基于宫颈液基细胞学与dna甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于宫颈液基细胞学与DNA甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约为528, 000例，死 亡病例约有266, 000例，其中约85 %发生在发展中国家。中国的发病率居高不下，为 7. 5/100, 000,死亡率为3. 4/100, 000。在一些缺乏合理筛查的落后地区，发病率甚至高达 81/100, 000。初步估计，至2030年，每年死于宫颈癌的患者约有474, 000例，其中超过95% 可能发生于落后及发展中国家。因此，寻找宫颈癌早期筛查的有效方法，筛查出宫颈癌前病 变以及肿瘤患者，实施有效的早诊、早治具有重要意义。
[0003] 目前，我国采用的是以宫颈液基细胞学为主要内容的宫颈癌筛查策略，同时局部 采用HPV-DNA+细胞学联合筛查。我国尚未建立完善的国家筛查体系，而且由于筛查的 不平衡性（地域经济、医疗资源、公众认知等影响因素），导致目前筛查缺乏与筛查过度 并存、不规范治疗与过度治疗并存。宫颈液基细胞学存在1、单一应用敏感性不高（约为 50% -85% ) ;2、AS⑶S及LSIL的特异性不高；3、取材、制片、阅片水平的参差不齐，缺乏规 范化的质量控制等缺陷。因此单一依赖细胞学检查容易造成假阴性，漏检率高。HPV-DNA检 测能够显著提高灵敏度，但往往可能检出一过性HPV感染，而不是具有致病性高危型HPV持 续感染。因此单一依靠 HPV筛查，会造成过度诊断和过度治疗。
[0004] DNA甲基化是一个重要的表观遗传学机制。DNA甲基化，即未甲基化胞嘧啶-磷 酸-鸟噪呤（Cytosine-phosphate-Guanosine, CpG)二核苷酸发生甲基化，是肿瘤抑制基因 失活的关键机制之一。肿瘤抑制基因 （Tumor Suppressor Genes，TSG)发生丢失、突变、甲 基化等变化导致正常功能丧失时，细胞的增殖失控形成恶性肿瘤。现已明确DNA甲基化是 TSG失活的三种机制之一，且在某些情况下可能是唯一的机制。因而DNA甲基化在癌症发生 发展中发挥重要作用。作为癌症发生的早期事件，DNA异常甲基化检测可以在患者出现临 床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为癌症早期诊断提供新的途径。
[0005] 国内外研究者利用肿瘤抑制基因甲基化检测，已经在宫颈癌早期筛查的研究中取 得了令人振奋的进步，但是同一基因在不同研究之间存在较大差异，分析其原因可能为：1、 基因甲基化位点的特异性；2、基因遗传背景的差异性；3、操作方法和实验试剂的异质性。 因此，本领域急需进一步发现更有效更稳定更易应用于临床的宫颈癌特异性的甲基化早期 筛查的生物标记物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于宫颈液基细胞学与DNA甲基 化筛查早期宫颈癌的试剂盒。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种基于宫颈液基细胞学与DNA甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒，包括基细胞学 检测的试剂，基因 JAM3-M4甲基化检测的试剂，所述基因 JAM3-M4的序列如SEQ ID No. 1所 不。
[0009] 所述基细胞学检测的试剂包括橙黄-G6、亮绿液、俾士麦棕液、伊红Y液。
[0010] 所述基因 JAM3-M4甲基化检测包括QlAamp DNA Mini Kit试剂盒和QIAamp EpiTect Bisulfite Kits 试剂盒。
[0011] 上述的试剂盒，还包括扩增基因 JAM3-M4的正向引物序列如SEQ ID No. 6所示，反 向引物序列如SEQ ID No. 7所示。
[0012] 上述的试剂盒，还包括所扩增β-actin的正向引物序列如SEQ ID No. 16所示，反 向引物序列如SEQ ID No. 17所示。
[0013] 上述的试剂盒，还包括还包括饱和碳酸锂水溶液。
[0014] 上述的试剂盒，还包括ddH20。
[0015] 上述的试剂盒，还包括体积分数分别为70%、80%、95%的酒精。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本申请的发明人经过检索和查阅大量文献以及对The Cancer Genome Atlas(TCGA)平台的数据分析，优选出数个候选基因的多个位点，其中有多个为从未报道过 的位点。通过测定、验证和分析，首次发现JAM3基因的M4位点的甲基化程度与宫颈病变有 关，可作为宫颈癌早期筛查的分子标记。
[0018] 本发明用于宫颈癌早期筛查的试剂盒，检测灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预 测值经临床组织样本的初步以及大量的宫颈脱落细胞学的进一步验证，达到临床诊断的要 求。
[0019] JAM3-M4对于分流高危型HPV阳性的患者以及细胞学筛查结果为AS⑶S (特别是小 于30岁的患者）及LSIL患者临床效能高，在分流临床上尚存争议的CIN2方面也有一定的 提不意义。
[0020] 本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物专一性强，采用本发明的引物进 行扩增时，扩增条件易于摸索，方便进行特异性扩增，优于其他引物。
[0021] JAM3-M4, CADM1-M2, CADM1-M8, DAPK1-M2 或 DAPK1-M3,核苷酸序列分别为：
[0022] JAM3-M4:CGCAGCCAGGGCTGGGACTCGGGCCTGGCTAGGGCGGGGGCCCTGGGACGCCCGGCAGT TGGACCGGGGCGGGGAGCTAATTTGGGATGGGGGGCCCGTCCCAGGCAGTGAGTCGGTCCCGGACAGCCGTCGGA CCCC (SEQ ID NO. 1),
[0023] CADMl-M2:GTCCTCCGCCACTTGTTGCTCCCGGGTCCTGCAGCTCTGGAGCTGCAAGGAGGGGCTTTG CAGGCTCAGAGCCCTGCTGCATCCCCTCCTGCATCGCCGCTCGCACCCCGCGGCCCC(SEQ ID NO. 2)，
[0024] CADMl-M8:GCCGCCGCACACTGGGATCCGCTCGGCAGCACTACACTCGCCATGTCGGGCACCTGCCTC AGACTGGCGGCGTTGGCTGCCTCCGGAGCCCGAGCGGACAGCTAATGAGA(SEQ ID NO. 3)，
[0025] DAPKI-M2:CGCTTGCAGGGTCCCCATTGGCCGCCTGCCGGCCGCCCTCCGCCCAAAAGGCGGCAAG GAGCCGAGAGGCTGCTTCGGAGTGTGAGGAGGACAGCCGGACCGAGCCAACGCCGGGGACTTTGTTCCCTCCGCG GAGGGGACTCGGCAACTCGCAGCGGCAG
[0026] (SEQ ID NO. 4)，
[0027] DAPKI-M3:GTCCCCATTGGCCGCCTGCCGGCCGCCCTCCGCCCAAAAGGCGGCAAGGAGCCGAGAGGC TGCTTCGGAGTGTGAGGAGGACAGCCGGACCGAGCCAACGCC(SEQ ID NO. 5)〇
[0028] DNA 甲基化及甲基化特异性 PCR(Methylation specific PCR，MSP)的原理：DNA 甲基化即未甲基化胞啼啶-磷酸-鸟噪呤（Cytosine-phosphate-Guanosine, CpG)二核苷 酸发生甲基化，是最常见的一种表观遗传学修饰，主要发生位点是CpG岛。CpG位点在基因 组中出现的频率远低于基因组中其它双核苷酸序列，但在某些区域CpG位点密度很高，可 达均值的5倍以上，形成富含鸟嘌呤和胞嘧啶的CpG岛，CpG岛常位于基因的启动子区和 第1外显子区，长约lkb。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG 岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当 肿瘤发生时，抑癌基因 CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点 呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。甲基化特异性PCR PCR(Methylation specific PCR，MSP)是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现 最低约50pgDNA的甲基化，其基本原理为：单链DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，所有未甲基化 的胞啼啶（cytosine，C)脱氨转变为尿啼啶（uracil，U)，而CpG位点中甲基化的胞啼啶保 持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基 化（Methylation，M)与非甲基化（Unmethylation，U)DNA序列区分开来。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 本申请的发明人经过检索和查阅大量文献以及对The Cancer Gen