一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于作物遗传育种和植物组织培养领域，具体设及成熟胚体外继代诱导胚 性愈伤组织的方法。
【背景技术】
[000^ 1.小麦的育种目标
[0003] 小麦(Triticum aestivum)是世界主要粮食作物之一，其产量和品质关系到社会 经济生活。随着人口增加 W及国家经济的发展，需要更多的粮食满足人们的生活需求。但是 水±流失导致农田不断减少W及全球气候变暖使得近几年的粮食产量增长并不明显。据相 关数据分析，分析近几年的全球小麦单产，发现小麦单产不稳定，且增幅较小，小麦的增产 已经成为人们关注的问题之一。
[0004] 面对如此大的挑战，任何可W提高粮食产量的方法都值得去利用。针对粮食作物 品种改良，人们主要采取传统育种和转基因的方式。两者的本质区别是:前者通过去雄杂交 促进亲本基因组的变异，后期W优良性状为指标，利用田间试验，筛选获得所需优良性状的 小麦品种。利用转基因技术引起植物基因定向变异并产生优良性状，相比于传统杂交育种， 转基因技术可打破生殖隔离，进一步扩大植物基因变异的范围。植物组织培养是小麦转基 因技术的关键，传统育种在自然条件下进行，所W周期长、受气候环境影响大。转基因技术 利用组织培养，整个过程可在培养箱和溫室进行，有效避免环境因素的影响。转基因技术主 要包括:基因克隆、目的基因功能鉴定、目的基因插入植物基因组并通过生理鉴定获得品种 改良并具有商业价值的植株。植物基因组插入外源基因的方法有基因枪法和农杆菌转化法 和花粉管通道法等。
[0005] 2.小麦转化方法
[0006] 小麦为异源六倍体植物、基因组大、基因调控困难，同时小麦外植体所诱导的愈伤 组织普遍存在愈伤胚性差、分化率低、转化细胞再生困难等问题，是举世公认的最难转化的 栽培作物。科学家通过各种方法实现对小麦的转化，但目前最主要的小麦转化技术是基因 枪法和农杆菌介导。世界第一株转基因小麦是Vasil在1992年通过基因枪法将gus、bar基因 导入小麦品种化VOIU1997年化eng首次利用农杆菌介导法将GUS和npt Π 转入了小麦。除了 基因枪和农杆菌介导法，花粉管通道法、显微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和电击法等也 受到越来越多的关注。
[0007] 3.小麦愈伤组织诱导：
[000引根据Christy在1987年对小麦组织培养形成愈伤组织分类，可将其分为3类:胚性 愈伤组织化）、非胚性愈伤组织(肥)和可转化成胚性愈伤组织的光滑紧致愈伤（SC) "E型愈 伤颜色呈白色或淡黄色，有光泽，结节状，一触易碎成颗粒状，细胞球形状;肥型愈伤易碎， 颜色呈褐色或者灰色;SC型愈伤主要特征是光滑紧致，而且具有很强的增生能力，可转化为 E型愈伤。成熟胚的E型愈伤主要是从SC型愈伤组织转化而来，小麦幼胚的胚性愈伤组织可 直接从胚诱导出E类愈伤。另外小麦的胚相比于其它组织，SC型愈伤比率更高，运也一方面 说明用小麦胚作为外植体的优势。胚状体可w直接由单个细胞分化成完整植株、生命力旺 盛，大大缩短成苗周期。
[0009] 4.胚性愈伤组织诱导：
[0010] 胚性愈伤组织即植物体细胞胚状体的形成主要通过两个途径:染色体上参与染色 质模型重建基因突变引起与胚发育相关基因的异常的过表达，已分化的细胞通过形成感受 态细胞形式变成脱分化细胞，最终形成胚状体;另一方面，在体外培养条件下，植物细胞与 周围组织经过切割形成生理隔离，同时培养环境中的外在生长因子对植物细胞造成生长压 力，促进细胞内源生长因子的改变，细胞经过植物干细胞的形式间接实现体细胞胚状体生 成。植物转基因技术主要是利用第二种方式获得愈伤组织。
[0011] 从生理角度可W将胚状体的体外诱导分为四个阶段:第一阶段，体外植物激素将 植物组织诱导形成愈伤组织；第二阶段，经过一段时间外源因子作用，愈伤组织形成球形 胚;第Ξ阶段，球形胚转化为鱼雷形胚;第四阶段，鱼雷形胚逐渐发育成熟，最终进人发芽阶 段；
[0012] 5.影响胚性愈伤组织诱导因素：
[0013] 5.1基因型不同品种由于基因型不一样会影响产生胚性愈伤能力，运在小麦、水 稻和玉米等植物的组织培养过程中，均可发现。明凤等在2000年对迂10、7742、7757、新克旱 9和Roblin小麦继代后，统计生成胚性愈伤组织比率，迂10小麦在接种414天后，78%的胚性 愈伤组织生成，而新克旱9愈伤组织已经褐化。2005年高武军等W6种玉米自交系为材料，发 现基因型对玉米胚性愈伤组织生成启着显著影响，GY237的胚性愈伤诱导率达到71.3%，而 农艺性状较好的材料却很难诱导出胚性愈伤。同样，刘书梅等2011年发现釉稻品种龙特普 较梗稻品种日本晴更容易诱导出结构紧密，颜色鲜黄的胚性愈伤组织。
[0014] 5.2外植体类型许雪梅等2009年W红皮云杉未成熟胚的不同部位为材料，研究其 对胚性愈伤组织诱导的影响。结果发现不同部位的外植体对胚性愈伤诱导有很大的影响， 全胚和胚轴上部的诱导率最高分别达81.27%和75.96%。
[0015] 5.3培养基成分培养基不仅为植物细胞体外培养提供营养物质，也为细胞的脱分 化、再分化提供外源诱导因子和压力。植物脱分化时期主要受生长素和细胞分裂素的作用， 所W对于胚性愈伤组织的生成，激素的调节是关键之一。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的是提供一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法。
[0017] 本发明所述的方法，是在诱导培养基(MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2,4-D+ 30g/L薦糖+2.6g/L植物凝胶，P册.8)，25 ± rC，暗培养，10天为继代周期的条件下，继代1-3 次可获得具有较高再生率的胚性愈伤组织。
[0018] 通过对0到15天的愈伤组织进行称重，并绘制扬麦14愈伤组织相关的生长曲线图， 确定愈伤组织在培养到10天，适合更换培养基。W同样的诱导培养基继代1至3次，愈伤组织 的质量不断提高，并且出现再生能力强的胚性愈伤组织。继代超过3次后，愈伤组织的再生 能力明显受到抑制。本发明的目的是提供一种有利于小麦成熟胚长期继代培养的诱导培养 基。
[0019] 小麦成熟胚长期继代获