一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于神经再生生物学领域，具体涉及一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]神经系统损伤主要包括脊髓损伤、脑损伤、周围神经损伤，后果严重，其治疗一直是研究热点。神经系统损伤发病率随着经济及交通的发展逐年增高，已经越来越引起临床医生及科研学者的重视。
[0003]神经系统一旦发生病变，恢复程度有限，治疗效果欠佳，长久以来，神经系统疾病在经过传统的治疗后，仍有一部分仍留有严重的后遗症，因此，选择一种外源性的物质替代已经彻底损伤的组织，促使残存的神经组织再生，成为攻克神经系统疾病的主要思路。
[0004]伴随着生物组织工程的发展，组织工程在神经损伤治疗中具有重要的地位。胶原材料来源丰富并且具有诸多优点，比如，较好的可降解性、生物相容性、其低免疫性及可修饰性，而被广泛应用于组织工程。研究表明，胶原蛋白可以促进神经元的分化;体外实验研究显示，胶原蛋白可以促使背根神经节的轴突再生，因此，胶原可作为营养因子或者药物的载体，从而在组织工程中起到协同的应用效果，被广泛应用在神经再生工程中。
[0005]现有技术中生产胶原材料时，通常胶原组织需要溶解于醋酸中，若需要得到固态胶原材料，通常需要碱性溶液将醋酸中和，而中和后生成的盐分混杂在溶液中，因而需要进一步通过透析除去其中盐分，因此，目前使用的胶原材料生产方法复杂，成本较高。
[0006]然而，单纯使用载体材料不能有效修复神经损伤。近些年，研究神经干细胞逐渐成为治疗神经系统疾病的热点，在神经再生工程中，修复损伤的组织时，需要在胶原材料制成的载体上负载起到修复作用的神经干细胞，神经干细胞是具有自我更新能力与多向分化潜能的一类细胞，具有可塑性能，它可完成特定的神经功能，分化成体内特定神经功能的细胞，具有定向分化潜力。神经干细胞移植术是将体外培养和诱导分化的神经干细胞，通过手术方式移植到颅内某部位达到修复、重建神经功能的过程。在体外培养的神经干细胞进入体内后分化、增殖和定向迀移，并与人体自身的神经细胞整合，最终达到修复受损的神经，重建部分或者完全的神经功能。
[0007]在神经再生工程中，移植入宿主体内的神经干细胞能向神经系统所在病变部位趋化、游走并且聚集，能够生存、增殖分化为神经元和神经胶质细胞，从而促进患者缺失功能的恢复，然而，前期的研究显示，神经干细胞在异体移植后由于免疫反应等，存活率很低，因此，神经干细胞的利用率较低。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方法及应用，取材方便，制备方法简单，可以获得根据不同需要塑造成不同形状的神经支架，提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强细胞对神经损伤的修复作用，将该神经支架用于填补神经组织缺损及桥接神经断端，引导神经生长，从而促进神经损伤修复及功能恢复，并且具有良好的稳固性。
[0009]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下:
[0010]—种用于神经损伤修复的神经支架，包括胶原支架、培养在胶原支架上的神经干细胞、以及由肝素固定在胶原支架上的生长因子，所述的生长因子具有肝素结合域。
[0011]本发明所述用于神经损伤修复的神经支架的制备方法，包括如下步骤:
[0012]I)配制胶原溶液
[0013]获取动物胶原组织，将其溶解于0.05?0.1 %冰醋酸-PBS(v/v)中，配制成胶原溶液；
[0014]2)冻干、灭菌
[0015]将胶原溶液倒入模具中，再将模具放入液氮冷冻，然后用冻干机冻干，冻干时间为8?12小时，得到胶原海绵，再进行灭菌处理;所述的胶原海绵为三维胶原材料，孔径为30?200μηι；
[0016]3)交联、洗涤
[0017]将肝素溶解于交联溶液中，将灭菌的胶原海绵浸没于含肝素的交联溶液中进行交联，交联温度30?40°C，交联时间3?4小时，交联结束后用磷酸缓冲盐溶液洗涤4?8小时，再用去离子水洗涤4?8小时；
[0018]其中，所述的交联溶液为浓度为I?25mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和I?12.5mM的N-羟基丁二酰亚胺的混合溶液；
[0019]4)成型
[0020]将交联后的胶原海绵吸去水分，浸没于生长因子溶液中成型，成型温度30?40°C，成型时间0.5?2小时，获得胶原支架;其中，所述的生长因子具有肝素结合域；
[0021]5)培养神经干细胞
[0022]将神经干细胞原代培养在步骤4)得到的胶原支架上，获得所述的神经支架。
[0023]进一步，步骤I)中获得的胶原溶液中胶原的浓度为5?20mg/ml。
[0024]优选地，步骤2)中利用电子束辐照对胶原海绵进行灭菌处理，处理条件为6?12kGy 60Coo
[0025]进一步，步骤3)中含肝素的交联溶液中，肝素的浓度为2?4mg/mL。
[0026]又进一步，步骤4)所述的生长因子溶液中生长因子的浓度为50?500yg/mL。
[0027]优选地，步骤4)中所述的生长因子为碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子。
[0028]进一步，步骤5)中将神经干细胞经Hoechst标记后，再培养在胶原支架上，神经干细胞的个数为5?1X 15个，所获得的神经支架为神经导管或圆形、椭圆形、方形或不规则海绵状神经支架。
[0029]本发明的0.05?0.1 %冰醋酸_PBS( v/v)是指在PBS(磷酸缓冲盐溶液)中含有体积分数为0.05?0.1 %的冰醋酸。
[0030]本发明的神经支架应用于神经损伤修复，特别是用于修复脊髓损伤或修复面神经损伤，除适用于神经损伤修复外，也可用于修复周围神经损伤及其他组织损伤。
[0031]本发明制备的胶原海绵为三维胶原材料，可调节其孔径在30?200μπι，以用于细胞生长和组织修复，并且可以通过模具塑造为不同的形状以适于不同的神经损伤修复。
[0032]本发明使用生长因子与神经干细胞共同促进神经再生，提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强了神经干细胞对神经损伤的修复作用，并且，生长因子自身能促进神经损伤修复。
[0033]本发明的神经支架中，将肝素交联在胶原海绵上，并通过肝素对具有肝素结合域的生长因子的高亲和力，将生长因子固定在胶原海绵上，以控制生长因子的释放速度，防止生长因子扩散，避免生长因子因体液冲刷后大量扩散而造成的流失，同时，固定在胶原海绵上的生长因子一方面自身能更有效的促进神经损伤修复，另一方面能给神经干细胞提供营养或促进神经干细胞增殖，提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强了神经干细胞对神经损伤的修复作用，与神经干细胞共同促进神经损伤修复。
[0034]本发明的神经支架中，生长因子通过肝素固定后不易扩散，因此能减少因扩散带来的副作用，固定的生长因子自身能在治疗局部形成有效浓度，能促进神经损伤修复。
[0035]当生长因子为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)时，bFGF在胚胎发育过程中能促进中胚层和神经内胚层细胞的大量增殖，而且在不同的增殖和分化过程中起着调节作用。将碱性成纤维细胞生长因子加在神经横断伤的近端能够防止损伤后背根神经节中感觉神经元的死亡。除此之外，在损伤的部位，碱性成纤维细胞生长因子能够促进轴突再生和血管再生，促进再生的神经纤维通过神经缺损的近远端。碱性成纤维细胞生长因子被广泛应用于神经修复，神经干细胞直接用于周围神经损伤处能分化为施万细胞状的细胞，能够分泌神经营养因子，促进神经再生，本发明将bFGF通过肝素固定在神经支架中，控制其释放速度。
[0036]除此之外，固定的bFGF能促进神经干细胞增殖和维持神经干细胞活性，而神经干细胞也能有效地促进神经损伤修复，因此，在本发明神经支架中固定的bFGF和神经干细胞能起到协同作用，促进神经干细胞增殖，提高神经干细胞在损伤局部的数量，增强神经干细胞对神经损伤的修复作用，共同促进神经损伤后的修复，因此，本发明含bFGF和神经干细胞的神经支架能有效促进神经再生和功能恢复。
[0037]本发明通过使用冻干机将溶于醋酸的胶原溶液直接冻干，得到胶原海绵，其为生长因子和神经干细胞的载体，采用冻干后对其进行交