一种基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种弯曲菌的分离培养方法。
【背景技术】
[0002] 弯曲菌是导致人类疾病的主要食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原。在欧 美等经济发达国家，弯曲菌的感染位居食源性病原菌感染的首位，发展中国家弯曲菌的感 染率为发达国家的100倍。除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症，给人类 带来严重的疾病负担。
[0003] 我国弯曲菌的感染普遍存在，但是弯曲菌感染的现状缺乏准确数据。细菌的分离 培养仍是目前诊断空肠弯曲菌感染的金标准。同时获得病原菌株对于进一步病原致病机理 的研究具有重要意义。
[0004] 目前我国无论公共卫生还是个体临床治疗都开始弯曲菌感染的相关研究及防治， 但由于弯曲菌体外培养条件苛刻，同时由于我国抗生素使用的不规范，造成无论患者以及 规模化养殖的家禽、家畜肠道内耐药菌群增加，造成目前使用传统选择性培养基很难从样 本中分离到弯曲菌，从而造成相关研究及防治的滞后。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于确定一种基于滤膜孔径及通透性的弯曲菌的分离培养方法，解 决由于样品中其它菌群耐药的增强造成的选择性培养基检出率降低的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于滤膜通透性的弯曲菌的分 离培养方法，包括以下步骤： (1) 取kamali羊血平板及哥伦比亚平板，室温条件下放置30min ; (2) 将滤膜铺于基础培养基平板上，格子面朝上，待培养基和滤膜完全贴合，并标上相 应编号； (3) 将标本吹打混匀，吸取约250ul左右分点滴于kamali血平板、哥伦比亚血平板滤膜 中央部分，平皿朝上，37度三气培养箱中搁置45min ; (5) 取出点样的平板，用镊子轻轻夹取滤膜边缘洁净部分，揭去滤膜及残渣，留平板，37 度三气培养箱中培养48h ; (6) 挑取滤膜范围内的可疑单克隆菌落，接种新的基础培养基平板进行纯培养； (7) 取新鲜可疑菌一环，进行触酶、氧化酶生化试验，二者均为阳性者，结果判读为弯曲 菌。
[0007] 本发明的基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法，利用细菌的形态及理化特 征，以特异孔径、特异通透性亲水性的滤膜，替代弯曲菌的选择性培养基，解决样本中耐药 杂菌增高导致的弯曲菌检测率降低的问题，样品中弯曲菌的检出率可达到101 CFU/ml。本发 明的基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法，操作简单，大大缩减了获得病原体的检测 成本，提高检出率。
【附图说明】
[0008] 图Uio1CFUAiI (约8-9个单克隆）弯曲菌在两种不同基础培养基生长的差异； 图2、IO2浓度(约80-90个单克隆)，弯曲菌在两种不同基础培养基上37°C与42°C生长 的差异； 图3、不同浓度弯曲菌在不同孔径滤膜上穿透能力比较； 图4、超低温冷冻粪便标本弯曲菌采用不同方法分离培养结果比较； 图5A、不同稀释度模拟样品制备后，传统方法的培养、计数观察； 图5B、IOuL打点计数结果观察； 图6、IO6CFlVg粪便标本滤膜法分离弯曲菌结果； 图7、8、9为本发明的方法对零售鸡肝中弯曲菌分离培养的生化鉴定结果； 图10、本发明的方法对零售鸡肝中弯曲菌分离培养后弯曲菌多重PCR鉴定结果； 图11、采用本发明的方法培养弯曲菌特异度评价结果； 图12、采用本发明的方法培养弯曲菌特异度荧光定量PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合具体实施例来对本发明的基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法做 详细的介绍和说明。下述实验中将本发明的基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法，简 称为滤膜法。
[0010] 一、不同基础培养基弯曲菌生长能力比对 1、不同浓度稀释菌液制备及不同基础培养基上弯曲菌生长比对： ① 收集24h，37°C培养的ATCC33560和ATCC33559悬于生理盐水中； ② 生理盐水细菌2遍，重新悬于5mL生理盐水中，充分混匀； ③ 测量菌悬液OD值，根据OD值计算弯曲菌的量，将ATCC33560和ATCC33559从10°~ IO5进行6个梯度的倍比稀释； ④ 将稀释好的菌株分别接种在哥伦比亚及Karmarli平皿培养基上，观察、比较不同基 础培养基上弯曲菌的生长。
[0011] 2、结果：两种基础培养基弯曲菌生长没有显著差异，见图1、2所示。
[0012] 3、不同浓度弯曲菌在不同孔径滤膜上穿透能力比较 将不同孔径（〇· Ium~Ium)无菌滤膜用生理盐水浸湿后，将不同稀释浓度（10°~IO5) 菌液取250ul滴在滤膜上，比较不同稀释度、不同滤膜细菌生长。
[0013] 结果如图3所示，针对弯曲菌，0.4um孔径的滤膜的IO1~IO2菌液通透性显著高 于其它滤膜。
[0014] 二、冷冻粪便标本弯曲菌的直接划线培养与滤膜法分离培养菌落差异 1、采用本发明的滤膜法培养粪便标本中弯曲菌； (1) 取常温标本或从-80度超低温冰箱取出冷冻标本，编号并待其完全融化； (2) 取kamali羊血平板及哥伦比亚平板，室温条件下放置30min ; (3) 酒精棉擦拭眼科镊并晾干。轻轻撕开滤膜袋口，用已消毒的眼科镊夹住滤膜边缘， 轻轻将滤膜取出（不可戳破滤膜，若不小心损坏滤膜则丢弃，另取一张滤膜)，铺于哥伦比亚 /kamali羊血平板上(格子面朝上)，待培养基和滤膜完全贴合，并标上相应编号； (4) 用剪刀剪去枪头尖部，以免吸取标本时发生堵塞； (5) 将融化的标本吹打混匀，吸取约250ul (可视实际情况酌情加减）左右分点滴于滤 膜上； (6) (避免气泡或气溶胶的产生，或者将标本洒出滤膜范围内），平皿朝上，37度三气培 养箱中搁置45min (动作宜轻、慢）； (7) 取出点样的平板，用镊子轻轻夹取滤膜边缘洁净部分，揭去滤膜及残渣，留平板，37 度三气培养箱中培养48h ; (8) 挑取滤膜范围内的，微黄色小菌落接种kamali血平板进行纯培养(传代、提取核 酸、生化、镜检用）。
[0015] 2、采用直接划线法培养粪便标本中弯曲菌 (1) 取常温标本或从-80度超低温冰箱取出冷冻标本，编号并待其完全融化； (2) 取kamali羊血平板及哥伦比亚平板，室温条件下放置30min ; (3) 在上述基础培养基上三区划线后，再分别置于37°C和42°C微需氧环境（5%02、 10%C02和85%N2)中观察菌落的生长情况。
[0016] 3、结果见图4所示，A为直线划线法培养的菌落，B、C为滤膜法培养的弯曲菌菌落， 滤膜法培养的菌落生长状态明显优于划线法。
[0017] 三、不同浓度弯曲菌采用传统方法和本发明的滤膜法分离培养结果对比 1. 1、细菌定量 ① 收集24h，37°C培养的ATCC33560和ATCC33559悬于生理盐水中； ② 生理盐水细菌2遍，重新悬于5mL生理盐水中，充分混匀； ③ 用10 μ 1接种环刮取新鲜细菌培养物少量溶于200 μ 1生理盐水中，用移液器吹打混 匀呈浓度均匀的悬浊液并将此管作为原液； ④ 测量菌悬液的OD值，根据OD值计算弯曲菌的量； ⑤ 将ATCC33560和ATCC33559从10°~10 5进行6个梯度的倍比稀释； ⑥ 将原液连续两次10倍倍比稀释，用紫外分光光度计测得OD值为0. 8~I. 0之间，按 IOD~3Χ 10sCFU/ml计算，取100 μ 1高一级浓度的菌液加入900 μ 1的生理盐水中，10倍 稀释使菌液的浓度依次为 l〇7CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、10 4CFU/ml、103CFU/ml、IO2CFU/ ml UO1CFlVml 和 IO0CFlVmlo
[0018] 2实验室粪便标本模拟检测实验 2. 1模拟粪便样品制备 (1) 于12支EP管中分别称取粪便0. 2克（6支空肠弯曲菌，6支结肠弯曲菌)，分别加 入 IO5、104、103、102、101、IO 0细菌； (2) 与2支EP管中分别加入IO5 ATCC33560和ATCC33559,充分混匀； (3) 将2中的2支掺有空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的粪便标本分别进行104/、103、102、10 1、 10°稀释，取IOul做打点计数和划线培养用。
[0019] 结果：IOuL打点计数培养结果见图5B ; (1)细菌定量 推算ATCC33