>[0050] 本发明提供了调控光敏降解子desVVD或其与靶标蛋白的融合蛋白在真核宿主细 胞内的蛋白质水平的方法。可通过控制蓝光的强度控制光敏降解子或其与靶标蛋白的融合 蛋白在真核宿主细胞内的蛋白质水平。在不同的蓝光照射强度下，细胞中的光敏降解子或 其与靶标蛋白的融合蛋白的蛋白质水平会维持在不同的水平，光照强度越强，蛋白质水平 也越高。
[0051] 本发明还提供了真核宿主细胞内用蓝光控制蛋白质水平振荡的方法，即通过不断 切换光照和黑暗的光照条件，可使蛋白质水平发生大幅度的振荡。
[0052] 本发明还提供了具有高空间分辨率的蛋白质降解调控方法。在空间上保证，在同 一块平板上，光敏降解子desVVD保持稳定，而不直接受蓝光照射细胞的光敏降解子被降 解。
[0053] 本发明利用分子生物学手段产生和选择了在真核细胞内其降解速率和稳定性受 蓝光调控的光敏降解子desVVD。本发明提供了该光敏降解子desVVD的编码基因、包含所述 编码基因的重组质粒载体。本发明用该表达载体制备了光敏降解子desVVD，以及融合了靶 标蛋白的融合蛋白。本发明还提供通过蓝光控制或改变靶标蛋白在宿主细胞中的蛋白质水 平的方法。该方法具有改变幅度大、蓝光灵敏度高、作用时间短、可恢复性强、细胞毒性小等 优点。
【附图说明】
[0054] 图1显示酵母细胞的光照处理方式和光照强度。
[0055] 图2显示表达mCherry-desVVD或mCherry的酵母细胞经光照和黑暗 处理后细胞的红色荧光值。（A)mCherry-VVD(50,56) ;(B)mCherry-VVD(50,71); (C)mCherry-VVD(50, 56, 7 I) ； (D)mCherry-VVD(50, 56, 71, 76) ； (E) mCherry-VVD (40, 50, 56, 7 1) ； (F) mCherry-VVD (40, 50, 56, 71, 76) ； (G) mCherry-VVD(48, 50, 56, 71) ； (H)mCherry-VVD(50, 51, 56, 71) ； (I) mCherry-VVD (48, 50, 51, 56, 71) ； (J) mCherry-VVD (48, 50, 5 2, 56, 7 I) ； (K) mCherry-VVD (48, 50, 55, 56, 71) ； (L) mCherry-VVD (50, 51, 55, 56, 71) ； (M) mCherry-VVD (48, 50, 51, 52, 56, 71) ； (N) mCherry-VVD (48, 50, 51, 55, 56, 71) ； (0) mCherry、mCherry-VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)和 mCherry-Atlov2-s0DC; (P) mCherry-VVD (48, 50, 56, 67,71) ； (Q)mCherry-VVD(48, 50, 55, 56, 67, 71) ； (R)mCherry-VVD (48, 50, 51, 52, 56, 67, 71) ； (S) mCherry-VVD (50, 56, 69, 71) 〇
[0056] 图3为表达mCherry-desVVD或mCherry的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的 荧光成像图。
[0057] 图4显示酵母细胞中的mCherry-desVVD经黑暗处理后的降解受MG132的部分抑 制。（A)mCherry-WD(50,56) ;(B)mCherry-WD(50,56,71)。
[0058] 图5显示多种启动子表达mCherry-desVVD,经黑暗处理mCherry-desVVD都可以发 生降解，蓝光处理则仍然保持稳定。
[0059] 图6显示表达desVVD-mCherry的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的红色荧光 值。
[0060] 图7显示表达SFGFP-desVVD或SFGFP的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的绿 色荧光值（激发 485nm，发射 528nm)。（A) SFGFP-WD (50, 56) ; (B) SFGFP-WD (50, 71) ; (C) SFGFP-VVD (50, 56, 71)。
[0061] 图8显示表达Fluc-desVVD的酵母细胞经光照或黑暗处理后细胞裂解Fluc活性。 (A) Fluc-WD (50, 56) ; (B) Fluc-WD (50, 71) ; (C) Fluc-WD (50, 56, 71)。
[0062] 图9显示表达mCherry-desVVD的酵母细胞在不同的光照强度下维持不同的突光 水平。（A)mCherry-WD(40, 50, 56, 71) ; (B)mcherry-WD(40, 50, 56, 71，76)。
[0063] 图10显示表达mCherry-desVVD的果蝇细胞分别经光照和黑暗处理后细胞的红色 荧光值。（A)mCherry-WD (5〇, 56) ; (B)mCherry-WD (5〇, 56, 7I)。
[0064] 图11为表达mCherry-VVD (50, 56)的HEK293分别经光照和黑暗处理后细胞成像 图。
[0065] 图12显示表达mCherry-desVVD的HEK293分别经光照和黑暗处理后细胞 的红色突光值。（A)mCherry 和 mCherry-VVD(50,56) ;(B)mCherry-VVD(50,71) ; (C) mCherry-WD(50, 56, 71)。
[0066] 图 13 显示表达 Fluc-VVD (50, 71) (A)和 Fluc-VVD (50, 56, 71) (B)的 HEK293 分别 经光照和黑暗处理后细胞裂解液的Fluc活性。
[0067] 图14显示表达Fluc-VVD (50, 56)和Fluc的Hela分别经光照和黑暗处理后细胞 裂解液的Fluc活性。
[0068] 图15显示表征Ura3在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
[0069] 图16显示表征His3在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
[0070] 图17显示表征Sir2在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
[0071] 图18显示表征Hst2在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
[0072] 图19显示表征mAZ在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
[0073] 图20显示表达mCherry-ULD的细胞的荧光可重复性的振荡。
[0074] 图21显示用不同强度的蓝光照射处理细胞，细胞中mCherry-desVVD的蛋白质可 以维持在多种不同的水平。
[0075] 图22显示空间调控酵母细胞荧光，蓝光只可以照射字母部分的细胞。处理后的细 胞利用活体成像仪成像（kodak，美国）。
【具体实施方式】
[0076] 以下用实施例对本发明作进一步阐述。应该理解，这些实施例仅仅用于举例说明 本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难 根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求 的范围内。
[0077] 材料和方法
[0078] 实施例中主要采用常规基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技 术人员所熟知的，例如简?罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克， D.W.拉塞尔著，黄培堂等译的"分子克隆实验指南"（第三版，2002年8月，科学出版社出 版，北京）中有关章节所述的方法。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按《分子克 隆：实验指南》中所述条件，或按照制造提供试剂盒厂商所建议的条件执行。
[0079] 实施例中所用的酵母表达质粒载体pGADH改造自ClonTech公司购买的pGADT7,将 编码gal4AD结构域的基因序列切除获得启动子为ADH的酵母表达空质粒。实施例中所用 的果蝇细胞表达质粒载体pAc5. 1和哺乳动物细胞表达载体pcdna3. 1购买自Life science 公司。
[0080] 实施例中的所用的克隆大肠杆菌菌株Machl、BL21和酵母菌株BY4742均购自 Invitroten公司，Machl因包含tonA基因缺失突变而对Tl和T5噬菌体具有抗性。实施例 中表达所用的果蝇细胞S2、哺乳动物细胞HEK293和Hela。
[0081] 实施例中普遍采用了聚合酶链式反应（PCR)。我们设计的用于PCR的所有引物均 由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例所用的Taq DNA 聚合酶购自东盛生物，Pfu DNA聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司，PrimeSTAR DNA 聚合酶购自上海TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附赠相应聚合酶缓冲液和dNTP。NcoI、 Nhel、EcoRI、Xhol、Hindlll、KpnI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶（T4PNK)购自 Fermentas公司，购买时附带有lOXTango?缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR克隆 试剂盒（含同源重组酶）购自南京金斯瑞生物科技有限公司（原金思特科技（南京）有限 公司）。化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。
[0082] 本发明实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司（上海），质粒小抽试剂盒购 自天根生化科技（北京）有限公司。
[0083] 本发明实施例中用到的主要仪器有：Biotek Synergy2多功能酶标仪（美国 BioTek公司），Microfuge22R台式高速冷冻离心机（美国beckman公司），PCR扩增仪（德 国Biometra公司），突光倒置显微镜（日本Nikon公司），活体成像仪（美国Kodak公司）。 [0084] 本发明实施例中所用的靶标蛋白和野生型光敏蛋白等的基因序列均通过计算机 检索NCBI (美国国立生物技术信息中心）网站获得。检索各蛋白编码基因的具体网站如 下：
[0085] VVD ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/32405346 ? report = genpept
[0086] SFGFP ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/379069012
[0087] mCherry ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/378532224
[0088] Flue ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/AFA52656. I
[0089] Ura3 ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_010893. 3
[0090] His3 ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_014845. I
[0091] Sir2 ：http://www.ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_010242. I
[0092] Hst2 ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_015310.1
[0093] mAZ ：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_032779. 2
[0094] 实施例中用到的常规分子生物学方法
[0095] ( -）聚合酶链式反应（PCR):
[0096] 1.目的片段扩增PCR :
CN 105177023 A 说明书 10/27 页
[0107] (二）核酸内切酶酶切反应：
[0108] 1.对质粒载体进行双酶切的体系（η代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超 纯水μ L量）：
[0110] 2.对PCR产物片段进行双酶切的体系（η含义同上）：
[0112] 3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环的体系：
[0114] 注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1-6:1之间。
[0115] (三）DNA片段5'端磷酸化反应然后自身环化反应：
[0116] 从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故 需对PCR产物的5'端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发 生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3'端和5'端连接反应。
[0117] CN 105177023 A 说明书 11/27 页
[0118] T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5'端磷酸基团的加成反 应。使5'端磷酸化的DNA片段产物自身环化的反应体系：
[0120] (四）同源重组连接反应（按照CloneEZ克隆试剂盒，南京金斯瑞生物科技有限公 司说明书操作）：
[0121] PCR产物片段扩增时在两侧加入了 15bp与线性化载体两侧的15bp核酸序列同源 的核苷酸序列，扩增得到的PCR产物两侧15bp核苷酸序列与线性化载体序列两侧核苷酸序 列同源，在同源重组酶的作用下，PCR产物片段与线性化载体同源重组连接成环状。
[0123] 注：η值视PCR产物片段的大小而不同，小于Ikb时n = 4，l-2kb时n = 6,2-3kb 时η = 8,大于3kb时η = 10。
[0124] (五）重组质粒转化酿酒酵母
[0125] 酵母首先在Yro培养基（1 %酵母粗提粉，2%蛋白胨和2%葡萄糖）中30°C培养， 培养至0D600在I. 0左右可以用于制备酵母转化感受态或冻存。转化质粒的酵母用营养缺 陷型的合成培养基（包含YNB、葡萄糖、除缺陷型以外的氨基酸、核苷酸）30°C培养。
[0126] 酵母转化方法参照文献[Gietz等，Nat Protoc. 2007, 2(1) :35-37]。酵母细胞首 先用1*TE缓冲液洗两次，然后用100 μ L含5mM醋酸锂的1*TE缓冲液重悬，并于30°C放置 lOmin，之后加入约1 μ g的质粒，并加入700 μ L含IOmM醋酸锂和40 % PEG3350的1*TE缓 冲液稀释并混匀，放入30°C摇床中约30min后，加入88 μ L的DMSO, 42°C热激7-10min。之 后离心，并用1*TE缓冲液清洗两次，涂在营养缺陷型的合成培养基平板上。
[0127] (六）重组质粒转化果蝇细胞
[0128] 脂质体转染（购自Invitrogen):配制复合物1 :质粒（单质粒0· 2μ g/mm2， 双质粒各 〇· 1 μ g/mm2)，〇pti_MEM(25 μ T,/mm2)和复合物 2 :lipo2000 (0· 6 μ T,/mm2)， opti-MEM(25 μ L/mm2)室温孵育5min。复合物1与2混合，并孵育20min，最后加入预先在 孔板中培养的细胞并混匀。
[0129] (七）重组质粒转化哺乳动物细胞
[0130] 哺乳动物细胞传代：用巴氏吸管吸走培养皿中的培养基，PBS清洗一次后用胰酶 消化，再用2. 5ml的培养基（含10%牛血清的DMEM培养基，购自Gibco)中和胰酶。新的培 养皿中先加好信息培养基，再加入1ml重悬的细胞。放入培养箱之前要进行摇匀。用于铺 板的细胞，最终Imm2的面积含200 μ L的培养基，例如分装前直接稀释成12mU60mm2)，但是 96孔板除外，100 μ L/孔。
[0131] 脂质体转染（购自Invitrogen):配制复合物1 :质粒（单质粒0· 2μ g/mm2， 双质粒各 〇· 1 μ g/mm2)，〇pti_MEM(25 μ T,/mm2)和复合物 2 :lipo2000 (0· 6 μ T,/mm2)， opti-MEM(25 μ L/mm2)室温孵育5min。复合物I与2混合，并孵育20min，最后加入铺好细 胞的培养板中并混匀。
[0132] 以下通过实施例和附图对本
【发明内容】
作进一步阐述。
[0133] 实施例1. pGADH-mCherry-VVD (50)酵母细胞表达载体的构建
[0134] 1.构建酵母细胞表达载体pGADH (不含gal4的AD结构域编码基因序列的pGADT7)
[0135] 根据PGADT7序列设计gal4的AD结构域编码基因序列两端扩增载体的序列的引 物：
[0136] 引物 PI : 5 ' -ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCC-3 '
[0137] 引物 P2 :5 ' -CTTT