一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种定量PCR方法，尤其是一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定 量PCR方法。
【背景技术】
[0002] 实时焚光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是当今世界用于临床的最先进 核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反 应进行检测分析的技术。qPCR技术与常规PCR技术区别在于：常规的PCR操作繁琐，特异性 差，PCR结束后还需琼脂糖凝胶电泳检测；而qPCR是反应过程中检测，无需后期电泳，因此 qPCR具有操作简便、检测时间短、不易被污染、特异性高、重复性好、灵敏度高、分辨率高、检 测范围广、定量精确、自动化程度高等优点。qPCR现在已经应用到临床疾病诊断、动物疾病 诊断、食品安全、科学研究等领域。
[0003] qPCR的定量原理中的几个重要参数：基线（baseline)，阈值（threshold)和Ct值 (Ct value)。一般来讲，前15个循环信号作为荧光本底信号，即样本的荧光背景值和阴性 对照的荧光值，就是基线。荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍。Ct值就是扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的PCR循环次数，所以是一 个没有单位的参数。由于在PCR扩增的指数时期，DNA模板的Ct值和该模板的起始拷贝数 存在线性关系（线性方程为Ct = -KlogNfB，其中N。是模板起始拷贝数），所以成为定量的 依据。
[0004] qPCR有染料法和探针法2种。染料法便宜、使用方便、通用性好，检测灵敏度高。 探针法虽然特异性高，重复性好，但其费用昂贵，本底较高，检测结果很难判定实际的扩增 特性。
[0005] 目前用于 qPCR 的荧光染料有 SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM，最为常 见的是 SYBR Green L·
[0006] EvaGreen是分子探针公司核心研发团队独立创办的Biotium公司的明星产品。经 过美国环境安全检测，及艾姆斯检测安全无毒性。它是一种同时适用于实时PCR和高分辨 率溶解曲线（HRM)分析的染料。这种染料通过一种被称为"按要求释放"的全新机制（图 1)，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和 浓度以下进行HRM分析。由于EvaGreen在光谱特性上类似于FAM以及SYBR Green I，因此 这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。与SYBR Green I相比，EvaGreen对PCR的抑制性 更小，更不容易产生非特异性扩增，产生的荧光信号强，安全无毒，更稳定等特点。
[0007] EvaGreen染料的结构信息在例如美国专利US7, 776, 567中有详细描述。
[0008] 以往，荧光定量PCR试剂中的热启动酶往往只有一种，要么是抗体修饰，要么是化 学修饰。抗体修饰的热启动酶起效快，可在反应初期被完全激活，发挥最大活性，但后力不 足；而化学修饰的热启动酶则比较慢热，在高温变性过程中缓慢释放活性，从而保证始终特 异的扩增。
[0009] 双热启动酶结合了两者的优点，它由高端化学修饰HotStar Taq DNA聚合酶和抗 体修饰Anti Taq DNA聚合酶组成。在PCR反应初期，已被完全激活的Anti Taq DNA聚合 酶可以协同被缓慢释放活性的HotStar Taq DNA聚合酶达到最佳酶活状态，保证PCR扩增 的高效性；在后续PCR反应过程中，每经过一轮95°C条件下的变性，即可重新激活一部分 HotStar Taq DNA聚合酶，弥补因热变性所导致的部分酶活损失。HotStar Taq DNA聚合酶 独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。相 对于单一的抗体封闭或者化学修饰的热启动酶，双热启动酶在荧光定量PCR反应全程均能 实现稳定、灵敏和高效的扩增。
[0010] 不管哪种定量方法，只有保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，才能 确保检测灵敏度高，检测结果准确。在qPCR检测过程中经常会碰到非特异性扩增的问题， 非特异性扩增就是扩增出了目的条带以外的条带，出现假阳性和高背景的结果。
[0011] 综上所述，需要一种高效率、高灵敏度、高特异性且价格低廉的定量PCR方法，关 于本发明的定量PCR方法，目前还未见有报道。
【发明内容】
[0012] 本发明提供了 一种含有染料EvaGreen和双热启动酶的定量PCR方法，包括如下步 骤：
[0013] (1)构建PCR反应体系，包括：
[0014] 待测样品；
[0015] 与所述待测样品中待测模板互补的正向引物和反向引物；
[0016] 荧光染料EvaGreen ;及
[0017] 双热启动酶，包括：HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶；
[0018] (2)在所述PCR反应体系中，对所述待测模板进行PCR扩增，以形成双链 DNA-EvaGreen荧光染料复合物；
[0019] (3) PCR扩增过程之中或之后，检测所述PCR反应体系的荧光值，以确定扩增产物 的数量，从而确定所述待测样品中所述待测模板的数量。
[0020] 优选地，所述PCR反应体系中所述焚光染料EvaGreen的工作浓度为1~I. 5mmol/ L，所述双热启动酶中HotStar Taq DNA聚合酶和Anti Taq DNA聚合酶以4比6的浓度比 配比成5U/ μ L，20 μ L反应体系中HotStar Taq DNA聚合酶为0· 4U，Anti Taq DNA聚合酶 为 0.6U。
[0021] 优选地，所述PCR反应体系进一步包括：PCR缓冲液（由IOOmM的Tris-HCL ρΗ8· 3 和500mM的KCL组成），镁离子，由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成的dNTP溶液，PCR促进剂 Tween20及无菌双蒸水。
[0022] 优选地，所述PCR促进剂选自小牛血清白蛋白，Tween20,二硫苏糖醇，二甲基亚风 (DMSO)，甘油，明胶或氯化四甲基铵（TMAC)。
[0023] 优选地，所述检测PCR反应体系的程序包括如下步骤：
[0024] 第一阶段：95°C预变性IOmin ;
[0025] 第二阶段：95°C变性10s，60°C退火及延伸30s，共40cycles ;
[0026] 第三阶段：扩增产物溶解曲线信息采集，为95°C下反应15s，再60°C反应lmin。
[0027] 优选地，所述待测模板包括基因组DNA，质粒，或RT-PCR反应后的cDNA。
[0028] 优选地，检测样本包括动物样品、食物、饲料、药物、体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制 品或水。
[0029] 优选地，所述PCR反应体系中各组分的比例范围为：每20 μ L所述PCR反应体系中 含有 IOxBuffe 2 μ L ;EvaGreenl. 25mM ;双热启动酶 HotStar Taq DNA 聚合酶为 0· 4U，Anti Taq DNA聚合酶为0· 6U ;PCR促进剂IOx Tween202 μ L ;基因组DNA 5~500ng，或者质粒 1~25ng，或者RT-PCR反应后的cDNA 1~2 μ L ;镁离子浓度为L 5~2. Ommol/L，dATP、 dTTP、dGTP和dCTP的浓度各为0. 1~0. 2mmol/L ;正向引物和反向引物各0. 5~1 μΜ。
[0030] 工作原理及过程：使用与待测模板互补的正向引物和反向引物，在含有荧光 染料EvaGreen和双热启动酶的PCR反应体系中，对模板进行PCR扩增，从而形成双链 DNA-EvaGreen焚光染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，通过检测EvaGreen 染料的荧光值，来确定扩增产物的有无和/或数量，从而确定待检测模板的存在与否和/或 数量。
[0031] 检测模板可以是基因组DNA，或者质粒，或者RT-PCR反应后的cDNA。检测样本可 以是动物样品、食物、饲料、药物、体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制品或水。
[0032] 检测试剂包括荧光染料EvaGreen和双热启动酶，EvaGreen能特异性地结合DNA双 链而发出焚光信号，而不结合DNA链的EvaGreen染料分子不会发射任何焚光信号，从而保 证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。在单个试剂中包含两个热启动酶--化学 修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶。两者通过互补缓释 技术构成了独特的酶活自动调节系统，可以在更加宽广的范围内获得更高的扩增效率、灵 敏度、特异性以及广泛的模板适应性。荧光染料EvaGreen的工作浓度为1~I. 5mM，双热 启动酶中化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶以4比 6的比例配比成5U/μ L，工作浓度为0.01~0.1 U/μ L。
[0033] 其他组分还有PCR缓冲液、镁离子、dNTP溶液（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、正 向引物、反向引物、PCR促进剂、无菌双蒸水。
[0034] PCR促进剂有小牛血清白蛋白、TWeen20、二硫苏糖醇、二甲基亚风（DMSO)、甘油、 明胶、氯化四甲基铵（TMAC)。首选小牛血清白蛋白，依次为Tween20、二硫苏糖醇。
[0035] 反应体系以20 μ L计算，基因组5~500ng，或者质粒1~25ng，或者RT-PCR反应 后的cDNA 1~2 μ L ;儀离子浓度为L 5~2. Ommol/L, dNTP为各0· 1~0· 2mmol/L。
[0036] 本发明的有益效果在于：提供高效率、高灵敏度、高特异性且价格低廉的定量PCR 方法，使用荧光染料EvaGreen和双热启动酶，合适的镁离子浓度，能使扩增效率更高，很好 地抑制非特异性扩增，避免假阳性和高背景的结果，溶解曲线能获得单一峰；荧光染料价格 低廉，使用方便，通用性好，特异性强，适用于PCR技术；双酶结合使得扩增效率更高、更稳 定，灵敏度非常高。本发明为分子生物学研究提供了一种新型的定量PCR方法。
[0037] 可用本发明方法检测的模板的生物学样品没有特别限制。应理解，生物学样品是 十分广泛的一个概念，可以是一个或多个细胞，也可以是样本或培养物（包括微生物），甚 至包括合成来源的样本。通常，生物样本可以是动物样品，包括人类样品如体液、固体样品 如骨骼或组织。样品也可以是液态或固态食品或饲料及药物，如乳制品、蔬菜、肉类及肉制 品、水等。样品可以来源于任何家养或野生动物，如有蹄类、熊类、鱼类、兔类、啮齿类等。
[0038] qPCR技术可应用到生命科学研究的各个领域，例如基因差异表达分析、SNP检测、 基因突变检测、等位基因检测、临床诊断、转基因研究、药物开发等。
[0039] 本发明的这些目的，特点，和优点将会在下面的【具体实施方式】，附图，和权利要求 中详细的揭露。
【附图说明】
[0040] 图1为EvaGreen "按要求释放"的全新机制示意图。
[0041] 图2为β -globin模板浓度梯度扩增曲线示意图，显示了该方法的重复性好、灵敏 度高。
[0042] 图3为β -globin模板的量与Ct值呈线性关系示意图，显示了该方法的扩增效率 好、精确度高。
[0043] 图4为双热启动酶和单一热启动酶扩增灵敏度的比较结果示意图。
[0044] 图5A-1为EvaGreen荧光染料测试的溶解曲线图。
[0045] 图5