射。nems阵列分析台容纳nems芯片及其近侧电子器件和光学器件，并允许相对于离子束的计算机控制的定位。低温冷却系统可由各种制造商获得，或直接被制造。在降到液氮或液氦基本温度工作的冷却系统可以容易被配置为水平地操作，简化了系统架构(目前的市售系统之一是例如来自janisresearch的那些系统)。也可以制造可以在市场上购买的稀释制冷机系统(例如，来自bluefors)，以水平地操作。这种稀释制冷系统与通常用于现代低温物理学研究的稀释制冷系统非常相似。在各种实施例中，非常小的开口作为定制修改被安装以允许将离子束引入到样本台内。以前已经证明了这种修改[73]。可以设计修改，并且来自离子束的热负荷似乎是可以容忍的。当被正确屏蔽后，nems传感器可以从基本温度稍微加热到小于20mk。光学器件(光纤)和电气(过滤的低频、大电流和rf电缆)的测量连接可以安装在稀释制冷机中。这些将为nems阵列提供必要的激励、控制和读出。阵列内的单独nems设备可以被光学地和电气地致动和检测。光学询问涉及在1550nm附近的可调谐激光源、光纤耦合器、相位调制器、偏振器、光电探测器等。这些都是在系统接口中的子部件。如所必要的，可以使用电子仪器，诸如网络分析器、频谱分析器、信号发生器和低噪声放大器。最后，可以使用用于数据采集和仪器控制的计算机。
最后，仪器的另一部分是包括离子源的使用的样本引入。在本领域中已知的方法可用于将样本引入到混合仪器中，并且该仪器适用于这种引入。通常，样本从在大气压下的仪器外部被引入到仪器内部上的真空内(需要大气-真空接口)。可以使用软电离方法。例如，一种方法是电喷雾电离法(esi)。可以使用纳米喷雾方法(例如，nesi)。可以使用静态纳米电喷雾电离。可以使用镀金毛细管。可以使用基于芯片的电喷雾电离技术。此外，可以使用多孔板机器人装载机(例如，advionnanomate)。样本引入可以涉及与其他分析方法(诸如色谱分析法)的整合。可以使用基质辅助激光解吸/电离(maldi)。此外，可以使用激光诱导液珠离子解吸(lilbid)。
在一个实施例中，质谱仪适于将外部样本引入到第一质谱系统内以及还将外部样本引入到第二质谱系统内。在另一个实施例中，质谱仪适于将外部样本引入到第一质谱系统内。在一些情况下，第二质谱系统将不适于样本引入。在另一个实施例中，质谱仪适于将外部样本引入到第二质谱系统内。在一些情况下，第一质谱系统将不适合样本引入。
如在本文使用的，术语“离子”应被解释为包括任何带电粒子，对其的分析可以使用本文所述的nems-ms仪器来实现。更具体地，术语“离子”应该被认为包括可以照惯例不被认为构成离子的非常高质量的带电实体(生物或其它方面)，例如带电聚集体、dna、rna和病毒，因为该术语通常在质谱测定法和相关领域中被使用。一旦在仪器内，样本和离子束就可以在第一质谱系统和第二质谱系统之间的任一方向上被引导。例如，第一质谱系统可允许对样本的预先选择以用于由第二质谱系统分析，而第二质谱系统可允许对样本的预先选择以用于由第一质谱系统分析。
可以将各种样本引入到仪器内并用本文描述的仪器和方法被分析，包括例如生物分子、生物分子复合物和生物机器，包括细胞器官。可以评估高分子量和复杂性的样本。样本可以是例如大分子、蛋白质组装、抗体复合物、膜蛋白质、完整的细胞器官(例如核糖体、蛋白酶体等)、病毒和病毒子组分(例如衣壳)。样本可以是肽、蛋白质、各种类型的核苷酸、寡核苷酸、各种类型的糖、寡糖和代谢体分子。
样本分子量可以是例如低分子量或高分子量，诸如例如100kda至100mda，或甚至更高，诸如例如100kda至500mda。例如，分子样本的大小可以在直径上是1nm至100nm。参见例如j.snijder和a.heck的“analyticalapproachesforsizeandmassanalysisoflargeproteinassemblies”(annu.rev.anal.chem.,2014,7；43-64)。
当然，仪器可以用计算机硬件和软件被控制，包括如在本领域中已知的用户界面。
在本领域中已知的方法可用于组装仪器。例如，工作示例描述和说明了组件的各个部分。
使用混合仪器的方法
当然也提供了使用本文所述的仪器的方法。特别是，提供了一种方法，其中样本被引入到装置中并在第一质谱系统和/或第二质谱系统中受到分析。在许多情况下，需要使用两个质谱系统进行分析以提供整合的好处。然而，也可以适应并使用仪器，其中仅使用两个质谱系统中的一个。
在一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中并行地受到分析。在另一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中顺序地受到分析。
在一个实施例中，在全质量范围模式下，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中并行地受到分析。在另一个实施例中，样本在第一质谱系统和第二质谱系统中用质量过滤器逐步通过不同m/z比并行地受到分析。
在一个实施例中，样本受到碎裂。
在一个实施例中，该方法用于测量溶剂化程度。
在一个实施例中，样本在存在于nems-ms系统的谐振器上时受到另外的分析。
在一个实施例中，使用该仪器的分析包括单分子分析。
在一个实施例中，使用仪器的分析是天然单分子分析。
在一个实施例中，在天然条件下引入样本。
在一个实施例中，分析包括惯性成像。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在nems阵列上，使得覆盖≤每nems像素1个复合物。在另一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在nems阵列上，使得覆盖≤每nems像素1个复合物。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在nems阵列上，使得覆盖≤每nems像素1个复合物，其中每个所吸附的物质受到分析。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在nems阵列上，使得覆盖>每nems像素1个复合物，其中随后对形状的基于机械的惯性成像用于识别所吸附的物质的多样性，并且提供它们的单独特征化。
在一个实施例中，样本是异质样本，并且异质物理吸附出现在nems阵列上，使得覆盖≤每nems像素1个复合物，其中每个所吸附的物质受到程序性解吸，后面是对所解吸的物质的进一步分析。更具体地，可以描述用于程序性解吸的四步骤过程。第一步骤包括使用分析物电离将异质样本注入(例如通过电喷雾注入)到混合系统中。第二步骤包括异质物理吸附到第一质谱系统的nems阵列上，其中覆盖是每nems像素一个或更少的复合物。第三步骤包括通过在nems阵列上时的分析来识别和层化每个所吸附的物质，其中可以选择一些复合物用于在其他复合物之前解吸。第四步骤提供分层分子物质的顺序的程序性解吸，后面是在第二质谱系统中的进一步分析，包括可能的解离分析。
参考示出了优选实施例的图1a和图1b提供了使用方法的进一步描述。在图1b中，离子在大气压下优选地在天然条件下由纳米喷雾源产生，通过大气至真空接口输送到真空中，任选地通过四极质量过滤器选择质量，且然后通过如在本领域中已知的质谱仪获得质谱。在这种情况下，使用轨道静电阱质谱仪，但可以使用其他类型，如飞行时间(tof)、开放或封闭静电阱(est)、傅立叶变换离子回旋共振(fticr)仪器。可以根据质谱(其如前所述记录作为质荷比的函数的离子强度)、在一些情况下通过在质谱测定技术中可用的标准电荷状态去卷积技术来确定分析物的分子质量。
当在质量物质中几种相似的电荷分布重叠时，特别是当强度相差一个数量级或更多时，去卷积变得复杂。这样的样本的例子是抗体聚集体(n-聚体的混合物，其中n＝1,2,3...)或异质病毒衣壳(从遗传学角度或由于病毒性货物中的差异，如在例如j.snijder等人的“definingthestoichiometryandcargoloadofviralandbacterialnanoparticlesbyorbitrapmassspectrometry”，j.am.chem.soc.，2014,136(20)，第7295-7299页.doi：10.1021/ja502616y中所示的)。对于这种复杂但典型的情况，可以与在质谱仪上的质谱并行地或顺序地在nems设备或这种设备的阵列上收集分析物质量的直方图。nems直方图的峰值可以用作用于拟合质谱以减少峰值分配的模糊度的第一近似。这种并行采集可以在全质量范围模式下或使用逐步通过不同m/z比的四极质量过滤器来完成。虽然ms将只示出一个峰值，但nems将获取可能具有与所选择的m/z相对应的不同质量的直方图。通过在感兴趣的整个质量范围内扫描，即使小组分也可以被去卷积和定量。除了上面所述的直方图方法之外，还可以利用其他合适的统计方法来识别用于拟合来自使用nems获取的一个或更多个测量结果的质谱的最可能的分子质量。
此外，nems设备还可用于测量分析物分子的片段，其中碎裂通过例如与在碰撞池中的气体的碰撞、电子或离子促进的方法如电子捕获解离、电子电离解离、电子转移解离等或通过任何波长下的光致解离例如ir或uv来实现。重分析物的主要问题之一是去溶剂化的质量，因为在许多情况下，即使在源和碰撞池中的能量碰撞之后，溶剂的一些分子和碱离子依然被吸附到分析物。在这方面中，nems例如通过用数百或甚至数千伏特将分析物离子加速并使它们撞击在谐振器表面上来提供可能的最强去溶剂化机会。尽管分析物离子很可能碎裂，但它将是最弱的结合配体，其将首先会破裂，并且更可能被转移到气相中，从而仅留下分析物并允许测量它的“干”质量。在这个“干”质量和通过ms测量的质量之间的比较允许校正ms的质量测量结果并建立溶剂化程度。
一个实施例涉及数据相关的逐像素解吸。在同一装置中，更先进的方法涉及从包含例如101-106个协调操作的nems谐振器(或也许更多)的整合nems阵列读回数据。如在现有技术中所示的，每个谐振器的检测可以在毫秒或亚毫秒时间尺度上完成。为了每nems谐振器加载少于一个离子，入射离子束可以被电透镜扫描以在nems阵列的整个表面上扩散离子。
离子可以在所谓的“软着陆”模式中沉积在谐振器上，使得(优选地，在不超过20-100v的加速之后)避免它们的碎裂，并且它们变得仅与表面弱结合。离子-表面相互作用事件的结果取决于例如分析物的结构和稳定性、表面的性质及其入射动量。选择隔离涂层厚度以在离子驻留在其上的持续时间期间将到下层表面或设备的电子转移最小化并避免离子电荷的实质性中和。优选地，可以使用自组装单层(sam)或富含卤素的膜作为这种隔离涂层。例子是由用cf3(fsam)、ch3(hsam)等为端基的癸硫醇组成的sams。涂层还可以帮助控制粘附能量以用于解吸。
在检测之后(优选地，在毫秒或亚毫秒时间尺度上)，可以从nems阵列上的所有离子的整个异质集合中识别出一组相同的高质量、完整的感兴趣物质。这些预选的相同和仍然带电的物质可以然后以大到足以超过随后的自上而下ms分析所需的检测阈值的数量例如使用轨道静电阱ms同时从nems表面程序化地被解吸。可选地，它们然后被运输回到碰撞池中，并且可以受到随后的更高能量碰撞诱导解离(hcd)或其他碎裂方法，后面是自上而下ms分析。
可以采用任何已知的局部(逐像素)解吸方法或其组合。例如，可以使用激光诱导解吸(包括诸如激光诱导声解吸liad的方法)或使用到谐振器的现有连接和/或电加热的静电解吸。可选地，可以利用采用超声波的方法。
关于该仪器的使用的另外的实施例在临时申请62/107,254中被描述并且在下文中更多地被描述，包括所引用的参考文献。
蛋白质复合物的天然质谱测定法和单分子天然质谱测定法
天然质谱测定法是本文描述的仪器和方法的重要应用。大多数生物过程涉及在多个分子伴侣之间的在空间和时间上的已调整的合作。更具体地，蛋白质与许多分子实体(包括其他蛋白质、核酸和小分子配体)相互作用以形成功能性分子复合物。蛋白质复合物和相互作用的蛋白质的网络的研究在生命科学中呈现越来越大的重要性，如表征蛋白质与核酸、辅因子和信使分子的相互作用一样。达到对生物过程的分子级理解首先涉及构成这种复合物的子组分的结构和功能表征，以及然后理解它们如何相互作用以在总聚集体中实现关键的生物功能。当然，这种分子复合物通常不是静态的；它们处于恒定的通量中，并且它们的子组分可以在生物活动期间动态地被交换[15]。
在这个背景下，出现了“天然”质谱测定法(天然ms)的领域。它的焦点在于测量来自非变性溶液即来自在很大程度上保持其天然形态和功能的制剂的完整蛋白质和蛋白质复合物[15]。“天然质谱测定法是一种新兴技术，其允许对具有高灵敏度和理论上无限制的质量范围的完整蛋白质复合物进行拓扑研究。这种独特的工具向结构生物学中的已建立的技术提供补充信息，并且还提供高通量原子间研究的链接，这些研究本身不产生关于精确蛋白质复合物组成、结构或动力学的信息”。[16]
然而，实现天然ms的目标并不一定是直接的；蛋白质复合物与高比例的非共价相互作用组合。然而，尽管有它们的表面不稳定性，具有>1mda的质量的蛋白质复合物已经通过天然ms即从气相被成功地测量。然而，为了从天然ms获得有意义的结果，非常仔细的样本制备(常常包括使弱相关复合物稳定的措施)和温和的分析条件(以最小化复杂碎裂)是关键。
天然ms的应用是巨大的，并且许多这样的应用可以与本文描述的方法和仪器相联系。例如，它已被用作用于筛选小分子化合物混合物以识别低至中等亲和配体的工具[17、18]。筛选数百万种相互作用的化合物以把特定的蛋白质作为目标对于开发新药物至关重要。这些可涉及具有超过1mda的质量的抗体同种型。天然ms还可以提供对结构生物学重要的关于拓扑和动力学的信息；例如，配体结合部位的位置和性质[19-22]以及关于膜蛋白复合物的信息[23]。
相比之下，涉及分子解离以及随后对所得到的分子片段的分析的现有技术的自上而下ms可以产生单体蛋白质的序列和标识信息，但提供用于分析大的非共价蛋白质复合物的有限适用性。在某种程度上，这个限制是有帮助的：(大于100kda的)大的蛋白质复合物的测量对常规ms系统很难。
然而，现有的ms系统也通常没有足够的灵敏度来解决单独蛋白质复合物，因此需要纯化以产生分析物的同质群体。否则，对典型实验的所需尺寸的样本的分析将一定含有蛋白质复合物的异质群体；这些将在不同组装的复合物(混合而不是层化样本中存在的各种物质)中产生“平均”。
离子迁移谱测定法
离子迁移谱测定法(ims)可以整合到本文所述的方法和仪器中。ims是用于基于分子在载运缓冲气体中的迁移率来分离和识别气相中的电离分子的分析技术。涉及与背景气体的碰撞的分离机制通过它们的(旋转平均)碰撞横截面来区分分析物。当与质谱分析相结合时，ims提供了增强生物分子物质的表征的附加水平的信息，特别是在高质量大分子复合物的情况下。例如，结合到生物分子复合物的配体有时可以引起影响复合物的碰撞横截面的构象变化，并且这些变化可以通过离子迁移率测量被监测[24]。也可以使用ims来监测在配体结合时复合物的稳定性的变化。为了促进这个，离子被存储在离子捕获区域中，其中它们经历离子激活(例如加热)，其用于使复合物不稳定并增加离子迁移率漂移时间；由于增加的稳定性，配体结合可以减小这个效应[15]。在这两种情况下，ims对监测或发现当复合物处于其天然状态中时出现的复合物-配体相互作用是有用的；此类信息不能以另外的方式得到。
单分子纳米机械质谱测定法：
在过去十年中，使用纳米机械设备的质量测量系统地被改进到现在它们提供新形式的质谱测定法的能力的点。nems谐振器对所吸附的粒子的增加的质量非常敏感[25-30]，且这导致包括单个蛋白质[4、31]、纳米粒子[32]、大生物分子[33、34]和单独原子[35-38]的质量检测的发展。在概述用于使用基于nems的实验系统来执行单蛋白质质谱测定法的能力的现有技术中描述结果(参见[4])。
在所开发的实验方法中，nems设备或设备的阵列被放置在被冷却到环境温度之下的真空室中，并且它的频率使用灵敏电子(锁相)控制回路被连续跟踪[4]。使用来自常规质谱测定法的方法，生物分子顺序地被递送到nems设备，并且由单分子事件引起的诱导频移对两种模式被测量并用于推断吸附分析物的质量和位置[4]。使nems冷却增强了到达的分析物在设备的表面上的非特定物理吸附。临时申请62/107,254的图1a示出了由单分子事件在nems谐振器的前两个位移机械模式中引起的时间相关频移的示例原始数据。
通过单独地测量顺序地到达的粒子的质量，可以构建表示整个异质样本的质谱，如在临时62/107,254的图1b中看到的。在这里，落在设备上的每个igm分子出现为高斯状质量分布。随着随后的分子落在设备上，每个分子的质谱可以加在一起(如果需要的话)，以形成表示整个样本的复合谱(临时62/107,254的图1b，黑色曲线)，但是nems-ms分辨它的内在组分。
在过去十年中，已经构建了几个用于执行基于nems的质谱测定法的实验系统。用于获取在临时62/107,254的图1中所示的igm数据的一个桌上型系统使用电喷雾电离(esi)和离子光学器件来将单独的分析物离子引导到nems传感器上。该设置由esi系统组成以将蛋白质离子发射到三个连续的差动泵浦真空室中。分析物沿着其轨迹由六极离子导向器运输，并最终传递到nems分析台。流式低温恒温器用于冷却该台以使分析物到nems传感器上的物理吸附稳定。完整的系统细节可以在[4]中找到。
单分子惯性成像
惯性成像有点类似于ims，但提供在没有旋转平均的情况下进行单分子分析的增强的能力。惯性成像是最近开发的一种新的基于nems的技术，其当单独分析物吸附到纳米机械谐振器上时实时地和以分子尺度分辨率提供在单独分析物内的质量的空间分布[39]。通过连续地监测纳米机械设备的多个振动模式，可以在单独分析物吸附时一个一个地对单独分析物推断出质量分布的空间矩。使用在实验上获取的多模频移数据并通过有限元模拟验证惯性成像，以允许对单独分析物的惯性质量、吸附位置和分子形状的分析[39]。成为惯性成像的基础的数学形式的细节可以在[39]中找到。简而言之，当分析物落在纳米机械谐振器上时，它的每个振动模式响应于所附着的(微小)“负载”而不同地频移。然后这些不同的模态频移的整体可以用于产生分析物的质量密度分布的矩；推断出n个矩需要在最少n+1个模式中测量诱导偏移。该方法被称为惯性成像，因为它能够例如通过采用pearson分布法[40](临时62/107,254的图2)来根据所推断的矩重建分析物的空间质量密度。
nems阵列实现对完整、大质量物质的吸收性多价螯合和识别
通过特别准备nems质量感测像素的表面，启用(下面所述)“软着陆”物理吸附。这些特殊表面保持分析物的电荷状态和分子构型，同时允许单分子质量测量和惯性成像。可以调整入射分子束通量，以允许每个像素至多一个分析物降落。可以确保这些单独的分析物的物理吸附(即，使它们在单独像素上螯合)，因为像素的环境温度将远低于入射束的有效温度，并且分析物的动量可以被调整为恰好足够克服表面势垒。因此，nems阵列可以用于螯合并且然后表征单独分子。
一旦被加载，单独像素就可以程序性地被卸载。这允许来自原始异质样本的特定子群体(“层”)的分析物特定“预浓缩”，以达到足以超过例如轨道静电阱ms检测阈值的量(从几个到十个或更多个单独分析物)。
“软着陆”技术保持完整的被吸附物
在优选实施例中，在本文中描述了与自上而下轨道静电阱ms连接的新混合形式的单分子nems-ms分析。实现这一点涉及将大的生物分子复合物沉积在固体表面上，同时保持其结构和电荷状态。在低平动动能(<100ev)——从热跨越到超热状况(见美国临时62/107,254的图3和参考文献5)——下物质的沉积可以导致三个竞争过程：(i)解离着陆，在此期间分析物片段及其组分保留在表面上；(ii)反应着陆，其中在离子和表面之间形成共价或强的静电键；以及(iii)软着陆，其中物质着陆并保持完整，同时变得弱结合到表面[47]。离子-表面相互作用事件的精确结果取决于分子的结构和稳定性、表面性质及其入射动量[47]。虽然小分子(约100da)常常展示低于10ev的解离[48]，但研究报告非常大的复合物的完好着陆，这些复合物显然能够在它们的大量内部自由度情况下在内部吸收碰撞能量。例子包括水稻黄斑驳病毒和烟草花叶病毒(分别为62mda和40mda)[49]、包括溶菌酶胰蛋白酶的各种酶[50]、以及蛋白质复合物groel和脱铁铁蛋白(800kda和440kda)[51]。在这些研究中，完整的着陆证明是鲁棒的，其中病毒保留其感染性，并在再水合时酶保持其功能；观察到groel和脱铁铁蛋白保留其结构，大体上与它们在碰撞之前的平动动能无关。
在完整着陆过程中，当离子上的官能团与官能化表面上的端基相互作用时，反应着陆出现[52]；然而，如果特定的反应性官能团不存在，则所吸附的分析物将仅被弱结合，且因此可以被归类为经历软着陆。软着陆事件可以根据离子是否被中和或在与表面碰撞时是否保持其电荷而被进一步分类。
分析物电荷中和是对分析物到干净导电衬底上的吸附出现的主要过程。相反，可以通过用薄的电子惰性有机膜预涂覆这样的衬底来促进电荷保持[53]。
在该类别中的常见膜包括例如由以cf3(fsam)、ch3(hsam)或cooh(csam)为端基的癸硫醇组成的自组装单层(sam)。电荷保持的程度强烈地取决于所用的特定膜和进入的分析物的动能。当正离子碰撞在处理过的表面上时，fsam有效地保持电荷，hsam很弱地保持电荷，以及csam完全中和电荷[54]。由于它的功效，fsam用于证明在从小的多原子化合物[48、55]到多肽[54]的各种(带正电的)分子离子的软着陆后的电荷保持。
对于单质子化肽，在fsam改性表面上软着陆时，电荷保持非常稳定；然而，当与表面相互作用时，一小部分带电的肽立即被中和，与剩余离子相关的电荷仅在肽的缓慢热解吸期间离开表面[56]。多重质子化的肽展现内部库仑排斥，并且这通过与sam交换一些质子来促进额外的电荷衰减；然而，当质子交换的过程具有几个小时的时间常数时，电荷保持在短时间框架内保持鲁棒[56]。
对异质样本内的预选“层”的程序性解吸
通过控制离子通量，可以向nems阵列中的像素加载最多一个分析物。这将允许对高质量完整物质的整体的积聚和识别。随后，来自该异质集合的相同物质的预选等分试样可以以大到足以超过例如随后的自上而下轨道静电阱ms所需的检测阈值的量来同时从nems表面程序性地被解吸。这种预选过程涉及首先将单个分析物“软着陆”吸附到单独的质量感测像素上，后面是一小组“相同”分子的程序性解吸，然后运输回到hcd池中以用于随后的碰撞诱导解离(cid)和自上而下轨道静电阱-ms分析。
可以采用和优化解吸方法的组合。在过去通过光栅uv激光束对nems-ms解吸应用激光诱导声解吸(liad)方面有重大的成功[57]。引起带电分析物的受控(程序性)解吸的额外方法将涉及允许局部(逐像素)静电解吸和加热的新nems设备实现。
重要地注意到，实际上，自动预选择协议取代了用于异质样本的纯化协议，其是通过用于每个特定分子目标的费力和时间密集的手动协议开发的。在这里，它们通过单分子测量和随后的选择而被自动化。这种方法很适合于层化稀疏和珍贵的样本。该实施例基本上是用于初步质谱测定法的最近的技术的单分子变型。
通过轨道静电阱hcd池(作为第二质谱系统)的随后的解离分析
解吸的现在同质的样本等分试样可以由离子光学器件运输回到第二质谱系统(例如，如在工作示例中所示的轨道静电阱系统)，其中可以在样本群体内的大分子量物质的单独层上执行解离的自上而下蛋白质组学。可以使用轨道静电阱系统对cid的固有能力或通过修改新的混合系统以在轨道静电阱ms之前实现表面诱导解离(sid)来进行自上而下的后nems蛋白质组学分析。sid最近被证明对使高质量复合物和物质碎裂非常有效[58]。因此，可以使用诸如sid、cid和uv光致解离(uvpd)的方法来分析样本。蛋白质测序可以作为样本分析的一部分被执行。
上面概述的总协议在常规实现中避开对天然ms——它的趋向而产生的主要异议，以在异质样本群体中平均化。可调整所输送的物质的数量，以超过轨道静电阱分析的检测阈值(通常约3至数十个高质量实体)。应该注意的是，轨道静电阱仪器本身被特别修改，以允许分析高达约40000的m/z比，并且能够实现多电荷离子的单分子灵敏度。在高质量物质的约100e-的典型esi产生的电荷状态的情况下，完整物质的分析范围约为4mda[59、60]。相比之下，nems具有单分子灵敏度，并且提供大大增强的上质量范围，最终仅由分析物必须容纳在质量感测像素本身的物理尺寸内的要求限制到许多gda。还应该注意的是，nems像素本身可以被配置为单独地测量所吸附的物质的电荷，除了测量它们的总质量和获取它们的惯性图像之外。在以前的工作中，证明了基于nems的静电计的提供亚单电子电荷检测灵敏度的能力[61]。
四个具体应用：
一些额外的、有代表性的但特定的应用包括例如(1)获得许多病毒衣壳及其组装过程的详细结构信息；(2)抗生素敏感性的无标记和快速评估的新方法，(3)trop2表面蛋白质的研究；以及(4)由药物结合引起的膜蛋白质构象变化的研究。
应用1.存在许多病毒衣壳的详细结构信息，但是由于它们的固有异质性和典型样本的复杂性，关于它们的组装过程知道得很少。例如，t4噬菌体内的包装马达(packagingmotor)由十二聚体门户蛋白gp20以及小和大的末端酶蛋白gp16和gp17组成[1]。当被纯化时，gp16被随机降解成gp169-164。在这个阶段，gp16和gp169-164都能够与gp17寡聚体化，且这导致显著的异质性，其由于多重重叠的电荷状态而防止通常获得的m/z谱的去卷积。因此，对组装过程例如确定gp17的化学计量的详细分析对目前的技术是不可能的[2]。部分蛋白质降解在病毒组装的中间阶段很常见；例如，它也通过在尾端因子gp4与p22噬菌体中的gp1门户复合物(portalcomplex)的合并中的峰分裂被观察到[3]。nems-ms极大地提高了这种实验的分辨率，因为它不是电荷敏感的(将没有重叠的电荷峰)，并且对于高质量物质具有高分辨能力。
应用2.已知抗生素的几乎一半以细菌核糖体作为目标；它们通过阻止新的核糖体蛋白质的转化而起作用[7]。这导致更小的、不完全的组装的前体单元的积累，该前体单元在质量上与完全组装的单元相差150-200kda[8]。电子显微镜显示这些前体单元是高度异质的[8]。这通常使通过天然ms进行的质量去卷积模糊。然而，由于nems分析仅基于分析物的惯性质量，单分子nems-ms能够直接分析这些复合物。可以提供一种用于对抗生素敏感性的无标记和快速评估的新方法。
应用3.trop2是牵涉几种癌的表面蛋白质[9-14]。具体地，trop2通过调节性膜内蛋白水解(rip)来诱导癌性表型，其中膜蛋白质在其跨膜域内被切割，以产生细胞内蛋白质片段，其以诱导癌症的另外的细胞信号传导网络作为目标[41-43]。然而，trop2的胞外域和细胞内片段以及它们的组成的最终命运仍然是开放的问题。trop2是对在癌发病机理中涉及的细胞信号传导和调节过程重要的多种膜蛋白质的特定例子[44]。由于来自具有高电离效率的脂质的干扰，这类蛋白质特别难以用常规的质谱测定法进行研究[16]。可以提供用于测量的样本，包括从位于肿瘤内的特定细胞获得的非常小的量。可以测量纯化的trop2样本(整个和分段)，以表征它们的结构亚组分。还可以从血清中分析trop2，以确定可能与它结合的其他复合物和它们的分解途径。这些测量可以通知trop2片段作为用于诊断或治疗的潜在生物标志物的使用。
应用4.除了实现完整的质量测量之外，惯性成像还可以实现粒径谱的编译，产生比从离子迁移率测量获得的旋转平均碰撞横截面多得多的信息。可例如在从药物结合引起的膜蛋白质构象变化的研究中使用这种技术。作为例子，(atp)-结合盒(abc)膜转运蛋白p-糖蛋白(p-gp)非特异性地将异种毒素泵送出细胞，并且牵涉在化学治疗中的多重耐药性的获取[45]。离子迁移率测量表明，当与环孢霉素a和atp结合时，在p-gp的两个构象之间的平衡移动；这提供了用于监测药物结合的效应的途径[46]。然而，通过ims从这些复合物中除去脂质所需的高碰撞能量严重降低了它的分辨率，且目前的仪器只允许平均碰撞截面的大约10％的主要构象变化的确定[24]。以前的测量已经通过天然ms和离子迁移率ims实现，但只有几个主要构象变化可使用现有仪器解决[46]。与提供了旋转平均碰撞横截面(ccs)的ims相比，nems惯性成像提供单独分子的形状分析。这直接提供非平均的信息以阐明分子大小的分布，以产生出现的构象变化的更详细的图片。
表1提供了大分子目标的例子。
表i.大分子目标的例子
仪器和方法的应用
仪器和使用方法可以找到很多应用。质谱测定法的分析应用广泛扩展，且它们中的许多可以用本文所述的仪器和方法作为目标。应用的例子包括生物化学和生命科学应用，包括例如蛋白质组学、代谢组学、在药物发现和代谢中的高通量。其他例子包括污染控制、食物控制、司法科学和天然产物或过程监测。又一些其它应用包括原子物理学、反应物理学、反应动力学，地质年代学、无机化学分析、离子分子反应和热力学参数的确定。附加的实施例
在一些情况下，本文所描述的方法也可以用包括第一质谱系统(基于nems-ms，使用微机械和/或纳米机械谐振器)但没有第二质谱系统的仪器来实现。例如，解吸、程序性解吸或逐像素解吸可以仅用第一nems质谱系统来实现。因此例如，提供了一种实施例，其中样本通过将样本吸附到nems-ms系统的谐振器的吸附而受到nems-ms分析，但然后样本从谐振器被解吸。解吸可以是程序性解吸或逐像素解吸的一部分。样本可以通过软着陆被吸附到谐振器。谐振器可以是芯片例如nems芯片的一部分，并且可以是谐振器阵列的一部分。
工作示例：
在以下非限制性工作示例中提供了另外的实施例。
示例1：混合仪器的构造
构建如在图1a和图1b中示意性所示的混合仪器。在示例2中更多地展示该仪器的使用。
在图1a和图1b中的混合仪器具有包括轨道静电阱质谱仪(第二质谱系统)的一个系统。该仪器的这一部分是从thermofisherscientific有限公司获得的q-exactiveplusemr(扩展质量范围)质谱仪。q-exactive仪器然后适合于与定制的nems-ms系统(第一质谱系统)整合，其中整合通过使用q-exactive仪器的hcd碰撞池的整合区发生。提供了离子光学元件，并且整合区适合于使得离子束可以通过电气地切换离子光学元件而被引导到第一质谱系统和/或第二质谱系统。hcd碰撞池可用作用于电气切换的电气定向设备。
通过从第二质谱系统的hcd池构建整合区和nems-ms系统(第一质谱系统)来构造该仪器。所使用的元件包括传递室、闸阀、nems室、离子透镜，nems台和lhe低温恒温器。闸阀位于两个四极之间。nems台在xyz被定位的情况下被控制。外部底座用于支撑系统。测量离子透过率。
对于图1a和图1b的nems-ms部分，使用vlsi工艺在200mmsoi晶片上制造设备。使用静电致动和压阻运动转导。在谐振束上的分子吸附根据以下公式引起频移：
其中，n是第n个谐振模式，μ是分子的面质量密度，以及φn是模态振型。该公式可以反转，以对分子的面质量矩(质量、位置、直径、偏斜，峰度等)m(k)求解。对于细节，参见hanay等人的“inertialimagingwithnanomechanicalsystems”(nat.nano,第10卷,339-344,2015年4月)。
低温学和感测：
对于图1a和图1b所示的仪器，引线接合在nems芯片和定制pcb之间形成电连接。该pcb安装在具有亚纳米定位分辨率的xyz低温定位器(attocube)上。使用柔性铜电缆来将nemspcb电连接到冷却pcb，其附接到与4k低温恒温器热接触的铜样本底座。然后使用不锈钢电缆，以将来自冷却pcbs的rf信号传送到在低温恒温器分接盒(breakoutbox)上的馈通孔。
图7示出了冷却pcb。在右边，如所示，三个相同的pcb为12条同轴线提供热化。此外，在说明nemspcb和nems芯片的厚度之后，当xyz定位器在它的工作范围内居中时，nems芯片的表面将距离聚焦透镜的端部约5mm。还示出了用于对xyz台的tdc连接进行热化的第四pcb(前视图和后视图)的放大视图。使用二十一个引脚(对xyz台为15个，对台温度计为4个，对加热器为2个)；红色为加热器线，橙色为xyz台，且黄色为4线温度计。蓝色是地平面。
示例2：混合仪器的使用
在图1a和图1b(示例1)的仪器的试验中，大肠杆菌groel(一种14聚体细菌伴侣蛋白)(rose等人的“highsensitivityorbitrapmassanalysisofintactmacromolecularassemblies”(naturemethods，9，11，1084，2012年11月))被捐赠并用于演示系统功能。离子首先被传递到轨道静电阱质谱仪，但原则上可以被传递到轨道静电阱分析器或nems室。使用用于纳喷射的针。使用混合仪器生成的数据在图2-5示出。
图2图示了在图1a和图1b中所示的轨道静电阱分析器中观察到的groel离子的m/z谱。分配电荷状态以便最小化所计算的质量的标准偏差。所计算的质量为801,105da，证实了完整的groel复合物可以在系统内被转移。
图3示出了用安装在图1a和图1b所示的nems室中的xyz定位器上的定制静电计(未示出)检测到groel离子。可以通过打开或关闭传输四极rf来传输或阻挡离子。
图4图示了xyz定位器被扫描以确定图1a和图1b所示的仪器的最大束强度的位置。轮廓的非圆形外观是由于电极几何形状。
图5是由于使用图1a和图1b所示的仪器对groel分子的吸附而引起的频移的示例。
图6示出了当离子撞击nems谐振器时50％的离子在束斑的0.05mm直径内。该曲线图示出横向位置(mm)对轴向位置(mm)。还示出了离子透镜和nems芯片。
虽然本文提供的描述构成了当前要求保护的发明或多个发明的多个实施例，但是将认识到，在不脱离所附权利要求的合理含义的情况下，它们易受进一步的修改和改变。
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