得的胚性愈伤组织，具有较高的再生能力，是遗传转化的 好材料。为了在不影响愈伤的再生能力的情况下，进一步获得更多胚性愈伤组织并延长胚 性愈伤组织的保存时间，本发明通过正交实验设计筛选出最有利于小麦成熟胚长期继代培 养的诱导培养基。脯氨酸、水解酪蛋白W及2,4-D为影响因素，分别设置3个浓度，共配 置9种不同组合的培养基，切取同样大小的扬麦14成熟胚并分别置于9种培养基，实验重复3 次。继代5次后，每种培养基的所有愈伤组织均分别转移同样的分化培养基上，统计愈伤的 绿点率W及出苗情况。最终W绿点率为标准，分析各个因素的贡献率，W及各因素最佳组 厶 1=1 〇
[0020] 本发明通过正交试验确定的最优培养基，是MS+k脯氨酸700mg/L+酪蛋白水解物 lOOOmg/L+2，4-D 2mg/L+30g/L薦糖+2.6g/L植物凝胶，P册.8。该培养基诱导的愈伤组织在 长期继代的情况下，愈伤组织仍保持淡黄的颜色，而且愈伤组织增长较快;长期继代后，其 它培养基诱导的愈伤组织再生能力受到抑制，均未出苗，而最优培养基的愈伤组织再生率 最高达到6.7%。
[0021] 利用本发明的方法对扬麦14成熟胚诱导继代培养。结果发现继代1-3次胚性愈伤 组织生成率和再生率均保持上升趋势;继代次数超过5次则抑制扬麦14成熟胚胚性愈伤组 织的再生能力。
【附图说明】
[0022] 图1小麦成熟胚诱导愈伤组织生长曲线图。注:横坐标是愈伤组织培养的时间，ii 试点分别选取0、3、6、9、12、15天。纵坐标是单个愈伤组织平均重量
[0023] 图2小麦成熟胚愈伤组织诱导（0至15天)体式显微镜照图。注：图中分别是愈伤组 织在0、3、6、9、12、15天的形态，图片是由体视显微镜拍摄。
【具体实施方式】
[0024] 实施例：
[00剧一.实验材料
[00%]供试品种:保存一年扬麦14的种子(购买于江苏金±地种业有限公司）
[0027]培养基:愈伤组织诱导组成为MS基本培养基(具体成分见表l)、30g/L薦糖、2.6g/L 植物凝胶，2mg/L 2，4-D、500mg酪蛋白水解物(表2)。分化培养基由MS基本培养基、30g/L薦 糖、2.6g/L植物凝胶、0.5mg/L激动素、2mg/L玉米素组成。所有培养基PH均为5.8。
[002引表1.
[0029]
[0030]
[00川二.实验方法
[0032] 1.制作成熟胚愈伤组织生长曲线确定继代周期
[0033] 取实验室上一年保存的扬麦14的种子，挑选巧粒饱满的小麦种子，置于灭完菌干 净的Ξ角瓶。经75%酒精灭菌5min后，用0.1 %升隶浸泡30min，最后用灭菌水冲洗3~5遍。 超净工作台上用解剖刀拨取直径直径1mm大小的幼胚，盾片朝上接种至愈伤诱导培养基上 (MS基本培养基，添加500mg/L酪蛋白水解物W及2mg/L 2，4-D)，诱导培养基每皿接种30个。 (25±irC暗培养，分别在0至15天内，每隔3天取出30个愈伤组织置于干净的吸水纸上，去 除多余愈伤组织表面沾有的培养基，并称取总重求得平均单个愈伤组织重量。每次处理共 重复3次取平均值，作生长曲线图并拍照。
[0034] 2.确定继代次数
[0035] 扬麦14成熟胚材料处理按照2.1进行，每皿放置30个。按照1步骤中确定的继代周 期范围，愈伤组织分别在继代1至5次后，转移置分化培养基，每个Ξ角瓶接种15个愈伤组 织，每个处理重复4次，共60个愈伤组织，25±rC光照培养一个月后统计出苗率。
[0036] s.结果与分析
[0037] 数据处理公式：
[0040] 3.1扬麦14成熟胚愈伤组织生长曲线W及确定最佳继代周期
[0041] 从图1中可W看到0-9天，愈伤组织生长旺盛，9天W后逐步趋于平缓，此时生长缓 慢可能受到培养基激素或者营养物质缺乏影响;0-15内的愈伤组织整体颜色呈现白色偏黄 且结构紧致，如图2所示，所W选择9至15天更换培养基比较合适。（扬麦14成熟胚愈伤生长 图见图2)
[0042] 1.2确定继代次数对小麦成熟胚诱导影响
[0043] 表2小麦愈伤组织继代后出苗统计表(n = 60)
[0044]
[0046]从表2中可W得到：随着继代次数的上升，胚性愈伤组织的比率不断上升。在一定 范围内，本实验培养基诱导的小麦成熟胚胚性愈伤组织随着继代次数的增加，出苗率不断 上升；当继代次数达到4次W上，胚性愈伤组织的出苗率下降；继代5次时，出苗率为0%。继 代实验的结果说明：扬麦14在本实验室诱导培养基上继代培养可W促进胚性愈伤组织的生 成;但是继代4次W上后，胚性愈伤组织的再生率明显被抑制。
【主权项】
1. 一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：以扬麦14成熟胚为材料， 在诱导培养基中，25±1°C，暗培养，10天为继代周期的条件下，继代1-3次获得具有较高再 生率的胚性愈伤组织;所述诱导培养基的组成为:MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L 2，4-D+ 30g/L蔗糖+2 · 6g/L植物凝胶;培养基PH5 · 8。
【专利摘要】本发明涉及一种扬麦14成熟胚的胚性愈伤组织培养方法，该方法以扬麦14成熟胚为材料，在诱导培养基中，25±1℃，暗培养，10天为继代周期的条件下，继代1-3次获得具有较高再生率的胚性愈伤组织。本发明以扬麦14成熟胚为实验对象，诱导培养基(MS+500mg/L酪蛋白水解物+2mg/L？2，4-D+30g/L蔗糖+2.6g/L植物凝胶，PH5.8)为培养条件，25±1℃，10天为继代周期，对扬麦14成熟胚诱导继代培养。结果发现继代1-3次胚性愈伤组织生成率和再生率均保持上升趋势；继代次数超过5次则抑制扬麦14成熟胚胚性愈伤组织的再生能力。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105594598
【申请号】CN201610188353
【发明人】陈建民, 刘慧君, 高勇, 刘霜, 居鹏, 王雨竹, 张冬平
【申请人】扬州大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月29日