遍，放入烘箱干燥，待用。
[0034] (2)具体制备步骤
[0035] IOOmL圆底烧杯中加入50mL超纯水，用洗净的ImL移液管移取0. 5mL事先配置好 的I %的氯金酸水溶液于50mL超纯水中，使得溶液中氯金酸浓度降低至0.0 l % (w/v)，将此 溶液在油浴中加热恒温与92±4°C。在磁子的剧烈搅拌下，迅速加入I. 6mL事先配置好的柠 檬酸三钠溶液（1%)，氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1 : 300,继续搅拌反应，在反应的前 三分钟，溶液基本没变化，3分钟之后，溶液开始变蓝，几分钟后变为蓝紫，继续恒温搅拌，在 20分钟之后溶液变红，最后变成清亮透明的橙红色，即为金纳米颗粒溶液。
[0036] 2、单链核酸布洛芬适配体的制备：
[0037] 本发明所述的单链核酸布洛芬适配体序列为：
[0038] 5' -SHATACCAGCTTATTCAATTCCACAGACCCTTAGCTTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATA GTAAGTGCAATCT-3^ 。
[0039] 将单链核酸布洛芬适配体离心后加入Tris-HCl缓冲溶液溶解为1 μ mol/L溶液放 入4°C冰箱中备用。
[0040] 3、标准曲线的绘制：
[0041] 以单链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，在8个2mL离心管中各加入 200 μ L步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液，100 μ L步骤2制备的1 μ mol/L 单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，再分别加入〇、 10、40、70、100、130、160、190 yL布洛芬标准溶液，用超纯水定容至500 yL，再加入10 yL IM氯化钠溶液，得到不同浓度的标准检测液。常温下反应30min，根据金纳米粒子聚沉引起 其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计在190-800nm波长范围内扫描检测体系的紫 外-可见吸收光谱，得到体系在650nm和520nm处的吸光值A650和A520 (OD)，以布洛芬浓 度为横坐标，A640/A520为纵坐标得到标准曲线，建立紫外吸收峰强度与目标布洛芬浓度之 间的线性关系，如图2所示，绘制标准曲线，得到回归方程为：y = 0. 02592X+0. 54205, R2 = 0. 9902,整个实例方法所得检出限（S/N = 3)为0. 0004ng/mL，实现布洛芬的超灵敏定量检 测。
[0042] 4、利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度：
[0043] 实际水样取自中国上海市松江区广富林路的生活小区内，在2mL离心管中加入 200 μ L步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液，100 μ L步骤2制备的1 μ mol/ L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探针复合物溶液，再加入 IOOyL(稀释比例1 : 100)稀释后的实际水样，用超纯水定容至500 yL，再加入IOyL IM 氯化钠溶液，室温下孵育30min后如中左面第二个样品所示，并用100 μ L超纯水溶液做空 白对照；通过紫外分光光度计在190-800nm波长范围内扫描检测体系的紫外-可见吸收光 谱，得到体系在650nm和520nm处的吸光值A650和A520 (OD)，通过实施例1中得到的传感 器灵敏度曲线y = 〇. 02592X+0. 54205, R2= 0. 9902可以计算出水样中所含布洛芬的含量 为 10 μ g/L。
[0044] 对比例I :适配体修饰纳米金比色法对萘普生的检测
[0045] 在2mL离心管中加入200 μ L步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液， 100 μ L步骤2制备的1 μ mol/L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体 探针复合物溶液，加入浓度为100 μ M萘普生溶液的100 μ L，用超纯水定容至500 μ L，再 加入10 μ L IM氯化钠溶液，室温下孵育30min后如图3中所示左面第三个样品所示，并用 100 μ L超纯水溶液做空白对照；一方面通过肉眼观察离心管中溶液的聚沉情况和颜色变 化，通过与空白对照管的比较，发现颜色不会发生明显变化，接近于空白对照管的颜色，说 明适配体修饰纳米金比色法不会对干扰物萘普生产生反应，另一方面紫外可见风光光度计 测定上述离心管中溶液，图4为分别测定含有金纳米粒子核酸适配体探针复合物与100 μ L 超纯水溶液、布洛芬溶液、氟比洛芬溶液、萘普生溶液在190-800nm处的紫外-可见吸收光 谱，可以得到在萘普生溶液在650nm没有出现新的峰，即说明核酸适配体探针不能与萘普 生特异性结合，金纳米粒子在核酸适配体探针的存在下产生耐盐能力而没有产生聚集，即 此方法可以应用于特异性识别萘普生和布洛芬的混合物。
[0046] 对比例2适配体修饰纳米金比色法对氟比洛芬的检测
[0047] 在2mL离心管中加入200 μ L步骤1制备的浓度为25nmol/L的金纳米颗粒溶液， 100 μ L步骤2制备的1 μ mol/L单链核酸布洛芬适配体溶液，得到金纳米粒子核酸适配体探 针复合物溶液，加入加入浓度为100 μ M氟比洛芬溶液的100 μ L，用超纯水定容至500 μ L， 再加入10 μ L IM氯化钠溶液，室温下孵育30min后如图3中所示左面第四个样品所示，并 用IOOyL超纯水溶液做空白对照；一方面通过肉眼观察离心管中溶液的聚沉情况和颜色 变化，通过与空白对照管的比较，发现颜色不会发生明显变化，接近于空白对照管的颜色， 说明适配体修饰纳米金比色法不会对干扰物氟比洛芬产生反应，另一方面用紫外可见风光 光度计测定上述离心管中溶液，图4为分别测定含有金纳米粒子核酸适配体探针复合物与 100 μ L超纯水溶液、布洛芬溶液、氟比洛芬溶液、萘普生溶液在190-800nm处的紫外-可 见吸收光谱，通过图4在190-800nm处的紫外-可见吸收光谱，可以得到氟比洛芬溶液在 650nm没有出现新的峰，即说明核酸适配体探针不能与氟比洛芬特异性结合，金纳米粒子在 核酸适配体探针的存在下产生耐盐能力而没有产生聚集，峰没有产生迀移，即此方法可以 应用于特异性识别氟比洛芬和布洛芬的混合物。
【主权项】
1. 一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，包括：以单 链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，将不同浓度的布洛芬标准溶液与金纳米颗粒溶 液、单链核酸布洛芬适配体溶液和盐溶液混合，得到不同浓度的标准检测液，经过反应后， 根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检测体系的吸光 值，绘制标准曲线，利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度。2. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的单链核酸布洛芬适配体为长度为76bp的单链DNA探针，5'端修饰了巯基。3. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的单链核酸布洛芬适配体的序列为：5'-SHATACCAGCTTAITCAATTCCACAGACCCTTAGC TTTCCTATTATTCTGCGCGACGCTGAGATAGTAAGTGCAATCT-3'。4. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的单链核酸布洛芬适配体溶液的浓度为〇. 2yM。5. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的反应时间为30min。6. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的盐溶液为氯化钠溶液。7. 如权利要求6所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的盐溶液的浓度为1M。8. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的吸光值为在650nm和520nm处的吸光值A650和A520 ;以A640/A520为标准曲线 的横坐标或纵坐标。9. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在 于，所述的待测样品为环境水样。10. 如权利要求1所述的基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特 征在于，所述的金纳米颗粒溶液的制备方法包括：将氯金酸水溶液在油浴中加热恒温于 92±4°C，在搅拌条件下，加入柠檬酸三钠溶液，氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1 : 4,继 续搅拌反应至溶液变成清亮透明的橙红色或紫红色，得到金纳米颗粒溶液。
【专利摘要】本发明提供了一种基于适配体修饰纳米金比色检测布洛芬的分析方法，其特征在于，包括：以单链核酸布洛芬适配体为布洛芬的识别探针，将不同浓度的布洛芬标准溶液与金纳米颗粒溶液、单链核酸布洛芬适配体溶液和盐溶液混合，得到不同浓度的标准检测液，经过反应后，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检测体系的吸光值，绘制标准曲线，利用该标准曲线检测待测样品中的布洛芬的浓度。本发明的检测工作可在较短时间内完成并得到定性和定量检测结果，本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉等优点，易于推广常规应用。
【IPC分类】G01N21/78
【公开号】CN104914099
【申请号】CN201510271422
【发明人】平婧, 柳建设, 沈忱思, 娄晓祎, 刘娜, 陈名明, 于海波
【申请人】东华大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月25日