一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 细菌是一类重要的病原体，它们侵入机体后会分泌产生大量的生物毒素，从而破 坏机体的结构和功能，造成宿主感染，引发诸如破伤风、肺结核、脓毒症等多种疾病。细菌种 类繁多，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等多个菌属，且分布广泛，与人类生 活关系密切。近年来，由于饮用水、食物及生物医疗制剂的污染，由病原细菌引起的感染疾 病已成为危害人类身体健康的重要因素，引起了全球性的广泛关注。因此为开展相关疾病 的早期诊断，保护人民的身体健康，研宄细菌的快速分析检测技术具有非常重要的意义。
[0003] 目前，细菌的检测技术主要有细菌培养法和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)法。细菌培养法是目前检测细菌最常用的分析方法，主要依据细菌的形态及 生理生化反应特征来完成待检细菌的分析检测。PCR法是通过对待检细菌染色体分子的扩 增和DNA分型来实现细菌的分析检测。
[0004] 然而，细菌培养法和PCR法都存在着各自的缺点。细菌培养法的耗时较长（几天 时间），且操作繁琐，灵敏度低，稳定性差，尤其是较长的培养时间给早期细菌感染疾病的临 床诊断和指导用药带来了严重不便。PCR法的成本及技术水平要求高，且操作繁琐，需经过 细菌裂解、核酸提取及扩增等多个步骤。另外，虽然相比传统的细菌培养法，PCR法已大大 缩短了细菌的检测周期（6-10小时），但还是难以满足实际临床现场快速检测的需求。
[0005] 因此，针对上述细菌培养法和PCR法存在的不足之处，建立了一种简便的细菌现 场快速可视化检测技术具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒。该检 测方法特异性强、灵敏度高，与细菌培养法和PCR法相比，本发明所建立的细菌检测技术具 有快速、操作简单及结果肉眼可见的优点。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种细菌的检测方法，包括如下步骤：
[0009] 将检测样品与Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒（AuNPs)混合，孵育，观 察溶液颜色的变化，获得细菌浓度。
[0010] 细菌代谢的相关研宄发现，细菌表面存在着一系列的氧化还原体系，可以快速完 成不同价态金属离子（如Cu2+到Cu+)间的转化，从而避免过高浓度的高价态金属离子对其 本身产生毒害作用。本发明利用细菌此独特的氧化还原性质，通过细菌还原Cu2+引发点击 反应（Cu+催化的叠氮-炔基环加成反应）的策略，促使炔基及叠氮基团修饰的金纳米颗粒 间发生交联团聚，进而通过纳米金溶液颜色的变化（由红到蓝）实现对细菌的现场快速可 视化检测。
[0011] 本发明通过实验验证了本发明提供的检测方法可检测出IO3CFUAiL及以上的细菌 浓度。检测细菌浓度的方法为：
[0012] 溶液颜色由红色变为蓝色，检测样品的细菌浓度彡IO3CFUAiL ;
[0013] 溶液颜色无肉眼可识别的变化，检测样品的细菌浓度< 103CFU/mL。
[0014] 作为优选，Cu2+的浓度为1~10 μ Μ。
[0015] 在本发明提供的一些实施例中，Cu2+的浓度为5 μ Μ。
[0016] 作为优选，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为1~20ηΜ。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为 5· 4ηΜ〇
[0018] 作为优选，孵育的时间为10~30min。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，孵育的时间为20min。
[0020] 作为优选，孵育的温度为20~40°C。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，孵育的温度为室温（25°C )。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的制备方法 为：
[0023] 采用有机合成方法制得巯基修饰的炔基功能分子；
[0024] 采用有机合成方法制得巯基修饰的叠氮功能分子；
[0025] 疏基修饰的炔基功能分子、疏基修饰的叠氮功能分子分别和金纳米颗粒通过疏基 置换反应制得炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒。
[0026] 在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的炔基功能分子的一端为巯基，另一端 为炔基基团。
[0027] 在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的叠氮功能分子的一端为巯基，另一端 为萱氣基团。
[0028] 在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的炔基功能分子的制备方法为：
[0029] 三苯基氯甲烷与巯基烷酸反应，得到中间产物1 ;
[0030] NHS(N-羟基琥珀酸亚胺）、DCC(二环己基碳二亚胺）与中间产物1反应，得到中 间产物2 ;
[0031] 中间产物2与2, 2' -(乙烯二氧）双乙胺反应，得到中间产物3 ;
[0032] 丙炔酸、EDC(l-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺）与中间产物3反应，得到 中间产物4 ;
[0033] 中间产物4经巯基脱保护后获得巯基修饰的炔基功能分子。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，巯基烷酸为巯基十一烷酸。但本发明所用巯基烷 酸并非限定于此，巯基烷酸可用其他不同C链的巯基烷酸代替，C链长度从6 (巯基己烷酸） 到11(巯基十一烷酸）均在本发明的保护范围之内。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的叠氮功能分子的制备方法为：
[0036] 3-溴丙酸和叠氮化钠反应，得到中间产物5 ;
[0037] 中间产物5与EDC、中间产物3反应，得到中间产物6 ;
[0038] 中间产物6经巯基脱保护后获得巯基修饰的叠氮功能分子。
[0039] 在本发明提供的一些实施例中，细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 或铜绿假单胞菌中的一种或两者以上的混合物。但本发明能够检测的细菌并非限定于此， 由于细菌的表面均存在氧化还原体系，因此本发明同样适用于其它种类的细菌。
[0040] 作为优选，金纳米颗粒采用化学还原法、微乳液法或晶种生长法合成。
[0041] 在本发明提供的一些实施例中，金纳米颗粒采用化学还原法合成。
[0042] 本发明还提供了一种细菌检测试剂盒，包括Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米 颗粒。
[0043] 作为优选，Cu2+的浓度为1~10 μ M。
[0044] 在本发明提供的一些实施例中，Cu2+的浓度为5 μ Μ。
[0045] 作为优选，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为1~20ηΜ。
[0046] 在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的浓度为 5· 4ηΜ〇
[0047] 在本发明提供的一些实施例中，炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒的制备方法 为：
[0048] 采用有机合成方法制得巯基修饰的炔基功能分子；
[0049] 采用有机合成方法制得巯基修饰的叠氮功能分子；
[0050] 疏基修饰的炔基功能分子、疏基修饰的叠氮功能分子分别和金纳米颗粒通过疏基 置换反应制得炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒。
[0051] 在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的炔基功能分子的制备方法为：
[0052] 三苯基氯甲烷与巯基烷酸反应，得到中间产物1 ;
[0053] NHS、DCC与中间产物1反应，得到中间产物2 ;
[0054] 中间产物2与2, 2' -(乙烯二氧）双乙胺反应，得到中间产物3 ;
[0055] 丙炔酸、EDC与中间产物3反应，得到中间产物4 ;
[0056] 中间产物4经巯基脱保护后获得巯基修饰的炔基功能分子。
[0057] 在本发明提供的一些实施例中，巯基烷酸为巯基十一烷酸。但本发明所用巯基烷 酸并非限定于此，巯基烷酸可用其他不同C链的巯基烷酸代替，C链长度从6 (巯基己烷酸） 到11(巯基十一烷酸）均在本发明的保护范围之内。
[0058] 在本发明提供的一些实施例中，巯基修饰的叠氮功能分子的制备方法为：
[0059] 3-溴丙酸和叠氮化钠反应，得到中间产物5 ;
[0060] 中间产物5与EDC、中间产物3反应，得到中间产物6 ;
[0061] 中间产物6经巯基脱保护后获得巯基修饰的叠氮功能分子。
[0062] 本发明提供了一种细菌的现场快速可视化检测方法及其试剂盒。该检测方法包 括：将检测样品与Cu2+、炔基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒（AuNPs)混合，孵育，观察溶液 颜色的变化，获得细菌浓度。本发明至少具有如下优势之一：
[0063] 由于点击反应及细菌还原Cu2+的过程都具有很强的选择性，因此，通过此点击反 应辅助的纳米金比色法可以大大提高细菌的检测特异性，不受样品介质的影响；
[0064] 由于极其微量的Cu+就可以引发点击反应，因此相比于普通的纳米金比色法，此方 法也具有更高的细菌检测灵敏度，检测限可达IO3CFUAiL ;
[0065] 与细菌培养法和PCR法相比，本发明所建立的细菌检测技术具有快速（20分钟）、 操作简单（简单混合，无需复杂仪器辅助）及结果肉眼可见（通过AuNPs溶液颜色的变化） 的优点，可实现对细菌的现场快速可视化检测。
【附图说明】
[0066] 图1示实施例1制备得到的AuNPs的透射电镜图；
[0067] 图2示本发明基于点击反应辅助的纳米金比色法的细菌现场快速可视化检测结 果；
[0068] 图3示E. coli样品的现场快速可视化检测；其中，A示孵育前溶