用于催陈和澄清山西老陈醋的共固定化酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及山西老陈醋处理方法，具体涉及到共固定化酶的制备及应用其处理山 西老陈醋催陈及澄清的使用方法。
【背景技术】
[0002] 山西老陈醋的发展已有300多年的历史，与镇江香醋、保宁醋、永春老醋并称为中 国四大名醋，且居四大名醋之首。在GBT 19777-2013中对山西老陈醋定义为："在标准规定 的原产地域保护范围内，以高粱和麸皮为主要原料，稻壳、谷壳作为辅料，并以大麦和豌豆 为原料所制作的大曲为糖化发酵剂。经酒精发酵、醋酸发酵，熏醅、陈酿等工艺所酿造出的 食醋统称为山西老陈醋。"其颜色呈深褐色，香气浓郁、醇厚，入口绵酸、柔和，越陈越香，过 夏不腐，入冬不冻。除了醋酸之外山西老陈醋中还含有乳酸、苹果酸等多种有机酸和糖类、 酯类、氨基酸及维生素等多种营养成分。长期食用可增进食欲、有助于钙的吸收、降低血糖 及血糖浓度、降低血压等。
[0003] 山西老陈醋之所以风味独特，很大原因在于其成分的复杂多样性，目前人们发现 的成分有130余种。除了主要成分醋酸之外，还包括糖分、氨基酸、无机物在内的呈味物质和 酯、醛、醇、酚、酮类等在内的呈香物质，各类物质的含量和相互之间的比例关系奠定了山西 老陈醋的风味的基础。而不同物质之间的相互作用以及在长期自然陈酿过程中受光照、温 度、空气的影响而发生的缓慢变化更是对老陈醋最后品质的形成起到很大影响。自然陈酿 是一个缓慢复杂的化学过程和物理过程，包括酯化反应、美拉德反应、氧化反应、缩合反应、 缔合反应以及低沸点物质的挥发。山西老陈醋运用"夏伏晒，冬捞冰"的方式自然陈酿，传统 工艺催陈老熟的陈酿期在十个月到一年，陈酿周期长导致库房占用面积大、贮存设备投资 大、资金周转慢等问题。
[0004] 发酵过程结束后的山西老陈醋醋液往往存在浑浊沉淀现象，使得陈醋的品质下 降。其主要形成因素为生物性和非生物性因素两类。生物性因素主要由于生产环境的杂菌 污染，以及热处理不彻底而造成的一些耐热芽孢杆菌、酵母菌和耐酸菌继续繁殖。非生物因 素主要是酿造过程中糖化发酵不完全，酿醋原辅料中的淀粉、蛋白质、脂肪、果胶等大分子 物质未完全降解或利用，铁离子氧化蛋白、单宁后生成的不溶性络合物等因素而引起的。这 些浑浊沉淀会影响山西老陈醋的外观、品质以及保质期。
[0005]游离酶在实际应用时有较多的缺陷，如稳定性差，蛋白质的化学本质决定了其催 化性能主要取决于酶蛋白的三维空间结构，因此酶活性易受外界因素影响引发酶蛋白变性 等;大多数酶都溶于水，与底物进行酶解反应后，存在于同一反应体系中，很难分离回收，限 制了其进一步的发展。因此，游离酶技术发展到一定程度后就提出了固定化酶的概念，以克 服游离酶应用的局限。
【发明内容】
[0006]本发明目的是针对山西老陈醋存在的自然陈酿周期长以及醋液浑浊现象，提供一 种用于催陈和澄清山西老陈醋的共固定化酶的制备及使用方法，该共固定化酶具有增加山 西老陈醋香味及独特风味和提高醋液澄清度的作用。
[0007] 本发明用于催陈和澄清山西老陈醋的共固定化酶的制备方法，其步骤如下： (1) 制备酯化酶酶液称取一定质量的酯化酶酶粉，用酯化酶质量4-5倍、pH 3.6的乙 酸-乙酸钠缓冲液将其溶解，将所得上清液倒入容量瓶，将剩余沉渣中再添入pH 3.6的乙 酸-乙酸钠缓冲液捣研多次，直至全部溶解后将其移入容量瓶中，再用缓冲液稀释到容量瓶 刻度，摇匀后多层纱布过滤，制备成浓度为3.5%的酯化酶酶液，备用； (2) 制备糖化酶酶液称取一定质量的糖化酶酶粉，用糖化酶质量4-5倍、pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲液将其溶解，将所得上清液倒入容量瓶，将剩余沉渣中再添入pH 4.6乙酸-乙酸 钠缓冲液捣研多次，直至全部溶解后将其移入容量瓶中，再用缓冲液稀释到容量瓶刻度，摇 匀后多层纱布过滤，制备浓度为5%的糖化酶酶液，备用； (3) 称取一定质量的载体材料，用载体材料质量55-60倍的50-60 °C水溶解，然后在常 温下加入载体材料质量体积比为100:7的（1)制备的酯化酶液，充分搅拌均匀后静置，待气 泡完全消失后，在4-5 °C条件下，缓慢滴入2%的氯化钙水溶液中，固化1 h后生成颗粒物，然 后在常温下用两层纱布滤出颗粒物，用pH 3.6的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗颗粒物3~5次，除 去表面的氯化钙，吸干表面的水分，制成直径2.0-2.3 mm的颗粒状固定化酶，备用； (4) 称取(3)制备的一定量固定化酶，按固定化酶与(2)制备的糖化酶液质量体积比为 1:1、将固定化酶放入糖化酶液中吸附6-7 h，然后用纱布滤出颗粒，再用pH 4.6乙酸-乙酸 钠缓冲液冲洗颗粒3~5次，除去表面酶液，吸干表面水分，制得共固定化酶。
[0008] 所述的载体材料是用海藻酸钠与黄原胶质量比为5:1配制而成。
[0009] 本发明的共固定化酶的使用方法是:将山西老陈醋质量〇.8%-1.2%的共固化酶放 入陈醋中，在40-45 °C条件下用超声波振荡24-26h，然后过滤，去除共固定化酶。
[0010]本发明共固定化酶的特点 1、共固定化酶的最适作用温度 酶的最适温度与它的反应条件有关。如表1所示，山西老陈醋中经固定后的酶最适温度 分别与游离酶相同。当催化温度升高时，酶活力会随之增加，但是温度的不断升高亦会使酶 蛋白逐渐变性，导致酶活力下降。糖化酶最适温度为45 °C，酯化酶最适温度为40 °C。
[0011] 2、共固定化酶的热稳定性 由表2可知，游离酶和固定化酶的相对活力在不同的温度下具有差异性，当温度在30~ 35 °C时，其相对活力基本相当；大于35 °C时，固定化酶的相对酶活相对较高，固定化酶的 高温稳定性开始凸显，说明固定化酶的热稳定性优于游离酶。
[0012] 3、共固定化酶的米氏常数 分别以乙酸乙酯和可溶性淀粉为底物，考察了酯化酶、糖化酶和共固定化酶的米氏常 数，采用双倒数作图法计算其米氏常数Km值。实验结果如表3、4所示，经计算可得酯化酶Km= 6.74X10-2mL/100 mL，共固定化酯化酶Km=8.82X10-2 mL /100 mL;糖化酶Km=3.63X10-2 g/100 mL，共固定化糖化酶Km=2.16Xl(T2 g/100 mL。说明经共固定化处理后的酯化酶对底 物的亲和力有些许降低，而糖化酶对底物的亲和力有所提高。
[0013]
4、共固定化酶的操作稳定性 由表5可知，随着反应批次的增加共固定化酶酶活力有所降低，固定化糖化酶在反应4 次后酶活力降到原活力的50%，固定化酯化酶在反应5次后降到原活力50%。证明共固定化酶 可进行反复使用，具有操作稳定性。
[0014] 本发明的有益效果 (1)本发明通过对酶进行共固定化处理最大限度地保持了游离酶的活力，提高酶的酶 学性质。试验证明，共固定化处理后酯化酶与糖化酶的最适反应温度均与游离酶相同，两酶 的热稳定性优于游离酶，糖化酶对底物的亲和力有所提高;共固定化酶可反复操作5次相比 游离酶只能操作一次，其操作稳定性有明显提高，同时可减少反应时间和步骤，节约成本， 便于连续生产，克服了游离酶稳定性差、易失活、不能重复使用、并且与产品反应后混入产 品、难以在工业中更为广泛的应用的缺陷。与普通的固定化酶相比，共固定化酶的优势在于 可以充分发挥各酶的特点，将其催化特性相结合，充分利用协同作用，提高催化效率。
[0015] (2)采用本发明共固定化酶处理后醋液中总酯含量提高了五个百分点以上，数量 也由原先的10种增加到了 13种;杂环类化合物的总量提高了五个百分点以上，香气成分总 量提高了六个百分点以上，醋液透光率提高了三个百分点以上。
【附图说明】
[0016] 图1为处理前醋液香气成分总离子流色谱图。
[0017] 图2为用本发明的共固定化酶处理后醋液香气成分总离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 用本发明方法制备共固定化酶，包括如下步骤： (1) 制备pH 3.6的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲液、2%的氯化钙水溶 液； (2) 制备载体材料用海藻酸钠与黄原胶质量比为5:1配制成载体材料； (3) 制备酯化酶酶液准确称取一定质量的酯化酶酶粉，用酯化酶质量4倍、pH 3.6的 乙酸-乙酸钠缓冲液将其溶解，将所得上清液倒入容量瓶，将剩余沉渣中再添入pH 3.6的乙 酸-乙酸钠缓冲液捣研多次，直至全部溶解后将其移入容量瓶中，再用缓冲液稀释到容量瓶 刻度，摇匀后多层纱布过滤，制备成浓度为3.5%的酯化酶酶液，备用； (4) 制备糖化酶酶液准确称取一定质量的糖化酶酶粉，用糖化酶质量4倍、pH 4.6乙 酸-乙酸钠缓冲液将其溶解，将所得上清液倒入容量瓶，将剩余沉渣中再添入pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲液捣研多次，直至全部溶解后将其移入容量瓶中，再用缓冲液稀释到容量瓶