联的方法，避免了酸碱中和、透析等复杂过程，并可通过不同的胶原浓度调整胶原海绵的孔径，交联时，交联剂通过催化分子内的羧基和氨基反应进行交联，又称为“零长度交联剂”，交联后提高了胶原纤维的张力和稳定性，交联剂为卜(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，EDC/NHS。
[0038]与现有技术相比，本发明的有益效果:
[0039]I)本发明的神经支架，原料取材方便，制备过程简单，通过利用肝素将生长因子进行固定，控制生长因子的释放速度，防止生长因子在体液的冲击下扩散，从而将生长因子固定在损伤局部，在损伤局部达到治疗浓度，同时，固定的生长因子能有效促进神经支架中神经干细胞的存活，或者促进神经干细胞增殖，使损伤局部神经干细胞达到更有效的治疗数量，增强了神经干细胞对神经损伤的修复作用，支架中的神经干细胞和生长因子共同促进神经再生，从而使得神经损伤修复效果较常规方法更加显著。
[0040]2)本发明的制备方法中，使用鼠尾制备胶原溶液取材方便，将获得的胶原溶液用冻干机直接冻干，制作过程简单，省去了将胶原经酸碱中和，透析等复杂处理的步骤，减少了胶原材料接触有害试剂的机会，因此其使用安全性大大提高。
[0041]3)本发明使用Hoechst将神经干细胞进行标记，能追踪神经干细胞量在体内的变化情况。
【附图说明】
[0042]图1为本发明实施例1的胶原海绵形态图。
[0043]图2为本发明实施例2的神经导管。
[0044]图3为本发明实施例2中通过CCK-8检测细胞增殖与活性比较图。
[0045]图4为本发明实施例3中通过CCK-8检测细胞增殖与活性比较图。
[0046]图5为本发明实施例4中通过CCK-8检测细胞增殖与活性比较图。
[0047]图6为本发明实施例5中面神经损伤后功能恢复比较图。
【具体实施方式】
[0048]以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，本
【发明内容】
并不限于所列实施例，研究人员根据上述内容对该神经支架进行的非本质改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0049]SD大鼠购自复旦大学实验动物部，动物心脏灌注用多聚甲醛购自boster工程有限公司，去离子水购自invitrogen，冰醋酸购自国药集团化学试剂有限公司，PBS购自hyclone，EDC和NHS购自 sigma;bFGF和VEGF购自 peprotech;Hoechst购自 sigma。
[0050]实施例1
[0051]I)购买180?220g的大鼠，将大鼠通过心脏灌注处死，剪下鼠尾，抽取鼠尾中的银色尾腱放入去离子水，放于摇床上，温度40C，转速50?200rpm，反复洗涤5次，洗涤后的尾腱溶于0.05%?0.1 %冰醋酸-PBS中，温度4°C，静置2?5天，调整胶原浓度至10mg/ml。
[0052]2)取上层胶原溶液，放入模具中，将模具放入液氮冷冻，再放于2.5L&6L冻干机经8?12小时冻干，得到胶原海绵，为三维胶原材料，孔径为30?200μπι，该胶原海绵形态参见图1o
[0053]3)利用电子束辐照对胶原海绵进行灭菌处理，处理条件为:12kGy6()C0。
[0054]4)将肝素溶解于含有4mM EDC和2.5mM NHS的交联溶液中，肝素的浓度为4mg/mL，将胶原海绵浸没于交联溶液中，于37°C下放置3?4小时，最后用PBS洗涤4?8小时，去离子水洗涤4?8小时。
[0055]5)用滤纸吸去交联后胶原海绵中的水分，将胶原支架浸没于450yg/mL的血管内皮生长因子(VEGF)溶液中构建胶原支架，37°C，I小时，获得胶原支架。
[0056]6)原代培养神经干细胞
[0057]取孕19天左右孕鼠，在超净台内端头处死，取出端脑，使用弯剪将端脑剪碎，加入
0.05%的胰酶消化30分钟，使用胰酶抑制剂终止消化，将消化后的混合液通过200目滤网，收集滤过液后，转速ISOOrpm，离心5分钟，去掉上清，加入培养液培养，得到神经球后用
0.05%胰酶将神经球消化开得到分散的神经干细胞，将神经干细胞与Hoechst在37°C培养箱孵育10分钟，以将神经干细胞进行标记，将5?10 X 15个神经干细胞培养在胶原支架上，获得所述的神经支架。
[0058]实施例2
[0059]1.用于神经损伤修复放入的神经导管的制备方法，包括如下步骤:
[0060]I)购买180?220g的大鼠，将大鼠通过心脏灌注处死，剪下鼠尾，抽取鼠尾中的银色尾腱放入去离子水，放于摇床上，温度40C，转速50?200rpm，反复洗涤5次，洗涤后的尾腱溶于0.05%?0.1 %冰醋酸-PBS中，温度4°C，静置2?5天，调整胶原浓度至10mg/ml。
[0061]2)取上层胶原溶液，放入管状模具中，将模具放入液氮冷冻，再放于2.5L&6L冻干机经8?12小时冻干，得到中空管状的胶原海绵，即胶原管。
[0062]胶原海绵为生长因子和神经干细胞的载体，因此，可在所获得的胶原管的中空部分填充一些胶原海绵，以粘附更多的神经干细胞。
[0063]3)利用电子束辐照对胶原管进行灭菌处理，处理条件为:6kGy 6<3Co。
[0064]4)将肝素溶解于含有4mM EDC和2.5mM NHS的交联溶液中，肝素的浓度为2mg/mL，将胶原管浸没于该交联溶液中，于37°C下放置3?4小时，最后用PBS洗涤4?8小时，去离子水洗涤4?8小时。
[0065]5)用滤纸吸去交联后胶原管中的水分后将胶原管浸没在50?500yg/mL的bFGF中成型，温度为37°C，时间为I小时，得到胶原支架，即胶原导管。
[0066]6)原代培养神经干细胞
[0067]取孕19天左右孕鼠，在超净台内端头处死，取出端脑，使用弯剪将端脑剪碎，加入
0.05%的胰酶消化30分钟，使用胰酶抑制剂终止消化，将消化后的混合液通过200目滤网，收集滤过液后，转速ISOOrpm离心5分钟，去掉上清，加入培养液培养，得到神经球后用
0.05%胰酶将神经球消化开得到分散的神经干细胞，将神经干细胞与Hoechst在37°C培养箱孵育1分钟，以将神经干细胞进行标记，将5?10 X 15个神经干细胞培养在胶原导管内，获得神经导管，见图2。
[0068]2.通过CCK-8检测细胞增殖与活性。
[0069]设3组神经支架平行实验，第一组为本实施例组，该组的神经支架中，通过肝素将bFGF固定在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称HS-bFGF组)；第二组为对比例组，该组的神经支架中，未使用肝素固定bFGF，而是将bFGF简单孵在胶原支架上，培养有神经干细胞(简称bFGF组)；第三组为对照组，该组的神经支架中，未含肝素和bFGF，仅以I3BS作为阴性对照孵在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称PBS组)。
[0070]将神经干细胞在上述三组的神经支架上培养7天，每天换液，在第7天时通过CCK-8检测神经干细胞的增殖与活性。
[0071 ] 检测步骤如下:
[0072]I)将上述三组样本分别放入多孔板，加入10 % CCK8混合液。
[0073]2)放入37°C培养箱培养2小时。
[0074]3)吸出混合液，测定450nm吸光度。
[0075]结果参见图3，图中**表示P〈0.01，由图3可以看出，神经干细胞的增殖与活性在HS-bFGF组要明显高于bFGF组和PBS组，由于每天换液，bFGF组和PBS组中未固定的bFGF不断被扩散、丢失，不能有效地促进神经干细胞增殖，bFGF组和PBS组神经干细胞增殖与活性较差。
[0076]实施例3
[0077]1.本实施例中用于神经损伤修复放入的神经导管的制备方法与实施例2中神经导管的制备方法的区别在于胶原浓度为20mg/ml，交联溶液中交联剂的浓度为:1mM EDC和5mM NHS，肝素的浓度为4mg/mL，bFGF的浓度为500yg/mL，其余操作步骤同实施例2。
[0078]2.通过CCK-8检测细胞增殖与活性。
[0079]设3组神经支架平行实验，第一组为本实施例组，该组的神经支架中，通过肝素将bFGF固定在胶原支架上，并培养有神经干细胞(简称H