SFGFP-WD (50, 56, 71)。所 用的酶切位点相同，所用的引物如下（前者为正向引物，后者为反向引物）。
[0238] P32 ：GAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG
[0239] P33 ：GACGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCA
[0240] 实施例 3. pGADH-VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71) -mCherry 的构建
[0241] I. pGADH-WD(48, 50, 51，52, 55, 56, 71)的构建
[0242] 根据VVD基因核苷酸序列设计以下引物：
[0243] 引物 P34 :5，-CCCCCATGGCTCATACGCTCTACGCTCCC-3，
[0244] 引物 P35 :5，-GAAGAATTCAGAAGCTTCCGTTTCGCACTGGAAAC-3，
[0245] P34含NcoI酶切位点（下划线CCATGG)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码突 变的两个核苷酸，第12-29个核苷酸与VVD基因（不含1-36个氨基酸编码基因序列）的编 码序列的5'端18个核苷酸完全一致，P35含EcoRI酶切位点（下划线GAATTC)，第16-35 个核苷酸与VVD基因的编码序列的3'端20个核苷酸完全反向互补。采用P34和P35引 物，以含 WD(48, 50, 51，52, 55, 56, 71)基因的 pGADH-mCherry-WD(48, 50, 51，52, 55, 56, 7 1)载体为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)基 因。用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回 收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒pGADH。用DNA纯化 试剂盒（BBI)分别回收酶切的载体和VVD(48, 50, 51，52, 55, 56, 71)基因序列，按上面所述 酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Machl并培养，通过提取获得 pGADH-WD(48, 50, 51，52, 55, 56, 71)质粒。
[0246] 2. pGADH-VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71) -mCherry 的构建
[0247] 根据mCherry基因核苷酸序列设计以下引物：
[0248] 引物 P36 :5，-GTGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3，
[0249] 引物 P37 :5，-GAGCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCC-3，
[0250] P36含EcoRI酶切位点（下划线GAATTC)，第10-31个核苷酸与mCherry基因的编 码序列的5'端22个核苷酸完全一致，P37含XhoI酶切位点（下划线CTCGAG)，第10-29个 核苷酸与mCherry基因的编码序列的3'端20个核苷酸完全反向互补。采用P36和P37引 物，以含mCherry基因的pcdna3. Ι-mCherry载体（本实验室原先构建并保存）中的mCherry 基因为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增mCherry基因。用1%琼脂糖凝胶电 泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用EcoRI 和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH-VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)。用DNA 纯化试剂盒（BBI)分别回收酶切的载体和VVD基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二 者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Machl并培养，通过提取获得pGADH-WD (48, 50, 51， 52, 55, 56, 71)-mCherry 质粒。
[0251] 实施例 4. pGTEF-mCherry-WD (50, 56)的构建
[0252] 设计以下引物扩增TEF启动子：
[0253] 引物 P38 :5，-TTCGTTGCTTGCATGCATAGCTTCAAAATGTTTC-3 '
[0254] 引物 P39 :5，-CATCTTTGCAAAGCTAAACTTAGATTAGATTGC-3 '
[0255] P38的第1-15个核苷酸（下划线部分）与pGADH载体上ADH启动子上游载体上 的15个核苷酸完全相同，第16-34个核苷酸与TEF启动子核苷酸序列完全相同。P39的第 1-15个核苷酸（下划线部分）与pGADH载体上ADH启动子下游载体上的15个核苷酸完全 反向互补，第16-33个核苷酸与TEF启动子3'端核苷酸序列完全反向互补。采用P5和P9 引物，以酵母BY4742基因组为模板，按照上面所述的扩增目的片段的PCR方法，扩增TEF启 动子序列。
[0256] 设计以下引物扩增除ADH启动子序列外的pGADH-mCherry-VVD (50, 56):
[0257] 引物 P40 :5，-GCATACAATCAACTCCAAGCTT-3，
[0258] 引物 P41 :5，-CTGCAGGCATGCAAGCAACGAA-3 '
[0259] P40的核苷酸（下划线部分）与pGADH-mCherry-VVD (50, 56)载体上 ADH启动子下游载体上的22个核苷酸完全相同，P41的核苷酸（下划线部分）与 pGADH-mCherry-VVD (50, 56)载体上ADH启动子上游载体上的22个核苷酸完全反向互补。 采用P40和P41引物，以pGADH-mCherry-VVD (50, 56)为模板，按上面所述长片段的PCR条 件扩增不含ADH启动子序列的载体序列。
[0260] 用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒 回收TEF启动子序列和不含启动子序列的载体序列。按上面所述同源重组连接方法将TEF 启动子序列与不含启动子的载体同源重组，用此重组质粒转化菌株Machl并培养，通过提 取质粒获得酵母细胞表达载体pGTEF-mCherry-VVD(50, 56)的构建。
[0261] 实施例 5. pGADH605-mCherry-WD (50, 56, 71)的构建
[0262] 设计以下引物：
[0263] 引物 P42 :5，-CATGTAGGTGGCGGAGGGGAG-3 '
[0264] 引物 P41 :5，-CTGCAGGCATGCAAGCAACGAA-3 '
[0265] P42的核苷酸序列与ADH启动子倒数第605-585个核苷酸序列完全相同。采用P42 和P41引物，以pGADH-mCherry-VVD (50, 56, 71)为模板，按上面所述长片段的PCR条件扩增 不含ADH启动子部分5 '端的序列的载体序列。用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目 的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。按照上面所述DNA片段5'端磷酸化 反应然后自身环化反应的步骤，将环化的反应液转化大肠杆菌克隆菌株Machl，通过提取质 粒获得 pGADH605-mCherry-VVD(50, 56, 71)。
[0266] 实施例 6. pAc5. InCherry-VVD (50, 56)的构建
[0267] 设计以下引物：
[0268] 引物 P43 :5，-GGGGGTACCGCAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3，
[0269] 引物 P6 :5 ' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3 '
[0270] P43含有KpnI酶切位点（GGTACC)，第10-18个核苷酸是kozak序列，第16-37个核 苷酸序列与mCherry编码基因的第1-22个核苷酸序列完全相同。采用P34和P35引物，以 含mCherry-VVD (50, 56)基因的pGADH-mCherry-VVD (50, 56)载体为模板，按上面所述目的 基因片段的PCR条件扩增VVD (50, 56)基因。用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的 扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此 二酶双酶切体质粒pAc5.1。用DNA纯化试剂盒（BBI)分别回收酶切的载体和VVD(50, 56) 基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Machl 并培养，通过提取获得pAc5. l-mCherry-VVD(50,56)质粒。
[0271] 按照上面相同的方法，相同的引物，分别应用pGADH-mCherry-VVD(50, 71)和 pGADH-mCherry-WD(50, 56, 71)为模板扩增目的片段，构建 pAc5. l-mCherry-WD(50, 71) 和 pAc5. l-mCherry-WD(50, 56, 71)。
[0272] 实施例 7. pcdna3. Ι-mCherry-VVD (50, 56)的构建
[0273] 设计以下引物
[0274] 引物 P44 :5，-GGGAAGCTTGCAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3，
[0275] 引物 P6 :5 ' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3 '
[0276] P43含有HindIII酶切位点（AAGCTT)，第10-18个核苷酸是kozak序列，第16-37 个核苷酸序列与mCherry编码基因的第1-22个核苷酸序列完全相同。采用P34和P35引 物，以含mCherry-VVD (50, 56)基因的pGADH-mCherry-VVD (50, 56)载体为模板，按上面所述 目的基因片段的PCR条件扩增VVD (50, 56)基因。用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中 的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切， 同时用此二酶双酶切体质粒pcdna3. 1。用DNA纯化试剂盒（BBI)分别回收酶切的载体和 WD(50, 56)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化 菌株Machl并培养，通过提取获得pcdna3. l-mCherry_VVD(50,56)质粒。
[0277] 按照上面相同的方法，相同的引物，分别应用pGADH-mCherry-VVD(50, 71)和 pGADH-mCherry-VVD (50, 56, 71)为模板扩增目的片段，构建pcdna3. 1-mCherry-VVD (50, 71) 和 pcdna3. l-mCherry-VVD(50, 56, 71)。
[0278] 按照上面相同的方法，以下面的引物：
[0279] P45 :5, ~GGAGCTAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC~3>
[0280] P6 :5, -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0281] 分另Ij 以 pGADH_Fluc_VVD (50, 56)、pGADH_Fluc_VVD (50, 71)和 pGADH-Fluc-VVD (50, 56, 71)为模板扩增目的片段，构建 pcdna3. I-Fluc-VVD (50, 56)、 pcdna3. I-Fluc-WD (50, 71)和 pcdna3. I-Fluc-WD (50, 56, 71)。
[0282] 实施例 8· pGADH-Sirf-mCherry-WD (48, 5〇, 56, 7I)的构建
[0283] 设计以下引物：
[0284] P46 :5' ~GGGACATGTCTATGACCATCCCACATATGAAATAC~3>
[0285] P47 :5' -GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'
[0286] P48 :5' -CATGGACCCAGAACCGAGGGTTTTGGGATGTTCATC-3'
[0287] P6 :5' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0288] P46含PstI酶切位点（下划线ACATGT)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码 突变的两个核苷酸，第12-35个核苷酸与Sir2基因的编码序列的5'端24个核苷酸完 全一致。P47的第16-31个核苷酸与Sir2编码基因3'端16个核苷酸（不包含终止密 码子）完全反向互补。P48的第16-36个核苷酸与mCherry编码基因3'端21个核苷酸 完全相同。P47与P48的5'端15个核苷酸完全反向互补。采用P46、P47、P48、P6为引 物，BY4742的基因组和pGADH-mCherry-VVD(48, 50, 56, 71)为模板，按照下面的体系扩增 Sir2-mCherry-WD(48, 50, 56, 71)基因片段。
[0290] 用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒 回收该扩增子，序列用NcoI和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH。用DNA纯 化试剂盒（BBI)分别回收酶切的载体和VVD(50, 56, 71)基因序列，按上面所述酶切后连接 方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Machl并培养，通过提取获得？640^^2- mCherry-VVD(48, 50, 56, 71)质粒载体。
[0291] 以相同的方式构建了以下几种功能基因和mCherry-VVD的突变体融合表达的酵 母细胞表达载体：
[0292] pGADH-Ura3-mCherry-VVD(50, 56, 71)
[0293] P49 :5' ~GGACCATGGCTATGTCGAAAGCTACATATAAG~3>
[0294] P50 :5, -CATGGACCCAGAACCGTTTTGCTGGCCGCATC-3'
[0295] P51 :5' -GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'
[0296] P6 :5' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0297] pGADH-His3-mCherry-VVD (48, 50, 51, 52, 55, 56, 71)
[0298] P52 :5, -GGTCCATGGTGATGACAGAGCAGAAAGCC-3'
[0299] P51 :5, -CATGGACCCAGAACCCATAAGAACACCTTTGG-3'
[0300] P53 :5' -GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'
[0301] P6 :5' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0302] pGADH-Hst2-mCherry-VVD (50, 51, 55, 56, 71)
[0303] P54 :5' -GGGACATGTCTATGTCTGTTTCTACCGCCTC-3'
[0304] P55 :5' -GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'
[0305] P56 :5' -CATGGACCCAGAACCTTCTTTAGCGGCTTTTTGTGAAG-3'
[0306] P6 :5, -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0307] pGADH-mAZ-mCherry-VVD(50, 56, 71, 76)
[0308] P57 :5' -GAACCATGGTGAAATCCTCCC-3'
[0309] P58 :5, -CATAGACCCAGAACCTGCCTCCTCCTCCTCTCCCGAAGAC-3，
[0310] P51 :5, -CATGGACCCAGAACCCATAAGAACACCTTTGG-3'
[0311] P6 :5 ' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0312] 实施例9.光敏降解子VVD (50, 56, 71)的纯化
[0313] 设计以下引物：
[0314] 引物 P59 :5，-CCCGGATCCCATACGCTCTACGCTCCC-3'
[0315] 引物 P6 :5' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3'
[0316] P59含BamHI酶切位点（下划线GGATCC)，第10-27个核苷酸与VVD (50, 56, 71)基 因的编码序列的5'端18个核苷酸完全一致。P6含XhoI酶切位点（