560原液的菌量为2· 05X IO6CFUAiL ; 推算ATCC33559原液的菌量为0. 99X 106CFU/uL。
[0020] (2)、细囷惨入培养结果 (1)将倍比稀释的样品标本培养
上表为菌落划线培养结果，目的是计数在不同浓度的菌落数目。
[0021] 3、传统方法细菌培养 吸取100 μ 1混合均匀的IO6 CFU/g和IO3CFlVg粪菌模拟混合液分别接种于三种选择 性培养基（Karmali加血选择培养基、Karmali无血选择培养基和Columbia选择性培养基） 上三区划线后，再分别置于37°C和42°C微需氧环境（5%02、10%〇)2和85%N 2)中观察菌落的生 长情况。不同稀释度模拟样品制备后，传统方法的培养结果如图5A所示。
[0022] 4、本发明的滤膜法培养弯曲菌 取kamali羊血平板，室温条件下放置30min ;将孔径为0. 2um的滤膜铺于哥伦比亚和 kamali羊血平板上，格子面朝上，待培养基和滤膜完全贴合；用移液管分别吸取100 μ 1、 200 μ 1、300 μ 1、400 μ 1和500 μ 1混合均匀的IO6 CFU/g和IO3CFlVg粪菌模拟混合液分三 点或五点滴于孔径为0. 4um滤膜上，42°C微需氧环境放置50min~Ih ;移去滤膜，置于37°C 和42°C微需氧环境（5%02、10%〇)2和85%N 2)中培养观察24~48h，结果见图6。
[0023] 四、采用本发明的滤膜法对50份粪便标本中弯曲菌进行分离培养 1、实验步骤： 1、 首先从-80度冰箱中取出50个标本，常温融解； 2、 取无菌哥伦比亚血平板、kamali血平板。已消毒的镊子夹取滤膜轻轻贴于各个平 板。并在平皿底部写上与标本对应的编号和接种日期； 3、 取无菌枪头（lOOOul)，剪去枪头尖，以免吸取标本液体时堵塞； 4、 开启标本时，先将标本液体吹打混匀，再分别取250ul分点滴于kamali血平板、哥 伦比亚血平板滤膜中央部分； 5、 将带滤膜和标本液体的平板正面向上置于37度三气培养箱中lh，弃滤膜和残渣， 将平板置于37度三气培养箱中继续培养24-48h ; 6、 挑取可疑单克隆（哥伦比亚血平板：表面湿润、微黄色，边缘光滑；kamali羊血平 板：表面湿润、微红色、边缘光滑)，接种新的kamali羊血平板，37度三气培养箱中培养约 24h ； 7、 取新鲜可疑菌一环，进行触酶、氧化酶生化试验，二者均为阳性者，结果判读为弯曲 菌； 8、 取触酶、氧化酶阳性的菌做Col、jun、map-A、16s、ceu多重PCR，以此鉴别空、结弯， 见表1。
[0024] 2、实验结果 表1、本发明的滤膜法对粪便样品中弯曲菌分离培养检测结果(部分） CN 105177105 A 说明书 5/8 页
此次50个粪便标本检出弯曲菌阳性标本10个，阳性率为20% (10/50)，其中5个为结 肠弯曲菌，5个为空肠弯曲菌。其中哥伦比亚血板检出阳性标本5个，kamali血平板检出阳 性标本5个，共同检出4个标本。划线选择性培养基分离到阳性菌4个（8%)，显著低于本发 明的方法。
[0025] 五、采用本发明的滤膜法对零售鸡肝中弯曲菌进行分离培养 I、实验步骤 1. 1、用消毒镊子将鸡肝放入不同的平皿中，用巴氏吸管吸约3ml生理盐水冲洗鸡肝表 面3 ~5次，生理盐水可根据鸡肝大小酌情加减； 1. 2、鸡肝表面：巴氏吸管吸约3滴左右冲洗液于贴有滤膜的karmali基础培养基上， 三区划线，置于42°C三气培养箱（5%02,10%C02,85%N2)培养24~48小时并记录生长情况；鸡 肝内部：将鸡肝浸泡于75%的酒精中3min，在通风橱中晾干直至鸡肝表面无液体，用消毒的 剪刀和镊子剪去鸡肝表面组织暴露内部组织，消毒剪刀后将内部组织剪碎，吸约3ml生理 盐水冲洗，然后冲洗液分别滴入贴有滤膜的karmali基础培养基上，置于42°C，三气培养箱 (5%02,10%C02,85%N2)培养24~48小时并记录生长情况； 1. 3、挑可疑菌落传代培养24h后进行革兰染色镜检，用氧化酶和过氧化氢酶水解进行 初步鉴定，用多重PCR法进行验证。
[0026] DNA模板的制备：刮取少量可疑菌混匀于200ul超纯水中，沸水中煮lOmin，取出立 即置于冰上lOmin，最大转速离心5min，用移液器取上清液作为多重PCR模板进行检测。
[0027] 2、检测结果： 2.1、弯曲菌生化鉴定结果 (1)氧化酶试验结果：使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取单个菌落的一部分，然后接种 到用氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10秒内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性，弯曲 菌则为阳性，见图7。
[0028] (2) API生化检测系统鉴定结果为弯曲菌，见图8。
[0029] (3)过氧化氢酶水解结果：挑取一环菌落培养物，加到在干净显微镜玻片上的一滴 3%过氧化氢溶液中，如果在30秒内出现气泡则判定结果为阳性，见图9。
[0030] 2. 2弯曲菌多重PCR鉴定结果 通过弯曲菌多重PCR鉴定结果：空肠弯曲菌和结肠弯曲菌分别扩增出两条目的带，根 据目的带分子量大小确定弯曲菌的种类，见图10。
[0031] 2. 3、160份鸡肝标本滤膜法弯曲菌检测结果 160份鸡肝标本共分离到42株弯曲菌，经多重PCR鉴定，30株为空肠弯曲菌，12株为结 肠弯曲菌，鸡肝弯曲菌的感染率为26%，见表2。
[0032] 表2、本发明的滤膜法对鸡肝中弯曲菌的检测结果
CN 105177105 A 说明书 8/8 页
六、粪便标本弯曲菌采用本发明的过滤法培养特异性评价 利用荧光定量PCR的方法确定为弯曲菌污染阴性标本，分别进行传统的划线培养以及 过滤培养方法，结果滤膜分离培养的方法在培养中过滤掉100%其它杂菌，见图11和12。
[0033] 本发明的基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法，以特异孔径、特异通透性亲 水性的滤膜，替代弯曲菌的选择性培养基进行样本中耐药杂菌增高导致的弯曲菌检测率降 低的问题，样品中弯曲菌的检出率可达到10lCFU/ml。本研究建立的滤膜分离方法操作简 单，大大缩减了获得病原体的检测成本，提高检出率。
【主权项】
1. 一种基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法，包括以下步骤： (1) 取kamali羊血平板及哥伦比亚平板，室温条件下放置30min ; (2) 将滤膜铺于基础培养基平板上，格子面朝上，待培养基和滤膜完全贴合，并标上相 应编号； (3) 将标本吹打混匀，吸取约250ul左右分点滴于kamali血平板、哥伦比亚血平板滤膜 中央部分，平皿朝上，37度三气培养箱中搁置45min ; (5) 取出点样的平板，用镊子轻轻夹取滤膜边缘洁净部分，揭去滤膜及残渣，留平板，37 度三气培养箱中培养48h ; (6) 挑取滤膜范围内的可疑单克隆菌落，接种新的基础培养基平板进行纯培养； (7) 取新鲜可疑菌一环，进行触酶、氧化酶生化试验，二者均为阳性者，结果判读为弯曲 菌。2. 根据权利要求1所述的基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法，其特征在于：所 述滤膜的孔径为〇? Ium~Ium0
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种基于滤膜通透性的弯曲菌的分离培养方法。该方法包括以下步骤：（1）取kamali羊血平板及哥伦比亚平板；（2）将滤膜铺于上述平板上，格子面朝上，待培养基和滤膜完全贴合；（3）将标本吹打混匀，吸取约250ul左右分点滴于kamali血平板、哥伦比亚血平板滤膜中央部分，平皿朝上，37度三气培养箱中搁置45min；（5）取出点样的平板，用镊子轻轻夹取滤膜边缘洁净部分，揭去滤膜及残渣，留平板，37度三气培养箱中培养48h；（6）挑取滤膜范围内的可疑单克隆菌落，接种新的基础培养基平板进行纯培养；（7）取新鲜可疑菌一环，进行触酶、氧化酶生化试验，二者均为阳性者，结果判读为弯曲菌。本发明的方法操作简单，提高检出率。
【IPC分类】C12Q1/04
【公开号】CN105177105
【申请号】
【发明人】刘晓明, 张茂俊, 葛安山, 孙莎莎, 宋玉龙
【申请人】青岛中创生物科技有限公司, 青岛康大食品有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月11日