血液成分的分离系统、分离材料的制作方法

专利名称:血液成分的分离系统、分离材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及从包含各血细胞成分的体液中分离出红细胞富集级分、白细胞富集级分、和/或血小板富集级分的方法。此外，本发明还涉及能够对白细胞中的、尤其是包含造血干细胞的单核细胞富集级分选择地进行回收的分离材料、分离方法。
背景技术：
近年来，伴随着血液学、科学技术的快速进步，从以全血、骨髓、脐带血、组织提取物为代表的体液中，仅分离对于治疗而言必要的血液级分并给予患者，而不给予不必要的级分，从而进一步提高治疗效果、抑制副作用的治疗方式得到广泛普及。
例如，血液输血也是其中的一种。红细胞制剂是在出血及红细胞不足的状态、或红细胞的功能降低导致氧缺乏的情况下使用的血液制剂。为此，引发异常的免疫反应、移植物抗宿主病(GVHD)等副作用的白细胞是不需要的，有时需要利用过滤器除去白细胞。根据情况，有时除了白细胞之外，还需要除去血小板。
另一方面，血小板制剂是在由于缺乏凝血因子而导致的出血乃至具有出血倾向的患者中使用的血液制剂。通过离心分离，除去血小板以外的不需要的细胞、成分，仅采集必要的血小板成分。
除此之外，近年来，面向白血病、实体癌治疗的造血干细胞移植日益盛行，逐渐形成分离出治疗所必须的细胞(白细胞，尤其是单核细胞)来给予的模式。作为该造血干细胞的来源，从对供体的负担小、增殖能力优异等优点来看，除了骨髓和末梢血之外，脐带血也广泛受到关注。此外近年来，还有显示在月经血中也存在丰富的干细胞，到目前为止被废弃的月经血也可能作为贵重的干细胞来源使用。
关于骨髓和末梢血，期望除去不需要的细胞，分离、纯化白细胞(尤其是单核细胞)并给予，另一方面，为了亲缘关系者的脐带血银行(banking)也逐渐盛行，由于直到使用前都需要冷冻保存，因此出于防止由冷冻保存导致的红细胞溶血的目的，将白细胞分离并纯化。
提出了如下的分离方法借助使用聚蔗糖的比重液的离心分离法，以及使用作为红细胞沉降剂的羟乙基淀粉的离心分离法，但其存在着无法在封闭体系中进行处理从而混入杂质和菌这样的问题。作为不使用离心分离法的细胞分离方法，最近还报道了如下方法 使用不捕捉红细胞和血小板，仅捕捉白细胞的过滤材料，对白细胞进行回收的方法(专利文献1、专利文献幻，在该方法中，无法将红细胞和血小板分离。
目前存在的状况是，根据目标成分而采用不同的分离方法，红细胞制剂采用分离过滤器，血小板制剂采用离心分离，白细胞制剂采用使用比重液、红细胞沉降剂的离心分离。原本，由于红细胞、血小板、白细胞可以从血液、骨髓、脐带血等相同的来源获得，因此利用以往的分离方法会使必要的细胞被浪费。由此，期望用于对来自相同来源的红细胞、白细胞、血小板进行分离的不需要复杂操作，并能够迅速实现的分离技术。
此外，期望进一步提高白细胞尤其是含有造血干细胞的单核细胞级分的纯度，但在现在的技术中，粒细胞的混入率仍然较高，需要比目前更进一步地降低粒细胞的混入率 (非专利文献1)。
此外，已知作为由过滤器捕捉的白细胞、单核细胞进行回收的溶液，如果使用含葡聚糖的高粘度溶液，可以提高白细胞、单核细胞的回收率(专利文献幻，但另一方面，存在以下问题由于在该方法中使用的葡聚糖溶液粘度高，因此利用注射器压出时操作困难，期待着如下的容易利用注射器回收并且可高收率地回收白细胞、单核细胞的分离溶液。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 日本特表2001-518792
专利文献2 国际公开号W098/3^40
非专利文献
非专利文献1 TRANSFUSION, Vol. 45，pl899_1908，2005
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种不需要离心操作，可迅速且简便地从含有各血细胞成分的体液中分离出红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分的方法。进一步地， 本发明还提供一种可以获得白细胞尤其是粒细胞的混入率低的单核细胞富集级分的分离材料和分离方法。
解决问题的方法
本发明人等对以往难以容易实现的、不需要离心操作即可从体液中分离各血细胞成分的方法进行了深入的研究，结果发现通过使用某种血细胞分离材料，首先将白细胞和血小板捕捉于分离材料从而得到红细胞富集级分，然后使用分离溶液，将捕捉于血细胞分离材料的白细胞回收从而得到白细胞富集级分，由此可以从体液中分离出红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分，从而完成了本发明。
本发明是通过使用可以捕捉血细胞和血小板且可以分离回收白细胞富集级分的血细胞分离材料，能够将含有各血细胞成分的体液分离成红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分的方法，本发明的方法是与以往的白细胞除去过滤器、或上述专利文献 1、2中记载的使用血小板实质上通过的材料的白细胞捕捉回收法完全不同的方法。
此外，本发明人等发现通过使用具有特定密度及纤维径的无纺布作为血细胞分离材料，可以有效地分离白细胞中的、尤其是含大量单核细胞的单核细胞富集级分。
S卩，本发明涉及一种将体液分离成各血细胞成分的方法，其特征在于，包含
通过使体液与血细胞分离材料接触，将白细胞和血小板捕捉于血细胞分离材料， 从而得到红细胞富集级分的工序(a)；
使用分离溶液从血细胞分离材料分离白细胞富集级分的工序(b)。
优选将血细胞分离材料填充到设置有体液入口和出口的容器中，通过由该入口通入体液使体液与血细胞分离材料接触。
优选在工序(a)中，使体液与血细胞分离材料接触后，利用清洗液对残留在血细胞分离材料中的红细胞进行清洗。[0028]优选在工序(b)中，从体液的出口侧注入分离溶液对白细胞进行分离回收。
优选分离溶液包括生理食盐水、缓冲液、葡聚糖、培养基、或输液。
优选体液为血液、骨髓、脐带血、月经血、或组织提取物。
优选在进行使体液与血细胞分离材料接触的工序(a)之前，预先使溶液与血细胞分离材料接触。
优选预先与血细胞分离材料接触的溶液包括生理食盐水、或缓冲液。
优选血液分离材料包括无纺布，优选无纺布包括分裂纤维。
优选无纺布包括聚酯纤维、聚丙烯纤维、尼龙纤维、或丙烯酸纤维。此外，优选聚酯纤维为聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、或聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维。另外，优选无纺布为尼龙纤维、聚丙烯纤维、或聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维。
优选无纺布的密度K为2. OX IO4以上且1.9X105以下，纤维径为1 μ m以上且 15 μ m以下，白细胞富集级分为单核细胞富集级分。
优选使用粘度为ImPa · s以上且低于5mPa · s的溶液作为分离溶液。
优选白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的血小板回收率在白细胞回收率以下，优选白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的血小板回收率在单核细胞回收率以下。
优选白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的单核细胞回收率对粒细胞回收率的比大于1.0。
优选白细胞富集级分或单核细胞富集级分包括造血干细胞、间充质干细胞、或 ⑶；34阳性细胞。
此外，本发明涉及通过上述方法分离出的红细胞富集级分、白细胞富集级分、或血小板富集级分。
此外，本发明涉及一种血细胞分离材料，其包括密度K为2. OX IO4以上且1. 9 X IO5 以下，纤维径为1 μ m以上且15 μ m以下，能够从体液分离出单核细胞富集级分的无纺布。
血细胞分离材料优选包括尼龙纤维、聚丙烯纤维或聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维。
此外，本发明涉及一种血细胞分离装置，其特征在于，上述血细胞分离材料以叠层状态填充在设置有体液的入口和出口的容器中。
此外，本发明涉及一种血细胞分离装置，其具有上述血细胞分离材料以叠层状态填充的容器，设置在容器的入口侧上游的流路开闭机构，与流路开闭机构相连的白细胞富集级分回收机构，以及设置在容器的出口侧下游的分离溶液的导入机构。
此外，本发明涉及一种分离溶液，该分离溶液是用于对由血细胞分离材料或无纺布捕捉到的白细胞进行回收的溶液，其粘度为ImPa 以上且低于5mPa *s。分离溶液优选不含葡聚糖。
发明效果
根据本发明的方法，可以从以全血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物为代表的体液中简便且迅速地，将体液分离成红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分。在以往的方法中，无法将体液所含有的红细胞、血小板、白细胞全部分离回收，某些成分会无法回收，就本发明的方法而言，可以全部分离回收。此外，通过使用上述本发明的无纺布作为血细胞分离材料可以得到单核细胞富集级分。[0048]利用本发明方法回收的红细胞富集级分由于其它血细胞的混入率极低，因此可以直接用于输血。由于本发明方法得到的白细胞富集级分、单核细胞富集级分的红细胞混入率极低，因此即使直到使用前都将其冷冻保存，由红细胞溶血等产生的不良影响也非常少。 此外，由于本发明的容器中填充有分离材料的过滤器可以在无菌的封闭体系中使用，因此经无菌回收的级分可以直接积累从而制备细胞。
本发明的血细胞分离材料可以提供作为用于白血病治疗、心肌再生、血管再生等再生医疗的治疗细胞配制用过滤器。另外，由于使用本发明的血细胞分离材料得到的白细胞富集级分、单核细胞富集级分是富含造血干细胞的级分，因此在配制输血用制剂的同时， 作为用于制备再生医疗用细胞来源的过滤器也非常有用，可以制备副作用少安全性高的治疗用细胞。


[图1]为示出了密度K和单核细胞回收率的关系的图。
[图2]为示出了纤维径和单核细胞回收率的关系的图。
[图3]为示出了使用了本发明的血细胞分离材料的血细胞成分分离系统的一个例子的图。
具体实施方式
以下，针对本发明进行详细地说明，但本发明不受以下说明的限定。
1.将体液分离成各血细胞成分的方法
本发明的将体液分离成各血细胞成分的方法，其包含
(a)通过使体液与血细胞分离材料接触，将白细胞和血小板捕捉于血细胞分离材料，从而得到红细胞富集级分的工序；
(b)使用分离溶液，从血细胞分离材料分离白细胞富集级分的工序。
在本发明的方法中，血细胞分离材料可以不放入在容器中使用，也可以将血细胞分离材料放入到具有体液入口和出口的容器中使用。但是，如果考虑实用性，则优选放入到容器中使用的后者。此外，也可以将血细胞分离材料切成适当的大小，以平板状处理体液， 此外，也可以以将血细胞分离材料卷成卷状的形状进行处理。将血细胞分离材料填充到设置有体液入口和出口的容器中时，通过由该入口通入体液使其与血细胞分离材料接触。
(a)体液送液工序
在该工序中，将体液从入口侧注入到填充有血细胞分离材料的容器中，捕捉白细胞和血小板从而得到红细胞富集级分。
体液是指全血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物，也可以是将它们粗分离之后的物质。此外关于动物种类没有限制，只要是人、牛、小鼠、大鼠、猪、猴子、狗、 猫等哺乳动物即可，可以为任何动物。除了这些动物的血液之外，可以从脐带血、 骨髓、组织中采集。另外，与体液的抗凝固剂的种类无关，可以使用ACD(酸-柠檬酸盐-葡萄糖(acid-citrate-dextrose))液、CPD(柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖 (citrate-phosphate-dextrose))液、CPDA (柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤(citrat e-phosphate-dextrose-adenine))液等柠檬酸来抗凝固，也可以利用肝素、低分子量肝素、Futhan (甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesilate))、EDTA来抗凝固。只要不影响使用各级分的目的即可，对于体液的保存条件也没有任何限制。
在通过填充有血细胞分离材料的容器的体液入口侧通入体液时，可以从装入有体液的容器中，通过送液回路自然下落进行送液，也可以通过泵进行送液。此外，还可以将装有体液的注射器直接与该容器连接，利用手按压注射器。在通过泵通入液体时，如果送液速度过快，则分离效率会下降，如果速度过慢则处理时间会花费过多，因此可以列举0. ImL/ 分钟 IOOmL/分钟，但并不限定于上述速度。
此外，作为体液送液工序的前处理，可以实施利用生理食盐水、缓冲液浸渍分离材料的工序。该操作不是必须的，考虑到将分离材料浸渍在上述溶液中会对提高分离效率和确保血液流路产生影响，因此可以根据情况实施。该前处理溶液不需要与以下清洗工序中使用的溶液相同，如果相同则由于可以共用溶液袋，因此从回路系统的简单化和操作性的观点来看，可以是相同的。作为前处理的液体量，为填充有血细胞分离材料的容器的1倍 100倍左右是实用的，故优选。
将白细胞和血小板捕捉于血细胞分离材料之后，对血细胞分离材料进行清洗。此时，通过从同方向通入清洗液可以有效地对容器内滞留的红细胞进行回收和分离。由于清洗液可以主要仅回收红细胞，因此也可以与注入体液时通过的液体混合，作为红细胞富集级分。
在由清洗液的流入侧，通过与体液送液工序相同的方向通入清洗液时，可以使清洗液通过回路，利用自然落下来送液，也可以通过泵来进行送液。通过泵进行送液时的流速与体液送液工序为同等水平，可以列举0. ImL/分钟 IOOmL/分钟，但不限于上述的速度。 清洗量根据容器的容量而变化，如果清洗量过少则残留在容器中的红细胞成分增加，如果清洗量过多则分离效率下降同时需要花费较长时间，因此优选以容器的0. 5倍 100倍左右的容量进行清洗。
作为可以使用的清洗液，只要能够仅洗掉红细胞、可以抑制白细胞富集级分中混入其它血细胞、保持血细胞的捕捉状态即可，可以使用任何溶液，但优选生理食盐水、林格氏液、用于细胞培养的培养基、磷酸缓冲液等常规的缓冲液。
(b)白细胞富集级分的分离工序
由向填充有血细胞分离材料的容器中通入体液的相反方向(体液出口侧)注入分离溶液，从而得到白细胞富集级分。由通入体液的相反方向注入分离溶液的理由在于由出口侧导入时，提高了白细胞富集级分中的白细胞回收率。注入分离溶液时，可以通过以下方式来进行将分离溶液预先装入注射器等中，使用手、机器有力地地推出注射器的注射器内芯(plunger)。回收液体量、流速根据容器的容量、处理量而改变，优选以容器的1倍 100 倍左右的容量，流速0. 5mL/秒钟 20mL/秒钟，但并不限定于此。
分离溶液只要是低渗液即可，没有特别地限制，可以举出例如生理食盐水、林格氏液等作为注射用剂具有使用实际成效的物质、缓冲液、细胞培养用培养基、输液等。
此外，为了提高被捕捉的细胞的回收率，也可以提高回收液的粘稠度(粘張度)。 为此，可以向上述分离溶液中添加白蛋白、血纤蛋白原、球蛋白、葡聚糖、羟乙基淀粉、羟乙基纤维素、胶原、透明质酸、明胶等，但不限于上述这些物质。但是，由于含有高浓度(约 10%以上)的葡聚糖等的回收液的粘度为5mPa· S以上，难以使用注射器通过手推进行回收的情况较多，优选使用不含葡聚糖的分离溶液，或使用通过调节葡聚糖浓度使得其粘度为ImPa · s以上且低于5mPa · s的分离溶液。
2.血细胞成分
红细胞富集级分是指通过级分中的红细胞回收率高于其它血细胞(白细胞或血小板)的回收率的级分，红细胞富集级分的红细胞回收率为80%以上，优选为90%以上，更优选为95%以上。在此所称的红细胞回收率是用红细胞富集级分中的总红细胞数除以处理前的总红细胞数的比例而求出的。
就红细胞富集级分中的白细胞含量而言，用红细胞级分中的总白细胞数除以处理前的总白细胞数的比例而求出的回收率为10%以下，优选为5%以下。就红细胞富集级分中的血小板含量而言，用红细胞级分中的总血小板数除以处理前的总血小板数的比例而求出的回收率低于60 %，优选为40 %以下，更优选为20 %以下。
使用本发明的方法及血细胞分离材料分离回收的白细胞富集级分是指回收的分离溶液中的白细胞回收率、单核细胞回收率、粒细胞回收率中的任意回收率是其它血细胞 (红细胞或血小板)回收率的1/2倍以上。淋巴细胞的回收率是其它血细胞(红细胞或血小板)回收率的1/2以上也符合。白细胞回收率为45%以上，优选为60%以上，更优选为 80%以上。在此所称的白细胞回收率是由白细胞富集级分中的总白细胞数除以处理前的总白细胞数的比例而求出的。就单核细胞回收率、粒细胞回收率而言，也可以通过同样的总数来计算，单核细胞数、粒细胞数是通过由流式细胞仪等求出的阳性率乘以白细胞数而算出的。
白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的血小板回收率优选在白细胞回收率以下。此外，白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的血小板回收率优选在单核细胞回收率以下。白细胞富集级分或单核细胞富集级分优选含有造血干细胞、间充质干细胞、CD34 阳性细胞。
就白细胞富集级分中的红细胞含量而言，通过白细胞富集级分中的总红细胞数除以处理前的总红细胞数的比例而求出的红细胞回收率为10%以下，优选为5%以下。就白细胞级分中的血小板含量而言，通过白细胞富集级分中的总血小板数除以处理前的总血小板数的比例而求出的血小板回收率为50%以下，优选为25%以下，更优选为10%以下，进一步优选为5%以下。
血小板富集级分是指利用分离溶液获得白细胞富集级分后，由分离材料捕捉的细胞级分，并且由分离材料捕捉的血小板的回收率高于其它血细胞(红细胞或白细胞)的回收率。
如本发明所记载的，如果利用密度K为2. OX IO4以上且1.9X105以下、纤维径为 Iym以上且15μπι以下的无纺布，则还可以控制利用分离溶液分离回收的级分中的白细胞组成。例如，还可以用于单核细胞(淋巴细胞+单核细胞)和粒细胞之间的分离，得到单核细胞丰富的组成(单核细胞富集级分)。本发明的单核细胞富集级分是指利用分离溶液分离回收的级分中的单核细胞的回收率高于该级分中的粒细胞和其它血细胞成分(红细胞或血小板)的回收率，具体来说，单核细胞回收率/粒细胞回收率的值大于1. 0，优选为1. 2 倍以上，更优选为1.5倍以上。
3.血细胞分离材料[0080]对于用作血细胞分离材料的材料没有特别限定，但从灭菌耐受性和对于细胞的安全性的观点来看，可以举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚乙烯醇、偏氯乙烯、人造丝、维尼纶、聚丙烯、丙烯酸(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯)、尼龙、聚酰亚胺、芳纶 (芳香族聚酰胺)、聚酰胺、铜氨(cupro)、碳(carbon)、酚、聚酯、纸浆(pulp)、麻、聚氨酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等合成高分子；琼脂糖、纤维素、乙酸纤维素、壳聚糖、甲壳质等天然高分子；玻璃等无机材料、金属等。其中，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、 聚丙烯、丙烯酸、尼龙、聚氨酯、玻璃。这些材料不限为一种单独的材料，根据需要，还可以将材料复合、混合、融合使用。另外，需要的话，可以固定蛋白质、肽、氨基酸、糖类等对特定的细胞具有亲和性的分子。
对于血细胞分离材料的形状没有特别限定，可以列举例如粒子状、无纺布、编织物、海绵状、多孔体、网状等。其中，优选为纤维状，从可以容易制作并购买的角度来看，更优选为无纺布。
在血细胞分离材料的形状为无纺布的情况下，无纺布优选包括聚酯纤维、聚丙烯纤维、尼龙纤维、丙烯酸纤维中的至少一种。就聚酯而言，由于可以提高红细胞和白细胞的分离效率，因此优选聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚对苯二甲酸丁二醇酯。另外，由于无纺布可提高红细胞和白细胞的分离效率，因此更优选包括尼龙、聚丙烯和/或聚对苯二甲酸丁二醇酯。
作为无纺布的制造方法，大体上可以分为湿式和干式，进一步可以列举树脂复合 (resin bond)、热合(thermal bond)、水束 Ij (spunlace)、针束 Ij (needle punch)、缝编复合 (stitch bond)、纺粘(spunbond)、熔喷(melt blown)等，但不限于这些制造方法。然而，从纤维径细时血细胞分离效率良好的观点来看，更优选熔喷和水刺。也可以是经压延加工、等离子体处理的材料。
作为无纺布纤维，将复合单丝分割成多个而得到的即所谓的分裂纤维，由于纤维复杂地相互缠绕，对血细胞的分离效率良好，因此也适于使用。
从红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分的分离效率来考虑，分离材料的密度K、即克重(目付)(g/m2)/厚度(m)优选为1.0X104以上且5. OX IO5以下。对白细胞，尤其是对其中的含大量单核细胞的单核细胞富集级分进行回收时，需要在2. OXlO4 以上且1. 9 X IO5以下。从单核细胞回收率的观点来看，更优选4. OX IO4以上且1. 9 X IO5以下，从抑制粒细胞的混入率的观点来看，进一步优选5. OX IO4以上且1. 9 X IO5以下。
密度K表示为克重(g/m2)/厚度(m)，密度也可以由重量(g)/单位体积(m3)表示。 在此，密度K与分离材料的形态无关，还可以通过测定每单位体积(m3)的重量(g)求出。测定时，在不施加压力这样的无形变的状态下进行测定。例如，可以通过使用CCD激光位移传感器((株)KeyenCe制造，LK-03Q等在非接触状态下测定厚度。当然，在使用的材料目录等中记录有克重和厚度的情况下，可以根据其数据由克重(g/m2)/厚度(m)求出密度K。
分离材料的纤维径需要在Iym以上且15 ym以下。如果比1 μ m细，则容易引起堵塞，如果比15 μ m粗，则白细胞和/或血小板无法被分离材料捕捉，红细胞富集级分中的白细胞和/或血小板的混入率升高，此外，白细胞富集级分、血小板富集级分的分离效率显著降低。从提高分离效率的观点来看，优选在1 μ m以上且10 μ m以下，更优选在1 μ m以上且7μπι以下，特别优选在Ιμπι以上且5μπι以下。
纤维径是指相对于纤维轴成直角方向的纤维的宽度，可以通过下述方法对纤维径进行测定利用扫描电子显微镜对包括无纺布的分离材料拍摄照片，对由照片中所描述的刻度求出的纤维径的计算值进行平均而求出。即，本发明所述的纤维径是表示如上所述测定的纤维径的平均值，为50个以上，优选为100个以上的平均值。但是，当多根纤维重叠时，其它纤维干扰导致该纤维的宽度无法测定时，当直径明显不同的纤维混合存在时等，可以除去它们的数据计算出纤维径。
此外，在粗细大小不同，例如包括纤维径差异为7μπι以上的多根纤维的无纺布的情况下，由于纤维径细的纤维对于分离效率的影响较大，因此分别计算纤维径，将细的纤维径视为该无纺布的纤维径。例如当在7μπι以下时，即使2种纤维径不同，也可以作为同样的纤维来使用并计算纤维径。
需要说明的是，在本发明的分离方法中，可以组合使用2种以上上述本发明的分离材料，也可以将上述本发明的分离材料与本发明以外的分离材料组合使用。即只要至少使用1种上述材料、即具有密度K及纤维径的分离材料，例如与纤维径为15 30 μ m的分离材料同时使用时，也属于本发明的分离方法的范畴。
4.血细胞分离装置
本发明的血细胞分离装置通过将血细胞分离材料填充到设置有体液入口和出口的容器中而得到。
血细胞分离装置同时具备清洗溶液、分离溶液的入口和出口、红细胞富集级分回收机构、白细胞富集级分回收机构(或单核细胞富集级分回收机构)等时，是很实用的，因此是优选的。回收机构也可以为袋。另外，血细胞分离装置优选具有血细胞分离材料以叠层状态填充的容器、设置在容器的入口侧上游的流路开闭机构、与流路开闭机构相连的白细胞富集级分回收机构、以及设置在容器的出口侧下游的分离溶液的导入机构。
具体来说，期望血细胞分离装置具有流入体液的入口和流出体液的出口，该血细胞分离装置还具有独立于体液的入口或体液的入口的、对滞留在容器内的红细胞进行冲洗的清洗溶液的流入部，还具有独立于体液的出口或体液的出口的清洗液的流出部，并且还具有上述体液及清洗液的流出部或在独立于流出部之外的用于导入分离溶液的入口。附属在容器上的清洗液的入口出口可以共用体液的入口出口，也可以是经由三通阀等流路开闭机构将入口侧的回路与血液袋和清洗溶液袋连接的状态。也可以是分离溶液的导入口为体液的出口、分离溶液的回收口共用体液的入口，同样地，也可以是经由三通阀将回路与各袋、注射器等连接。图3示出了使用本发明的血细胞分离材料的血细胞成分分离系统的一个例子。
另外，还优选在上述容器上设置有体液的保存袋、用于回收白细胞富集级分的分离溶液回收袋、红细胞富集级分回收袋等。通过将这些袋与上述记载的各溶液的入口出口连接，可以在无菌的封闭体系中对体液进行分离。此外，优选各袋在使用后可以分割使用， 可以形成为通常使用的血袋那样的形状，也可以为平板状的盒状(cartridge)方式等。应不同的目的，白细胞富集级分、单核细胞富集级分的回收袋可以选择能够培养细胞的袋、具有冷冻保存耐受性的袋等。
在将血细胞分离材料填充到容器中时，可以进行压缩后再填充到容器中，也可以不经压缩填充到容器中。可以根据血细胞分离材料的材质等进行适当选择。作为血细胞分离材料优选的使用例，优选将包括无纺布的血细胞分离材料切割成适当的大小、厚度为 Imm 200mm左右、以单层或叠层状态使用。考虑到各级分的分离效率，更优选为1. 5mm 150mm，进一步优选为2mm 100mm。此外，优选填充到容器中时的厚度为Imm 50mm左右， 以单层或叠层状态使用。考虑到各级分的分离效率，更优选为1. 5mm 40mm，进一步优选为 2mm 35mm0
此外，可以将血细胞分离材料卷成卷状，填充到容器中。在以卷状使用时，可以从该卷的内侧向外侧处理体液，以分离血细胞，或者相反地也可以从该卷的外侧向内侧处理体液。
对于填充血细胞分离材料的容器的形态、大小、材质没有特别地限定。容器的形态可以为球、箱、盒、袋、管、柱等任意形态。作为优选的具体例，可以列举例如容器为约 0. ImL 400mL左右、直径为约0. Icm 15cm左右的半透明的筒状容器；一片的长度为 0. Icm 20cm左右的长方形或正方形，厚度为0. Icm 5cm左右的四面体容器等，但本发明不限于上述这些。
容器可以使用任意构成材料制作。作为构成材料，具体来说，可以列举非反应性聚合物、生物亲和性金属、合金、玻璃等。作为非反应性聚合物，可以列举丙烯腈丁二烯苯乙烯三元聚合物等丙烯腈聚合物；聚四氟乙烯、聚氯三氟乙烯、四氟乙烯和六氟丙烯的共聚物、聚氯乙烯等卤代聚合物；聚酰胺、聚酰亚胺、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯丙烯酸共聚物(求·； 二 >夕π，〗F r ^ -J ；^ -j -)、聚碳酸酯丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基戊烯等。作为容器的材料有用的金属材料(生物亲和性金属、合金)，可以列举不锈钢、钛、钼、钽、金、及它们的合金、以及金镀覆合金铁、钼镀覆合金铁、钴铬合金、氮化钛包覆不锈钢等。
特别优选具有灭菌耐受性的材料，具体来说，可以列举聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、 聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基戊烯等。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细地描述，但本发明不仅限于以下的实施例。
(实施例1)
在厚度6mm直径18mm的容器中，以叠层状态填充观片聚丙烯制无纺布(纤维径 3. 5μ m、密度K8. 3X 104g/m3)，首先，使用注射器手压，将生理食盐水45mL由入口侧通入。然后，以2. 5mL/分钟，将柠檬酸抗凝固的新鲜牛血液IOmL通入，接下来从同方向通入生理食盐水10mL。然后，从与通入液体相反的方向，使用注射器手压通入10% FBS添加MEM培养基30mL，进行回收。通过血细胞计数器(Sysmex (株)制造，K-4500)，测定处理前血液的血细胞计数、红细胞富集级分的血细胞计数、白细胞富集级分中的血细胞计数，并计算出各级分中的各血细胞的回收率。进一步，利用FACS裂解液，对处理前的血液、回收的分离溶液进行溶血后，通过流式细胞仪(日本Becton · Dickinson(株)制造，FACSCanto)求出单核细胞阳性率、粒细胞阳性率，将白细胞数和各阳性率相乘计算出总单核细胞数及总粒细胞数。 将使用回收的分离溶液中的总单核细胞数、总粒细胞数，除以处理前的总单核细胞数、总粒细胞数的比例作为各单核细胞回收率、粒细胞回收率。结果如表1所示。
(实施例2)[0106]除了以叠层状态填充28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(纤维径2. 5 μ m，密度 Kl. 0X105g/m3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(实施例3)
除了以叠层状态填充观片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(纤维径3. 8 μ m，密度 Kl. 2X105g/m3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(实施例4)
除了以叠层状态填充44片聚对苯二甲酸乙二醇酯制无纺布(纤维径4. Ιμπι，密度 Kl. 9XlOVm3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(实施例5)
除了以叠层状态填充44片丙烯酸制无纺布(纤维径4. 7 μ m，密度Kl. 4 X 105g/m3) 之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(实施例6)
除了以叠层状态填充22片包括聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚丙烯的分裂纤维的无纺布(纤维径^^!!!，密度冗^父川、/!!!3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表 1所示。
(实施例7)
除了以叠层状态填充22片包括聚对苯二甲酸乙二醇酯和尼龙的分裂纤维的无纺布(纤维径10 μ m,密度Kl. 4 X 105g/m3)，以及使用A⑶抗凝固来代替柠檬酸抗凝固的新鲜牛血液IOmL之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(实施例8)
除了以叠层状态填充33片尼龙制无纺布(纤维径5. 0 μ m，密度Kl. 3X 105g/m3)， 以及使用CPD抗凝固新鲜人血液IOmL代替柠檬酸抗凝固的新鲜牛血液IOmL之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(实施例9)
除了以叠层状态填充30片聚丙烯制无纺布(纤维径2. 4 μ m，密度Κ5· 6 X 104g/m3) 之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例10)
除了以叠层状态填充28片聚丙烯制无纺布(纤维径3. 5 μ m，密度Κ8· 3 X 104g/m3) 之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例11)
除了以叠层状态填充沘片聚丙烯制无纺布(纤维径5. 7 μ m，密度Κ1· 2 X 105g/m3) 之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例12)
除了以叠层状态填充84片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(纤维径1. 8 μ m，密度 K9. lX104g/m3)之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例13)
除了以叠层状态填充观片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(纤维径2. 5 μ m，密度 Kl. 0X105g/m3)之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例14)[0130]除了以叠层状态填充28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(纤维径3. 8 μ m，密度 Kl. 2X105g/m3)之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例15)
除了以叠层状态填充观片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布(纤维径5. 3 μ m，密度 Kl. lX105g/m3)之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(实施例16)
除了使用CPD抗凝固猪脐带血代替CPD抗凝固新鲜人血液IOmL之外，进行与实施例13相同的操作。结果如表1所示。
(实施例17)
除了使用10%葡聚糖糖注射液代替10% FBS添加MEM培养基之外，进行与实施例 13相同的操作。结果如表1所示。
(实施例18)
除了使用柠檬酸抗凝固牛血液代替A⑶抗凝固人血液，使用生理食盐水代替10% FBS添加MEM培养基之外，进行了与实施例7相同的操作。结果如表1所示。
(实施例19)
除了使用CPD抗凝固猪骨髓IOmL代替柠檬酸抗凝固的新鲜牛血液IOmL之外，进行了与实施例3相同的操作。结果如表1所示。
(比较例1)
除了以叠层状态填充40片聚对苯二甲酸丁二醇酯无纺布(纤维径16 μ m,密度 K5. lX104g/m3)之外，进行了与实施例8同样的操作。结果如表1所示。
(比较例2)
除了以叠层状态填充36片包括玻璃和聚对苯二甲酸乙二醇酯的无纺布(纤维径低于0. 59μπι/9. 3μπι，密度K2.0X10、/m3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(比较例3)
除了以叠层状态填充M片包括玻璃和聚对苯二甲酸乙二醇酯的无纺布(纤维径低于0.84^111/8.411111，密度1(2.2/10、/1113)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(比较例4)
除了以叠层状态填充56片包括维尼纶的无纺布(纤维径30 μ m,密度K3. 2 X IO5g/ m3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
(比较例5)
除了以叠层状态填充6片包括丙烯酸和聚对苯二甲酸乙二醇酯的无纺布(纤维径 22μπι，密度K2. lX105g/m3)之外，进行了与实施例1同样的操作。结果如表1所示。
[表1]
权利要求
1.一种将体液分离成各血细胞成分的方法，其特征在于，包含通过使体液与血细胞分离材料接触，将白细胞和血小板捕捉于血细胞分离材料，从而得到红细胞富集级分的工序(a)；和使用分离溶液，从血细胞分离材料分离白细胞富集级分的工序(b)。
2.根据权利要求
1所述的分离方法，其特征在于，将血细胞分离材料填充到设置有体液入口和出口的容器中，通过由该入口通入体液使体液与血细胞分离材料接触。
3.根据权利要求
1或2所述的分离方法，其中，在工序(a)中，使体液与血细胞分离材料接触后，利用清洗液对残留在血细胞分离材料中的红细胞进行清洗。
4.根据权利要求
2或3所述的分离方法，其特征在于，在工序(b)中，从体液的出口侧注入分离溶液对白细胞进行分离回收。
5.根据权利要求
1 4中任一项所述的分离方法，其特征在于，分离溶液包括生理食盐水、缓冲液、葡聚糖、培养基、或输液。
6.根据权利要求
1 5中任一项所述的分离方法，其中，体液为血液、骨髓、脐带血、月经血、或组织提取物。
7.根据权利要求
1 6中任一项所述的分离方法，其特征在于，在进行使体液与血细胞分离材料接触的工序(a)之前，预先使溶液与血细胞分离材料接触。
8.根据权利要求
7所述的分离方法，其中，预先与血细胞分离材料接触的溶液包括生理食盐水或缓冲液。
9.根据权利要求
1 8中任一项所述的分离方法，其中，血液分离材料包括无纺布。
10.根据权利要求
9所述的分离方法，其中，无纺布包括聚酯纤维、聚丙烯纤维、尼龙纤维、或丙烯酸纤维。
11.根据权利要求
10所述的分离方法，其中，聚酯纤维为聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、 或聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维。
12.根据权利要求
10所述的分离方法，其中，无纺布包括尼龙纤维、聚丙烯纤维、或聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维。
13.根据权利要求
9所述的分离方法，其中，无纺布包括分裂纤维。
14.根据权利要求
9 13中任一项所述的分离方法，其中，无纺布的密度K为2.0 X IO4 以上且1. 9 X IO5以下，纤维径为1 μ m以上且15 μ m以下，白细胞富集级分为单核细胞富集级分。
15.根据权利要求
1 14中任一项所述的分离方法，其中，使用粘度为ImPa.s以上且低于5mPa · s的溶液作为分离溶液。
16.根据权利要求
1 15中任一项所述的分离方法，其特征在于，白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的血小板回收率在白细胞回收率以下。
17.根据权利要求
1 15中任一项所述的分离方法，其特征在于，白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的血小板回收率在单核细胞回收率以下。
18.根据权利要求
1 15中任一项所述的分离方法，其中，白细胞富集级分中或单核细胞富集级分中的单核细胞回收率对粒细胞回收率的比大于1. 0。
19.根据权利要求
1 15中任一项所述的分离方法，其特征在于，白细胞富集级分或单核细胞富集级分包含造血干细胞、间充质干细胞、或CD34阳性细胞。
20.由权利要求
1 权利要求
13所述的方法分离出的红细胞富集级分、白细胞富集级分、或血小板富集级分。
21.—种血细胞分离材料，其包括密度K为2. OX IO4以上且1. 9 X IO5以下，纤维径为 1 μ m以上且15 μ m以下，能够从体液分离出单核细胞富集级分的无纺布。
22.根据权利要求
21所述的血细胞分离材料，其中，无纺布包括尼龙纤维、聚丙烯纤维、或聚对苯二甲酸丁二醇酯纤维。
23.—种血细胞分离装置，其特征在于，权利要求
21或22所述的血细胞分离材料以叠层状态填充在设置有体液的入口和出口的容器中。
24.根据权利要求
23所述的血细胞分离装置，其还具有设置在所述容器的入口侧上游的流路开闭机构，与流路开闭机构相连的白细胞富集级分回收机构，以及设置在所述容器的出口侧下游的分离溶液的导入机构。
25.一种分离溶液，其是用于对由血细胞分离材料或无纺布捕捉到的白细胞进行回收的溶液，其粘度为ImPa · s以上且低于5mPa · s。
26.根据权利要求
25所述的分离溶液，其特征在于，不含葡聚糖。
专利摘要
本发明涉及不需要离心操作、迅速且简便地从含各血细胞成分的体液中分离出红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分的系统及分离材料。通过实施使体液与血细胞分离材料接触，捕捉白细胞和血小板从而得到红细胞富集级分的工序，以及使用分离溶液回收由血细胞分离材料捕捉的白细胞级分的工序，可以从体液中分离出红细胞富集级分、白细胞富集级分、血小板富集级分。
文档编号C12N5/0775GKCN102471762SQ201080029525
公开日2012年5月23日 申请日期2010年6月28日
发明者中谷胜, 佐藤伸彦, 吉田进也, 小林明 申请人:株式会社钟化导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan